姚明靜，楊 楊，范 婧，趙祥穎，任麗琨，邊 鑫，邢童林，朱鵬宇，孫智慧，張 娜,

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150076；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東省食品發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250013）

隨著人們生活水平的提高，人們的飲食方式發(fā)生了改變，肉類、脂肪類攝入量增加，膳食纖維、果蔬攝取減小，由此引發(fā)了心血管疾病、肥胖癥和糖尿病等慢性疾病[1]，尤其是心血管疾病，已成為人類健康第一大殺手，每年約有1790 萬患者死于該病，占全世界死亡率的31%（World Health Statistics，2019）。在心血管疾病患者中，85%的患者死于心臟病和中風(fēng)，而血栓的形成是是心臟病和中風(fēng)的重要誘因，因此，血栓的治療引起了科研工作者廣泛的關(guān)注。目前已有的溶栓藥物鏈激酶、尿激酶、單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑（scu-PA）、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）等具有半衰期短、特異性差等缺陷，可能會造成局部出血等副作用，因此，開發(fā)半衰期長、特異性強(qiáng)的新型溶栓酶具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

納豆激酶（Nattokinase，簡稱NK）（EC 3.4.21.62），又被稱為枯草桿菌蛋白酶NAT（subtilisin NAT），最初由日本科研人員Sumi 在1987 年研究納豆時發(fā)現(xiàn)[2]。納豆激酶可直接水解纖維蛋白，半衰期長、特異性強(qiáng)、副作用小，且在胃腸道內(nèi)可保持穩(wěn)定，因此，納豆激酶成為溶栓藥物的新熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，納豆激酶是由納豆中的Bacillus subtilis（natto）分泌而來，是一種堿性絲氨酸蛋白酶[3]，等電點(diǎn)為8.6±0.3，在pH6～12 時可保持良好的纖溶活性，最適pH8.0，在酸性條件下活性和穩(wěn)定性較差，當(dāng)pH 低于3 時，酶活性徹底喪失[2]。NK 在低溫環(huán)境中（60 ℃以下）更穩(wěn)定，反復(fù)凍融5 個循環(huán)，仍可保持95%的酶活力，但是熱穩(wěn)定性差，當(dāng)環(huán)境溫度高于60 ℃時，酶會迅速失活[4-5]。此外，野生型Bacillus subtilis（natto）產(chǎn)納豆激酶的產(chǎn)量較低，導(dǎo)致納豆激酶價格較高，限制了其的大范圍應(yīng)用。目前國內(nèi)外學(xué)者分別從菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、基因工程和蛋白質(zhì)工程改造等方面入手，以期提高納豆激酶產(chǎn)量、改善納豆激酶的酸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。

隨著對納豆激酶研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)納豆激酶不僅具有溶栓的功效，還可以預(yù)防血栓的形成。此外，納豆激酶在降血壓[6-7]、降血脂[8-9]、治療鼻竇炎[10]等方面也有明顯的生理功效。因此，本文結(jié)合近年來國內(nèi)外的相關(guān)研究成果，詳述了納豆激酶的結(jié)構(gòu)特征、纖溶活性和抗血栓活性的作用機(jī)制，總結(jié)了納豆激酶在提高酶活性和穩(wěn)定性，提升產(chǎn)量方面有關(guān)生產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵優(yōu)化、工程菌株改造以及酶固定化等方面的進(jìn)展，闡述了納豆激酶的生理功能，最后對納豆激酶應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望，以期為納豆激酶的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 納豆激酶的簡介

1.1 納豆激酶的結(jié)構(gòu)

納豆激酶是一種絲氨酸蛋白酶，屬于絲氨酸蛋白酶S8 家族。aprN基因?yàn)镹K 的編碼基因，長度為0.8 kb，以GTG 為起始密碼子，共編碼381 個氨基酸，包含引導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的信號肽序列（29 個氨基酸），幫助蛋白質(zhì)正確折疊的分子伴侶前導(dǎo)肽（77 個氨基酸），以及最終產(chǎn)生的納豆激酶成熟肽（275 個氨基酸）[5]。NK 為一條單鏈多肽，分子內(nèi)不含半胱氨酸，因此無二硫鍵，成熟肽的分子量為27.7 kDa[11]。NK 成熟肽的氨基酸序列與其他枯草桿菌蛋白酶序列高度同源，如與枯草桿菌蛋白酶E（Subtilisin E）、枯草桿菌蛋白酶BPN’（Subtilisin BPN’）、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg（Subtilisin Carlsberg）、枯草桿菌蛋白酶DY（Subtilisin DY）在氨基酸序列上的同源性分別為99.5%、86%、72%和70%。然而，與其它枯草桿菌蛋白酶不同的是，NK 對纖維蛋白表現(xiàn)出高度的底物特異性[12]?；诳莶輻U菌E 的晶體結(jié)構(gòu)，Yanagisawa 構(gòu)建了NK 的三維結(jié)構(gòu)模型（如圖1所示），該酶的成熟肽主要由9 個α-螺旋和9 個β-折疊構(gòu)成，以及2 個與穩(wěn)定性相關(guān)的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)[13]。

