牡丹種間遠(yuǎn)緣雜交不親和的細(xì)胞學(xué)與生理機(jī)制研究

張翔宇，賈文慶，何松林，邱永杰，王喬健，胡 緩，史來(lái)琨，劉會(huì)超

（河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

遠(yuǎn)緣雜交是新優(yōu)種質(zhì)培育的主要途徑，野生種質(zhì)與栽培種進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交在改良栽培品種以及培育新異種質(zhì)中起著重要作用[1-3]，如我國(guó)小麥育種專家李振聲團(tuán)隊(duì)利用小麥（Triticum aestivum L.）與長(zhǎng)穗偃麥草（Elytrigia elongata （Host） Nevski）雜交培育出抗病性強(qiáng)的‘小偃6號(hào)’等系列遠(yuǎn)緣雜交小麥品種，成功解決抗“小麥癌癥”條銹病的世界育種難題[4]，Moshe Feldman和Emest R.Sears也曾提出“未來(lái)的谷物改良寄希望于野生基因資源的利用”[5]。牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）為世界著名花卉，也是中國(guó)的一張名片，在中國(guó)影響之深遠(yuǎn)是其他花卉所不可企及的；但牡丹現(xiàn)有栽培品種中純正花色少，黃色、橙色花缺乏，株型較低，大多對(duì)白粉病易感。長(zhǎng)期以來(lái)，由于牡丹遠(yuǎn)緣雜交不親和或親和性差，牡丹育種多集中在品種群內(nèi)進(jìn)行常規(guī)雜交，遺傳基礎(chǔ)狹窄和多樣性親本資源的缺乏成為了限制牡丹育種取得突破的瓶頸。

栽培品種中，由楊山牡丹（P.ostii T.Hong et J.X.Zhang sp.nov.）演化出的‘鳳丹’（P.ostii‘Feng Dan’）植株高大、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、花量大，生態(tài)適應(yīng)性極廣泛，是雜交育種最常用的親本[6-7]；牡丹野生種保康牡丹（Paeonia baokangensis Z.L.Dai et T.Hong sp.Nov.）[8]，花桃紅，色澤純正、明亮，花期長(zhǎng)，抗白粉病，是亟待開(kāi)發(fā)的優(yōu)良野生資源之一。解析牡丹‘鳳丹’與?？的档みh(yuǎn)緣雜交的不親和性機(jī)制，對(duì)于克服受精障礙，完善牡丹遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)體系，培育花色純正、抗白粉病的牡丹新品種具有重要意義。

植物遠(yuǎn)緣雜交研究發(fā)現(xiàn)，花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)情況、內(nèi)源激素水平、保護(hù)酶活性及可溶性蛋白含量等是遠(yuǎn)緣雜交親和性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。郭朋輝等[9]在紫斑百合（Lilium nepalense D.Don）遠(yuǎn)緣雜交親和性研究中發(fā)現(xiàn)，紫斑百合遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中多出現(xiàn)受精前障礙，胼胝質(zhì)沉積，花粉管扭曲纏繞，阻礙伸長(zhǎng)生長(zhǎng)是其受精前障礙的主要表現(xiàn)；王保成等[10]在蕓芥（Eruca sativa Mill）親和性研究中發(fā)現(xiàn)，SOD、POD及CAT三種保護(hù)酶的活性變化與自交親和基因的調(diào)控相關(guān)；楊曉玲等[11]在百合（Lilium brownie F.）親和性研究中發(fā)現(xiàn)，高水平的IAA、GA3、ZR對(duì)花粉在柱頭的識(shí)別黏附及萌發(fā)有促進(jìn)作用；Kovaleva L等[12]表明，ABA含量較高是導(dǎo)致矮牽牛（Petunia hybrida L.）授粉不親和的原因；牡丹與芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）雜交后也顯示相關(guān)保護(hù)酶活性及內(nèi)源激素含量與授粉親和性相關(guān)[13]。目前，有關(guān)牡丹種間雜交不親和機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，基于此，本研究以牡丹‘鳳丹’為母本，以野生?？的档楦副具M(jìn)行了種間雜交，探討花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)、雌蕊保護(hù)酶活性、可溶性物質(zhì)及內(nèi)源激素含量變化與遠(yuǎn)緣雜交不親和性的關(guān)系，以期為解析牡丹種間遠(yuǎn)緣雜交不親和性機(jī)制以及完善牡丹遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)體系提供理論及試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