圖1 納豆激酶的三維結(jié)構(gòu)圖[13]Fig.1 3D structure of nattokinase[13]

在NK 的氨基酸組成中，一些關(guān)鍵氨基酸殘基對NK 的活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有著重要的影響。NK是一個球狀蛋白，其催化活性中心位于球狀蛋白表面淺槽，由Asp32-His64-Ser221 三聯(lián)體組成，NK 的底物結(jié)合位點(diǎn)由Ser125、Leu126 和Gly127三個保守的氨基酸組成[14]。氫鍵在NK 的催化活性和穩(wěn)定性中起著重要作用，A32-H64-S221 三聯(lián)體和Gln155氧離子洞中的氫鍵對肽鍵的催化至關(guān)重要，Ser33、Asp60、Ser62 和Thr220 形成的氫鍵可穩(wěn)定水解反應(yīng)中的過渡態(tài)（圖2）。NK 的S3 結(jié)合區(qū)域的三個殘基Gly100、Ser101 和Leu126 對NK 的纖溶酶活性至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈兛捎绊懙孜锾禺愋訹15-17]。在Gly100位點(diǎn)引入側(cè)鏈較長的氨基酸可能會降低底物結(jié)合和酶的催化活性[17]。與Gly100 相反，在Ser101 位引入體積較大的側(cè)鏈可以提高蛋白酶活性[17]。Leu126被認(rèn)為是NK 活性裂隙的重要結(jié)構(gòu)成分，它埋藏在活性裂隙中，靠近催化三聯(lián)體。這個殘基是保守的，對所有枯草桿菌蛋白酶的功能非常重要[3]。

圖2 NK 中由Ser33、Asp60 和Ser62 形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[16]Fig.2 Loop structure of NK including Ser33,Asp60 and Ser62[16]

1.2 納豆激酶的作用機(jī)制

與其它纖溶酶相比，納豆激酶的溶栓作用明顯，溶栓效率高，作用時間長，是由多個機(jī)制同時作用。納豆激酶不僅可以通過直接水解纖維蛋白和纖溶酶底物來分解血液凝塊，還可以將內(nèi)源性尿激酶原轉(zhuǎn)化為尿激酶（u-PA），降解纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1，可以抑制t-PA 的活性），并增加具有纖溶活性的組織纖溶酶原激活物（t-PA，可以促進(jìn)人體內(nèi)纖溶酶原向纖溶酶的轉(zhuǎn)化反應(yīng)）（圖3）[11]。與t-PA 和uPA 等常見的纖溶酶不同，納豆激酶不會產(chǎn)生出血等副作用，在人體血液中的半衰期可超過3 h，遠(yuǎn)優(yōu)于其它纖溶酶[11]。

圖3 納豆激酶的作用機(jī)制Fig.3 Mechanism of nattokinase

因此，NK 目前被認(rèn)為是一種高效、安全和經(jīng)濟(jì)的酶，也是溶栓藥物研究的焦點(diǎn)。降低NK 的生產(chǎn)成本，進(jìn)一步提高NK 產(chǎn)量，增強(qiáng)NK 穩(wěn)定性成為NK的研究熱點(diǎn)。