母本‘鳳丹’種植于河南科技學(xué)院牡丹資源圃，父本?？的档げ勺月尻?yáng)國(guó)家牡丹園野生資源圃，二者植株健壯，均可正常開(kāi)花結(jié)實(shí)。于露色期對(duì)母本材料進(jìn)行去雄，掛上標(biāo)簽并做隔離處理，4 d后用準(zhǔn)備好的花粉進(jìn)行人工授粉。

1.2 花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)熒光觀察

分別于授粉后1、3、6、8、12、24、36、48、72、96 h，取雌蕊10～15個(gè)（分別取自不同花朵）迅速放入卡諾固定液中，固定24 h以上轉(zhuǎn)入70%酒精于4 ℃ 冰箱存放，之后用8 mol·L?1NaOH 60 ℃條件下軟化4 h，漂洗后于0.5%苯胺藍(lán)染液避光染色6 h以上，壓片并于熒光顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照（圖1A～I(xiàn)及L×40倍；J及K×100倍）。

圖1 花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)熒光觀察Fig.1 Fluorescence observation of pollens germination and pollen tubes growth

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

取未授粉及授粉后1、3、6、8、12、24、36、48、72、96 h的雌蕊，每處理0.2 g，重復(fù)3次，液氮速凍后于?80 ℃冰箱中保存。分別采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定丙二醛（MDA）含量，考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量，苯酚法測(cè)定可溶性糖含量。

1.4 內(nèi)源激素測(cè)定

取樣同1.3節(jié)，每處理0.3 g。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），參照試劑盒附帶說(shuō)明，分別測(cè)定吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、異戊烯基腺苷（IPA）、脫落酸（ABA）及茉莉酸（JA）含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)熒光顯微觀察

遠(yuǎn)緣雜交與自交授粉后不同時(shí)期雌蕊熒光顯微觀察如圖1，授粉后1 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊花粉粒黏附極少，未見(jiàn)萌發(fā)（圖1A）；自交授粉花粉粒黏附較多，花粉萌發(fā)花粉管生長(zhǎng)正常（圖1B）。授粉6 h，遠(yuǎn)緣雜交花粉粒黏附增多，花粉粒萌發(fā)，花粉管有扭曲、分枝現(xiàn)象，伴有大量胼胝質(zhì)沉積（圖1C、D）；自交雌蕊花粉管生長(zhǎng)迅速，有序向花柱生長(zhǎng)（圖1E）。授粉后12 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉管多扭曲，部分伸長(zhǎng)到柱頭1/2到2/3部分（圖1F）；自交授粉花粉管生長(zhǎng)正常，伸長(zhǎng)到花柱部分（圖1G）。授粉36 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉個(gè)別花粉管伸長(zhǎng)到子房（圖1H）；自交授粉花粉管成束有序穿過(guò)花柱，伸長(zhǎng)到子房（圖1I）。授粉72 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉少量花粉管伸長(zhǎng)到胚珠，伴有胼胝質(zhì)沉積（圖1J），柱頭上花粉粒大多開(kāi)始干癟（圖1L）；自交授粉花粉管正常生長(zhǎng)到胚珠（圖1K）。后期觀察發(fā)現(xiàn)，自交授粉能正常結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)率高，種莢飽滿（圖1M、N）；遠(yuǎn)緣雜交授粉結(jié)實(shí)率低，種莢大多干癟（圖1O、P）。整體表明，遠(yuǎn)緣雜交受精前障礙明顯，花粉粒萌發(fā)晚，花粉管內(nèi)胼胝質(zhì)沉積是其不親和原因。

2.2 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊SOD活性變化

授粉后不同時(shí)間，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊SOD活性變化（圖2）表明：授粉后1 h，自交雌蕊SOD活性急速上升，遠(yuǎn)緣雜交雌蕊活性稍有上升，此時(shí)自交雌蕊花粉萌發(fā)，花粉管生長(zhǎng)迅速，遠(yuǎn)緣雜交雌蕊未見(jiàn)花粉萌發(fā)；1～3 h自交雌蕊SOD活性繼續(xù)急速顯著上升（P＜0.05），在3 h達(dá)到頂峰84.57 U·g?1，3 h之后活性稍有下降，此后保持在較高水平，并在72 h達(dá)到另一高峰75.05 U·g?1，此時(shí)花粉管伸入胚珠部分。遠(yuǎn)緣雜交雌蕊SOD活性1～3 h同樣急速上升，在3 h達(dá)到一個(gè)峰點(diǎn)74.78 U·g?1，此時(shí)遠(yuǎn)緣雜交雌蕊個(gè)別花粉萌發(fā)；3 h后稍有下降，在24 h達(dá)到另一峰值81.97 U·g?1，之后保持在較高水平。表明高活性SOD對(duì)花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，尤其在授粉前期，高活性SOD有助于花粉-柱頭的識(shí)別作用，對(duì)自交授粉花粉粒在柱頭的黏附萌發(fā)促進(jìn)作用顯著。

圖2 授粉后雌蕊 SOD 活性及MDA 含量變化Fig.2 Changes of SOD activity and MDA content in pistils after pollination

2.3 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊MDA含量變化

授粉后，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊不同時(shí)間MDA含量變化（圖2）表明：授粉后1 h，自交雌蕊MDA含量顯著上升（P＜0.05），1 h達(dá)最大67.03 μmol·g?1，此時(shí)自交雌蕊花粉萌發(fā)，花粉管生長(zhǎng)迅速；1 h之后MDA含量下降，并在8 h之后保持在較低水平，隨后波動(dòng)不大，顯微特征表現(xiàn)為花粉管有序向花柱及子房生長(zhǎng)，推測(cè)此時(shí)雌蕊內(nèi)部達(dá)到平衡狀態(tài)，雌蕊自身適應(yīng)花粉落在柱頭所帶來(lái)的刺激作用。遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊MDA含量在授粉后1～3 h急速下降，此時(shí)花粉未見(jiàn)萌發(fā)；6 h之后MDA含量開(kāi)始急速顯著上升（P＜0.05），12 h含量達(dá)到最大 72.87 μmol·g?1，此階段花粉管出現(xiàn)扭曲，并伴有胼胝質(zhì)沉積，花粉管生長(zhǎng)受阻，可能原因在于柱頭對(duì)外來(lái)花粉識(shí)別后排斥作用明顯，誘導(dǎo)MDA急速增加，進(jìn)而打破雌蕊內(nèi)部動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞功能受損；在授粉后24 h之后MDA快速下降，并在48 h之后保持穩(wěn)定，推測(cè)此時(shí)雌蕊應(yīng)激響應(yīng)達(dá)到平衡，整體處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.4 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊可溶性蛋白、可溶性糖含量變化

授粉后不同時(shí)間，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊可溶性蛋白、可溶性糖含量變化（圖3）表明：自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉0～36 h，可溶性蛋白及可溶性糖含量均表現(xiàn)為波動(dòng)上升趨勢(shì)，自交與遠(yuǎn)緣雜交的可溶性蛋白含量分別在24、36 h達(dá)最大，分別為52.90、50.48 mg·g?1，可溶性糖含量分別在 12、8 h 達(dá)到最大，分別為 30.17、31.64 mg·g?1；授粉36 h后，二者含量相對(duì)穩(wěn)定。由此說(shuō)明，可溶性蛋白及可溶性糖在柱頭識(shí)別及應(yīng)對(duì)外來(lái)刺激作用中起著重要作用，其中，可溶性糖較可溶性蛋白含量變化小，表明在柱頭識(shí)別及應(yīng)對(duì)外來(lái)刺激作用中，可溶性蛋白起著主導(dǎo)作用。出現(xiàn)此現(xiàn)象可能的原因是，在柱頭識(shí)別階段，可溶性蛋白作為識(shí)別蛋白的重要組成，積極參與柱頭的識(shí)別作用。此外，授粉作為外來(lái)刺激，雌蕊內(nèi)部平衡破壞，加速雌蕊代謝，進(jìn)一步提高了可溶性蛋白及可溶性糖含量，而表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，隨著刺激減弱，二者含量也相對(duì)保持平穩(wěn)。