2 納豆激酶的生產(chǎn)和發(fā)酵

2.1 納豆激酶的生產(chǎn)菌株

目前，納豆激酶主要由三種微生物發(fā)酵產(chǎn)生，芽孢桿菌（Bacillus）、海洋生物[18]和假單胞菌（Pseudomonassp.）[19]。如表1所示，NK 的生產(chǎn)菌株主要是從發(fā)酵食品中分離出來的。B. subtilisLSSE-62 來自于中國大豆醬中[20]，B. amyloliquefaciensDC-4 和B.sublitisDC33 則是從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉中獲得的[21-22]。Bacillussp. CK 11-4 來自傳統(tǒng)的韓國發(fā)酵食 品 Chungkook-Jang[23]，B. subtilisWRL101 和Bacillussp. DJ-4 是從傳統(tǒng)的韓國發(fā)酵食品豆?jié){Doenjang 中篩選出來的[24-25]。從牛乳中篩選而來的Pseudomonas aeruginosaCMSS[26]，從土壤中獲得的Pseudomonassp. TKU015[27]以及從鐵銹中分離而來的B. cereusVITSDVM3[28]也被確認(rèn)為有效的NK 生產(chǎn)者。由于研究人員定義NK 活性的單位不一致，如FU/mL、U/mL、IU/mL、FU/g 和U/g 等，因此很難比較各個菌株之間的NK 產(chǎn)量。目前研究最多的是枯草芽孢桿菌，尤其是從日本納豆中篩選的Bacillus subtilisnatto。

表1 NK 的生產(chǎn)菌株來源及發(fā)酵底物Table 1 Strain source and fermentation substrates of NK

2.2 納豆激酶的制備

目前，納豆激酶主要通過發(fā)酵來制備，根據(jù)發(fā)酵方式可分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種。固態(tài)發(fā)酵所使用的生產(chǎn)設(shè)備要求簡單，控制方便，發(fā)酵原料成本較低。液態(tài)發(fā)酵過程傳質(zhì)均勻可控，監(jiān)測技術(shù)成熟，易放大，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的自動化連續(xù)生產(chǎn)。因此，兩種發(fā)酵方式在研究和實(shí)際生產(chǎn)中均有應(yīng)用。

2.2.1 納豆激酶的固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵通常是在沒有游離水的情況下，以具有一定濕度的水不溶性的固態(tài)物質(zhì)做物理介質(zhì)及營養(yǎng)來源，接種一種或多種微生物發(fā)酵的生物反應(yīng)過程。固態(tài)發(fā)酵是納豆激酶制備的重要生產(chǎn)方式，納豆激酶的制備最初主要從固態(tài)發(fā)酵豆制品如納豆[2]、豆豉[33]、豆醬[34]、Jotgal[35]等中提取而來。影響固態(tài)發(fā)酵的因素主要有發(fā)酵物料、料液比、發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時間。固態(tài)發(fā)酵可選用的發(fā)酵物料比較多，既可以選擇黃豆[36]、黑豆[37]、鷹嘴豆[20]、銀杏果[38]、板栗[39]等天然作物，還可以選擇豆粕[40]、麥麩、稻殼[36]等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物。其不僅可降低成本，還可以減少環(huán)境污染實(shí)現(xiàn)資源的最大化利用。此外，固態(tài)發(fā)酵過程中幾乎無廢水產(chǎn)生，環(huán)境污染少；通氣可采用自然通風(fēng)或者間歇通風(fēng)，無需嚴(yán)格的無菌空氣及相應(yīng)的設(shè)備。因此，固態(tài)發(fā)酵的投資較少，能耗低，技術(shù)比較簡單，適于小規(guī)模生產(chǎn)。目前，商業(yè)化應(yīng)用的固態(tài)發(fā)酵制備納豆激酶活性一般能達(dá)到20～100 FU/g[41]。然而，由于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中水分含量較少，流通性差，整個過程較為粗放，發(fā)酵過程中間參數(shù)難以進(jìn)行檢測及監(jiān)測，發(fā)酵調(diào)控比較困難，因此固態(tài)發(fā)酵很難進(jìn)行純種培養(yǎng)和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2.2 納豆激酶的液態(tài)發(fā)酵 液態(tài)發(fā)酵具有傳質(zhì)均勻，發(fā)酵過程檢測技術(shù)成熟、可控，能夠?qū)崿F(xiàn)自動連續(xù)化和易于放大等優(yōu)勢，是近20 年NK 大規(guī)模生產(chǎn)研究的主要方法。影響液態(tài)發(fā)酵的主要因素有發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件和發(fā)酵方式。培養(yǎng)基中碳源、氮源及無機(jī)鹽的種類對最終NK 的產(chǎn)量影響較大。碳源可為微生物的生產(chǎn)代謝提供能量，而氮源則可為微生物合成蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子提供原料。比較適宜用于生產(chǎn)NK 的碳源主要有葡萄糖[42]、麥芽糖[34]、甘油[43]，而蛋白胨[44]、酵母提取物和大豆蛋白被確認(rèn)為NK 生產(chǎn)的氮源[19,45]。無機(jī)鹽種類，例如Ca2+、Mg2+、Al3+、Co2+、Cu2+、 Fe3+、Zn2+、Mn2+、Na+等也會對NK 的產(chǎn)量有影響。其中Ca2+一般可促進(jìn)NK 的產(chǎn)量，這可能是因?yàn)镃a2+參與酶的協(xié)同作用，可將表面蛋白固定在細(xì)胞壁上，提高了菌體對蛋白的利用效率進(jìn)而可產(chǎn)生更高產(chǎn)量的NK[46-47]。而其余的金屬離子對NK 產(chǎn)量的影響與具體的菌株及培養(yǎng)基成分有關(guān)，例如0.02%的MgSO4的添加可顯著提高Bacillus subtilis MX-6 的NK 產(chǎn)量[47]，然而MgSO4卻對Bacillus natto NLSSE 生產(chǎn)NK 的產(chǎn)量無顯著影響[34]。