圖3 授粉后雌蕊可溶性蛋白含量及可溶性糖含量變化Fig.3 Changes of soluble protein content and soluble sugar content in pistils after pollination

2.5 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊IAA、GA3含量變化

圖4表明：自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊IAA、GA3含量變化整體表現(xiàn)為上升-下降-上升趨勢(shì)。整體上自交授粉雌蕊較遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊IAA含量高，尤其在授粉前期表現(xiàn)較顯著。自交授粉雌蕊IAA、GA3含量上升趨勢(shì)較遠(yuǎn)緣雜交早，授粉后3～6 h自交授粉雌蕊IAA含量便急速顯著上升（P＜0.05），并在 6 h 達(dá)最大 45.28 ng·g?1；自交授粉GA3含量在授粉后1～3 h快速上升，高于遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊，此階段自交授粉花粉萌發(fā)多，花粉管生長(zhǎng)迅速。隨著遠(yuǎn)緣雜交授粉GA3含量的升高，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊花粉開(kāi)始萌發(fā)，花粉管伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。表明高水平IAA、GA3對(duì)花粉在柱頭的識(shí)別及花粉萌發(fā)、花粉管的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，IAA、GA3作為中間物質(zhì)，起著傳遞生長(zhǎng)信號(hào)的作用。

圖4 授粉后雌蕊 IAA 及GA3 含量變化Fig.4 Changes of IAA and GA3 content in pistils after pollination

2.6 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊IPA含量變化

圖5表明：自交與遠(yuǎn)緣雜交雌蕊授粉后IPA含量均表現(xiàn)出先升高后下降趨勢(shì)。授粉后1～36 h，自交授粉雌蕊IPA含量處于較高水平且保持相對(duì)穩(wěn)定，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊IPA含量呈波動(dòng)上升，同樣保持在較高水平，其中，授粉后3～8 h，自交授粉雌蕊IPA含量高，顯微特征表現(xiàn)為花粉管迅速伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊IPA含量較低，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)花粉管有胼胝質(zhì)沉積及扭曲纏繞現(xiàn)象，推測(cè)高水平IPA對(duì)花粉管的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；36 h之后均急速下降，之后保持相對(duì)穩(wěn)定，花粉管生長(zhǎng)也趨于穩(wěn)定狀態(tài)，自交授粉含量依然高于遠(yuǎn)緣雜交授粉。

圖5 授粉后雌蕊 IPA 含量及（IAA+GA3）/ABA 變化Fig.5 Changes of IPA content and （IAA+GA3）/ABA in pistils after pollination

2.7 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊（IAA+GA3）/ABA變化

圖5表明：自交授粉雌蕊（IAA+GA3）/ABA顯著高于遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊。授粉0～36 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊（IAA+GA3）/ABA僅在授粉后6 h有上升趨勢(shì)，此時(shí)遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊處于花粉萌發(fā)、花粉管快速生長(zhǎng)階段，此時(shí)ABA含量依然較高，花粉管扭曲嚴(yán)重；自交授粉雌蕊（IAA +GA3）/ABA僅在授粉后36～48 h較低，此時(shí)花粉管已伸入子房。