發(fā)酵條件主要包含pH、溫度和溶氧。一個最佳的培養(yǎng)基pH 有助于維持膜中的電荷和培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，通過調(diào)節(jié)質(zhì)子泵和通過膜運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)[48]。大多數(shù)纖溶酶發(fā)酵的最適pH 范圍為中性到微堿性（pH6.0～9.0），一般每種菌都有一個自己最適宜的pH，高于或低于此pH 酶產(chǎn)量明顯減少[49]。例如，Bacillus subtilis natto 在pH7.5 時NK 產(chǎn)量最高，低于或高于pH7.5 時酶產(chǎn)量急劇降低[46]。溫度是發(fā)酵過程的一個重要變量，大多數(shù)產(chǎn)纖溶酶的微生物的發(fā)酵溫度一般在30～40 ℃[50,51]，而一些嗜熱菌的最適發(fā)酵溫度一般較高。例如，B. tequilensis ZMS-2最適溫度60 ℃[52]，而S. megasporus SD5 MCMB-379 最適溫度55 ℃[53]。NK 生產(chǎn)菌株一般都為好氧菌，溶氧量的控制對NK 的生產(chǎn)至關(guān)重要，一般可以通過調(diào)節(jié)裝液量（搖瓶）、轉(zhuǎn)速（搖瓶和發(fā)酵罐）及通氣量（發(fā)酵罐）來控制溶氧[49]。菌株的生長對數(shù)期耗氧量比較大，提高溶氧有助于菌體的生長，發(fā)酵后期菌株進(jìn)入穩(wěn)定期耗氧量穩(wěn)定，因此發(fā)酵過程中可通過分階段控制溶氧來提高NK 產(chǎn)量[49]。

液態(tài)發(fā)酵根據(jù)發(fā)酵方式可分為分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵，與分批發(fā)酵方式相比，在細(xì)胞生長階段補(bǔ)料發(fā)酵更具有優(yōu)勢，例如在菌體生長的對數(shù)期分批補(bǔ)料甘油顯著提高NK 的產(chǎn)量[43]。此外，還可以通過pH 值恒定補(bǔ)料分批培養(yǎng)法，通過補(bǔ)料添加葡萄糖和蛋白胨保持發(fā)酵過程中的穩(wěn)定pH，最終NK 產(chǎn)量為分批發(fā)酵的3 倍[54]。

微生物發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶，最初采用固態(tài)發(fā)酵方式，后由于固態(tài)發(fā)酵需要空間比較大，發(fā)酵周期長，時間成本較高，人們逐漸采用了液態(tài)發(fā)酵。后研究發(fā)現(xiàn)，由于一般液態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基營養(yǎng)比較豐富，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束后NK 產(chǎn)品分離純化困難。而且，液態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量廢水，易造成環(huán)境污染。因此，目前固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)NK 又重新吸引了人們的關(guān)注，具體生產(chǎn)過程中固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵方式的選擇應(yīng)根據(jù)具體的菌株以及實(shí)際情況來選擇。

3 提高NK 產(chǎn)量、酶活性及穩(wěn)定性的方法

3.1 發(fā)酵優(yōu)化

發(fā)酵優(yōu)化包含發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化及發(fā)酵方式的優(yōu)化，通過優(yōu)化可以顯著提高NK 的產(chǎn)量。傳統(tǒng)發(fā)酵優(yōu)化的方法是一次改變變量（碳源種類、溫度、pH、接種量、轉(zhuǎn)速和物料濃度等），其余條件保持不變，依據(jù)最終NK 產(chǎn)量獲取最優(yōu)的發(fā)酵條件。這種方法耗時長、工作量大，有時還因?yàn)楦饕蛩亻g的交互作用而產(chǎn)生不正確的結(jié)果。利用統(tǒng)計學(xué)方法可很好的解決此類問題，例如響應(yīng)面優(yōu)化方法，田口正交設(shè)計或部分析因設(shè)計[49]。統(tǒng)計方法提供了可靠性，有助于確定最佳的營養(yǎng)成分，了解參數(shù)之間的相互作用，因此節(jié)省時間和能量。例如，以板栗為原料進(jìn)行固體發(fā)酵，經(jīng)Box-Behnken design（BBD）優(yōu)化后，NK 的產(chǎn)量提高了1.2 倍[39]。發(fā)酵方式的優(yōu)化主要指的是分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵等發(fā)酵過程方式選擇的優(yōu)化，一般通過分批補(bǔ)料發(fā)酵或者連續(xù)發(fā)酵最終生成的NK 產(chǎn)量更高[43,54]，然而其操作過程相對復(fù)雜，對儀器設(shè)備的要求也比較高。

3.2 基因工程及蛋白質(zhì)工程方法

除了普通的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵方式優(yōu)化外，基因工程技術(shù)可用于提高NK 產(chǎn)量。源于Bacillussubtilisnatto 納豆激酶的基因aprN通過基因克隆后可通過異源表達(dá)方式提高NK 產(chǎn)量，目前常用的基因工程宿主既有細(xì)菌宿主，如Bacillus subtilis[55]、Escherichia coli[56]和Lactococcus lactis[57]，也有植物宿主（如煙葉和甜瓜[58]）和動物宿主（如果蠅和甜菜夜蛾的昆蟲細(xì)胞[59]）。微生物宿主生長成本低，繁殖周期短，但各宿主工程菌有其固有的缺點(diǎn)此外，可以通過基因工程技術(shù)和營養(yǎng)優(yōu)化策略提高重組納豆激酶的表達(dá)量。例如，可以通過啟動子優(yōu)化，改變NK 基因啟動子（PaprN）的-10 或-35 元件的序列，特別是-10 元件的序列，提高重組NK 的胞外表達(dá)[60]。利用DNA 家族重排技術(shù)也可將NK 的催化效率提高2.3 倍[61]。此外，還可以通過信號肽優(yōu)化、合成啟動子及刪除冗余基因元件提高Bacillus subtilis表達(dá)NK 的產(chǎn)量[62]。另外，對于重組的產(chǎn)NK 的枯草芽孢桿菌，可以通過在培養(yǎng)基中添加金屬離子和谷氨酸等營養(yǎng)物質(zhì)將NK 產(chǎn)量提高4 倍[63]。

蛋白質(zhì)工程技術(shù)通過氨基酸的定點(diǎn)突變也可實(shí)現(xiàn)NK 活性的提高及穩(wěn)定性的增強(qiáng)，例如優(yōu)化位于酶催化殘基Ser221 附近的氨基酸殘基Thr220 和Met222，可提高NK 的活性及氧化穩(wěn)定性[16]。將NK分子表面的天冬酰胺和谷氨酰胺突變?yōu)樘於彼岷凸劝彼?，可提高NK 的酶活和熱穩(wěn)定性，例如Q59E的突變株的酶活為野生型NK 的1.54 倍，N218D的突變株在55 ℃的半衰期為28 min，是野生型菌株的1.35 倍[14]。然而，通過引入半胱氨酸殘基從而形成二硫鍵來提高NK 的熱穩(wěn)定性的嘗試并不成功[64]。