2.8 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊ABA、JA含量變化

圖6表明：授粉0～24 h，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊ABA含量變化趨勢(shì)相反，自交授粉雌蕊ABA含量稍下降，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊則急速顯著上升（P＜0.05），并保持在較高水平，此階段自交授粉花粉萌發(fā)，花粉管生長(zhǎng)迅速，遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉管扭曲嚴(yán)重，胼胝質(zhì)沉積較多；授粉0～3 h，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊JA含量均上升，遠(yuǎn)緣雜交授粉上升趨勢(shì)更顯著，此時(shí)自交授粉花粉少量萌發(fā)，遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉未見(jiàn)萌發(fā)；授粉3～12 h，JA含量均呈下降趨勢(shì)，此時(shí)花粉管處于快速生長(zhǎng)階段；12 h之后，自交授粉雌蕊JA含量保持相對(duì)穩(wěn)定，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊JA含量再次上升，授粉72 h之后保持穩(wěn)定，此時(shí)花粉管已伸長(zhǎng)到胚珠部分；24～36 h期間，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊ABA含量均有大幅度上升，48 h之后呈現(xiàn)輕微下降趨勢(shì)，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)花粉管伸長(zhǎng)生長(zhǎng)到子房部分。整個(gè)授粉受精期間，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊ABA含量遠(yuǎn)高于自交雌蕊，JA含量整體上也較自交授粉雌蕊高。推測(cè)在花粉-柱頭識(shí)別階段，JA含量的升高影響了花粉黏附及花粉的水合作用，進(jìn)而阻礙了遠(yuǎn)緣雜交雌蕊花粉的萌發(fā)；同時(shí)，伴隨著ABA含量的快速增加，高含量ABA致使遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉管胼胝質(zhì)沉積較多，阻礙花粉管進(jìn)一步伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出扭曲纏繞生長(zhǎng)停滯。

圖6 授粉后雌蕊 ABA 及JA 含量變化Fig.6 Changes of ABA and JA content in pistils after pollination

3 討論

受精前障礙是多數(shù)植物遠(yuǎn)緣雜交天然生殖障礙的主要原因[14-15]，相關(guān)研究表明，胼胝質(zhì)大量積累是遠(yuǎn)緣雜交不親和受精前障礙的主要細(xì)胞學(xué)原因之一，絨氈層的花粉外壁蛋白與柱頭乳突細(xì)胞質(zhì)膜蛋白相互識(shí)別，親和性授粉，柱頭會(huì)分泌囊泡，提供花粉萌發(fā)所需的水合物質(zhì)；不親和授粉，胼胝質(zhì)產(chǎn)生積累在乳突細(xì)胞，擾亂花粉水合作用，進(jìn)而抑制花粉萌發(fā)[16]。李辛雷等[17]在菊屬（Chrysanthemum L.）植物遠(yuǎn)緣雜交研究中發(fā)現(xiàn)，不親和雜交組合柱頭上花粉粒黏附少，花粉萌發(fā)率低，花粉管生長(zhǎng)異常，難以進(jìn)入花柱；高山杜鵑（Rhododendron lapponicum （L.） Wahl.）遠(yuǎn)緣雜交后，花粉管、花柱、胚珠等產(chǎn)生大量胼胝質(zhì)，導(dǎo)致受精障礙而無(wú)法結(jié)實(shí)是其不親和的主要原因[18]；牡丹芍藥遠(yuǎn)緣雜交也因花粉管扭曲、纏繞、分枝、胼胝質(zhì)沉積等表現(xiàn)為受精前障礙[19-21]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，‘鳳丹’與?？的档みh(yuǎn)緣雜交受精前障礙明顯，胼胝質(zhì)沉積在其中起著主導(dǎo)作用，原因可能是遠(yuǎn)緣雜交授粉引起的脅迫反應(yīng)，干擾了花粉管細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞壁內(nèi)層胼胝質(zhì)的正常合成，引起胼胝質(zhì)異常累積，從而造成花粉管生長(zhǎng)紊亂，出現(xiàn)扭曲纏繞現(xiàn)象。

授粉作為一種外來(lái)刺激，會(huì)在柱頭及子房?jī)?nèi)引起酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化。SOD作為植物防御系統(tǒng)里重要的抗氧化酶，通過(guò)清除過(guò)量的活性氧來(lái)保護(hù)植物免受外界刺激產(chǎn)生的傷害，高水平SOD有利于花粉-柱頭的識(shí)別、黏附及花粉在柱頭的萌發(fā)[13]。吳能表等[22]在對(duì)甘藍(lán)（Brassica oleracea var.capitata L.）雜交授粉研究中發(fā)現(xiàn)，授粉后雌蕊SOD活性會(huì)顯著上升，親和性授粉較不親和性授粉上升更顯著；在蕓芥（Eruca sativa Mill.）自花授粉研究中，自交親和授粉雌蕊SOD活性變化較自交不親和變化更顯著[10]。本研究結(jié)果表明，授粉親和雌蕊SOD活性升高明顯，特別在授粉前期花粉管迅速生長(zhǎng)階段，SOD活性急速顯著升高（P＜0.05），推測(cè)此時(shí)雌蕊內(nèi)部清除活性氧系統(tǒng)迅速加強(qiáng)，外界刺激誘發(fā)的活性氧被迅速清除，為花粉管正常生長(zhǎng)提供了便利環(huán)境。MDA作為膜脂過(guò)氧化最終產(chǎn)物，其含量高低可直接反映細(xì)胞受傷害程度[23]。張雪梅等[24]在蘋(píng)果（Malus pumila Mill.）自花授粉研究中發(fā)現(xiàn)，授粉前期自交親和雌蕊MDA含量較自交不親和高，48 h之后隨著自交親和雌蕊MDA含量下降，花粉管持續(xù)生長(zhǎng)，自交不親和雌蕊MDA含量升高，花粉管在花柱內(nèi)停止生長(zhǎng)；Ren等[25]對(duì)芍藥花粉冷凍保存研究發(fā)現(xiàn)，冷凍過(guò)程中細(xì)胞膜脂過(guò)氧化加劇促使MDA含量的增加，細(xì)胞功能受損，細(xì)胞凋亡率升高，花粉萌發(fā)率下降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，花粉萌發(fā)、花粉管的生長(zhǎng)誘導(dǎo)MDA含量快速升高，同時(shí)伴隨MDA含量的急速顯著升高（P＜0.05），遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉管扭曲纏繞并伴有大量胼胝質(zhì)沉積，推測(cè)出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是雌蕊細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，導(dǎo)致柱頭及花柱細(xì)胞功能受阻，引導(dǎo)花粉管有序生長(zhǎng)的信號(hào)物質(zhì)減少，致使花粉管無(wú)序生長(zhǎng)，進(jìn)而出現(xiàn)扭曲纏繞，無(wú)法順利穿過(guò)花柱進(jìn)入子房完成受精?？扇苄缘鞍缀涂扇苄蕴羌仁菨B透調(diào)節(jié)物質(zhì)又是柱頭識(shí)別物質(zhì)的主要成分，在植物授粉過(guò)程中有著重要作用。此外，蛋白質(zhì)代謝是連接植物體內(nèi)三大代謝的樞紐，在植物抗逆生理中具有重要作用[26]。吳能表等[22]在甘藍(lán)雜交研究中發(fā)現(xiàn)，自花或異花授粉，均能引起甘藍(lán)體內(nèi)生理生化反應(yīng)，伴隨花柱內(nèi)蛋白含量的升高，促進(jìn)甘藍(lán)體內(nèi)代謝改變。本研究結(jié)果表明，授粉后自交與遠(yuǎn)緣雜交雌蕊可溶性蛋白含量均表現(xiàn)為先升高后下降趨勢(shì)，可溶性糖含量在小范圍波動(dòng)，整體遠(yuǎn)緣雜交雌蕊可溶性糖含量較自交雌蕊含量高，原因可能是遠(yuǎn)緣雜交花粉對(duì)柱頭刺激作用更加明顯，柱頭對(duì)花粉識(shí)別及排異作用加強(qiáng)，加速了雌蕊代謝作用，排異物質(zhì)增加，花粉管生長(zhǎng)受阻，顯微特征表現(xiàn)為花粉管內(nèi)胼胝質(zhì)的沉積及花粉管扭曲纏繞。