3.3 酶的固定化

為提高納豆激酶的穩(wěn)定性，除了應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)誘變技術(shù)外，還可采用酶的固定化技術(shù)。固定化是一種商業(yè)應(yīng)用和方便的方法，因?yàn)樗ǔ？梢蕴岣呙傅臒岱€(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性，降低生產(chǎn)成本，而且易于處理和分離，進(jìn)而可使酶重復(fù)使用[73]。NK 的固定化現(xiàn)在已用的方法主要有吸附法、包埋法、共價結(jié)合法及交聯(lián)法（表2）。目前吸附法研究的最熱的就是以納米顆粒為材料進(jìn)行NK 的固定，例如選用聚羥基丁酸酯（PHB）納米粒子進(jìn)行NK的吸附固定，固定后酶的穩(wěn)定性明顯提高，4 °C 保存25 d 活性完全保持不變[65]。包埋法也是NK 固定化常用的方法，目前使用的包埋材料主要有γ-聚谷氨酸[66]、聚賴氨酸[67]、葉酸改性殼聚糖（CS-FA）[68]、多巴胺微膠囊[69]等，包埋后的NK 的酶活、穩(wěn)定性都會明顯提高，而且有的還可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)靶藥給藥的功效[69]。共價結(jié)合法和交聯(lián)法也是NK 固定的常用方法，NK 通過化學(xué)鍵的結(jié)合或者交聯(lián)與材料結(jié)合在一起，穩(wěn)定性較好，同時也可保持NK 的生物活性。當(dāng)以1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺為偶聯(lián)劑，將NK 固定在磁性納米顆粒Fe3O4中，發(fā)現(xiàn)NK納米顆粒結(jié)合物的最佳溶栓活性可達(dá)91.89%，明顯高于純酶活性82.86%[70]。以聚（賴氨酸）樹枝狀大分子為材料，通過交聯(lián)作用可與NK 形成納米復(fù)合物，明顯提高了NK 相對酶活性、熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性，體內(nèi)溶栓率在12 h 達(dá)到50%，并可有效避免出血等其他并發(fā)癥[67]。綜上所述，利用共價結(jié)合、吸附、包埋、交聯(lián)等方法進(jìn)行NK 的固定化，可以顯著提高酶的酶學(xué)性質(zhì)（包含纖溶活性，酸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性）。

表2 NK 的固定化原理及效果Table 2 Principle of immobilization and its effect on NK activity and stability

此外，為了保持納豆激酶在人體內(nèi)的活性，防止被胃酸變性，可以將納豆激酶制成制劑，控制其在人體內(nèi)的釋放速度?？上葘K 粉末壓縮成片劑，然后用Eudragit L100-55 腸道材料和羥丙基纖維素的混合物通過直接壓縮涂覆，進(jìn)而可保證NK 通過胃腸道時的活性[74]。也可先用薄膜法制備的植物甾醇脂質(zhì)體，再將脂質(zhì)體包封納豆激酶（NK），制備NK 口服藥[75]，保護(hù)NK 通過胃時不變性。NK 制劑的研究將會推進(jìn)NK 作為一種口服藥的推廣，對NK 未來的應(yīng)用有重大意義。

4 納豆激酶的生理功能

4.1 納豆激酶的抗血栓功效

在體外和動物模型中，已經(jīng)進(jìn)行了大量的工作來評估NK 的溶栓作用，研究發(fā)現(xiàn)NK 不僅可溶解已有的血栓，還可預(yù)防血栓的形成，且出血等副作用較小。以經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生頸總動脈（CCA）血栓的大鼠為研究對象，NK 的溶栓效力是纖溶酶的4 倍[76]，在2836FU 濃度下，NK 在6 h 內(nèi)可溶解88%的血栓。用卡拉膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓形成，發(fā)現(xiàn)事先服用NK 的小鼠血栓形成的時間明顯延遲[77]，說明NK 可以減緩血栓的形成。與組織纖溶酶原激活劑（t-PA）相比，NK 的出血等副作用明顯較小。先用FeCl3浸泡的紙誘導(dǎo)大鼠頸動脈血栓形成，后靜脈注射NK 或t-PA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NK 和t-PA 均可延遲血栓形成，分別在75 和8.5 mg/kg 時幾乎完全抑制（90%），但NK 在300 mg/kg 時才會引起出血，而t-PA 在10 mg/kg 時即可引起點(diǎn)狀出血[78]。此外，在肺血栓小鼠模型以及健康人類志愿者中，口服NK 可導(dǎo)致血栓計數(shù)和血漿優(yōu)球蛋白溶解時間（ELT）的減少，以及t-PA 的增加，表明NK 能夠激活小鼠和人體的血漿纖溶能力[79]。目前關(guān)于NK 的作用機(jī)制仍主要從圖3所示的三個方面來考慮，然而，關(guān)于NK 在體內(nèi)的具體作用機(jī)制現(xiàn)在研究的還不夠透徹，未來仍需要此方面的研究。