GA3、IAA、ABA、JA等是植物花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)中的重要調(diào)控物質(zhì)[27-29]，張鵬等[30]在加楊（Populus×canadensis Moench）自交和與銀腺楊（P.alba×P.glandulosa）雜交授粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，親和性授粉GA3、IAA、ZR含量較不親和授粉含量高，ABA含量較不親和授粉含量低；劉懿瑤[31]研究表明，茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了油茶（Camellia oleifera Abel.））的自交授粉過(guò)程，進(jìn)而參與植物防御過(guò)程，花柱中花粉管緩慢生長(zhǎng)時(shí)，子房接收到JA信號(hào)，啟動(dòng)抑制自交授粉親和的分子機(jī)制，花粉管生長(zhǎng)受阻；低水平的IPA、ZR、GA3含量引起花粉管尖端膨大、扭曲折疊，是同源四倍體黑皮冬瓜（Benincasa hispida （Thunb.）Cogn.）自交低稔的原因之一[32]。本研究結(jié)果表明，在前期花粉-柱頭識(shí)別階段，自交授粉雌蕊IAA含量顯著高于遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊，隨IAA含量顯著升高（P＜0.05），花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)迅速，表明高水平IAA對(duì)親和性授粉過(guò)程中花粉萌發(fā)有促進(jìn)作用。授粉前期，自交授粉IPA、GA3含量較高，遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉開(kāi)始萌發(fā)時(shí)IPA、GA3含量升高，推測(cè)高水平IPA、GA3有利于花粉管生長(zhǎng)，這與賀丹等[13]在芍藥牡丹遠(yuǎn)緣雜交研究結(jié)果相似。Kim等[33]研究表明，JA與ABA相互作用來(lái)調(diào)節(jié)植物反應(yīng)和對(duì)非生物脅迫的耐受性，同時(shí)JA激活A(yù)BA合成基因，促進(jìn)了ABA的生物合成。Rajesh 等[34]研究表明，ABA調(diào)控CALLOSE SYNTHASE 1（CALS1）基因表達(dá)上調(diào)，抑制分解胼胝質(zhì)的葡聚糖酶，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)胼胝質(zhì)堵塞，限制獲得促進(jìn)生長(zhǎng)的信號(hào)達(dá)到對(duì)楊樹(shù)芽休眠的效果。本研究結(jié)果表明，在授粉過(guò)程中，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊JA含量高于自交授粉雌蕊，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊ABA含量遠(yuǎn)高于自交授粉雌蕊，特別在授粉后6 h，ABA含量急劇顯著升高（P＜0.05），此時(shí)遠(yuǎn)緣雜交雌蕊胼胝質(zhì)沉積較多，花粉管扭曲嚴(yán)重，推測(cè)ABA含量的升高是伴隨JA含量升高延遲發(fā)生的，二者共同作用，誘導(dǎo)花粉管細(xì)胞內(nèi)胼胝質(zhì)堵塞，對(duì)花粉管伸長(zhǎng)生長(zhǎng)起抑制作用。此外，低水平（IAA+GA3+ZR）/ABA是自交不親和的特征表現(xiàn)[35]，高水平（IAA+GA3）/ABA有利于授粉親和[12]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，親和性授粉（IAA+GA3）/ABA遠(yuǎn)高于不親和授粉，這說(shuō)明在雜交不親和中起決定作用的是生長(zhǎng)素和赤霉素與脫落酸的比值，而不是含量的絕對(duì)值。

4 結(jié)論

受精前障礙是‘鳳丹’與?？的档みh(yuǎn)緣雜交不親和的主要原因，具體體現(xiàn)在花粉-柱頭的識(shí)別作用及花粉管能否正常伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。Fu等[14]通過(guò)鹽溶液處理柱頭以破壞柱頭識(shí)別作用，有效克服了亞洲百合（Lilium Asiatica Hybrida）與東方百合（（Lilium spp.） Oriental hybrids）受精前障礙；Chen等[15]對(duì)煙草（Nicotiana tabacum L.）進(jìn)行延遲授粉，避開(kāi)柱頭識(shí)別功能強(qiáng)效階段，從而克服煙草雜交不親和受精前障礙；郝津藜等[36]通過(guò)對(duì)柱頭施加外源GA3，大幅提高牡丹遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)率，在一定程度上克服了牡丹遠(yuǎn)緣雜交受精前障礙。結(jié)合本試驗(yàn)，推測(cè)通過(guò)施加外源IAA、GA3、IPA類植物激素及通過(guò)對(duì)柱頭識(shí)別功能的破壞，或可有效克服‘鳳丹’與?？的档な芫罢系K，有效提高育種效率，但實(shí)際效果有待進(jìn)一步研究論證。