4.2 納豆激酶的降血壓功效

納豆激酶可在預(yù)防和治療高血壓中發(fā)揮作用。2008 年，Kim 等研究了NK 補(bǔ)充劑對高血壓前期或1 期高血壓受試者血壓的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服NK 8 周后可降低患者的收縮壓和舒張壓（NET）變化分別為-5.55 和-2.84 mmHg（P＜0.05）[7]。最近，Jensen等[6]的一項(xiàng)研究表明，服用NK8 周后，高血壓患者的血壓發(fā)生有益變化。這與之前的報道一致，NK 給藥可有效降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[80-84]。

關(guān)于NK 的抗高血壓的作用機(jī)制目前尚無定論。在Jensen 等[6]的研究中，高血壓患者血壓的下降與血漿腎素活性無關(guān)，并且血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）在NK 的降壓作用中的功效備受爭議。雖然人體研究表明，接受NK 治療的患者的ACE 濃度沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異，但其他8 項(xiàng)使用動物模型的研究表明，NK 的降壓作用與ACE 的抑制有關(guān)[83]。然而，根據(jù)口服給藥方式的不同，可能存在不同的降壓作用機(jī)制。在一項(xiàng)使用自發(fā)性高血壓大鼠的研究中，NK 及其片段通過不同的機(jī)制降低了高血壓[80]，NK 可能通過血漿中纖維蛋白原的裂解來降低血壓，而NK 片段可能阻止血漿血管緊張素II 水平的升高，從而抑制大鼠高血壓[80]。此外，NK 的ACE 抑制作用呈劑量依賴性[81,84]。

由于長期使用抗高血壓藥物具有明顯的副作用[85]，NK 攝入可能是治療CVD 患者高血壓的一種有希望的替代方案。因此，每天攝入NK 可能是治療高血壓的一種有效策略[82]。

4.3 納豆激酶的降血脂功效

多個實(shí)驗(yàn)室證實(shí)NK 具有降血脂作用，食用NK 或含有NK 的納豆提取物，可顯著降低動物模型中升高的血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平[8-9]。在高脂血癥患者中，NK治療（6500 FU 治療26 周）降低了總膽固醇、LDLC 和甘油三酯，提高了高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平[86]。然而，在小樣本實(shí)驗(yàn)中，以原發(fā)性高膽固醇血癥患者為對象，NK 治療組每天給與4000 FU，治療4 周后血清膽固醇、LDL-C 和HDL-C 均有所下降，但無明顯差異，可能是由于實(shí)驗(yàn)中使用NK 的劑量相對較低，治療時間也相對較短[87]。當(dāng)NK 使用劑量較高，并延長其治療時間時，NK 的降血脂效果較顯著，例如，謝嵩等[88]以大鼠為動物模型每天使用360 mg/kg 的劑量（約為3000 FU）連續(xù)治療六周后，總膽固醇含量（TC）可降低16%，甘油三酯含量（TG）含量可降低20%。因此，當(dāng)利用NK 來進(jìn)行降血脂時，需使用較高的NK 劑量并延長治療時間。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，NK（100 mg/d）結(jié)合紅曲米（1200 mg/d）對高脂血癥患者的血脂控制更加有效[89-90]，這也為降血脂藥物的開發(fā)提供了新思路。

關(guān)于NK 降膽固醇血脂的機(jī)制現(xiàn)在研究的還比較少，Yoo 等[91]研究了發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充NK 對非糖尿病和高膽固醇血癥患者膠原-腎上腺素關(guān)閉時間、凝血酶原時間和活化部分凝血活酶時間的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NK可改變止血因子，NK 實(shí)驗(yàn)組的膠原-腎上腺素關(guān)閉時間、凝血酶原時間和活化部分凝血活酶時間明顯延長。

4.4 納豆激酶其它方面的功效

納豆激酶在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞預(yù)防阿爾茨海默?。ˋD）方面有明顯的功效。蛋白質(zhì)由正常的三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成淀粉樣結(jié)構(gòu)是AD 的重要表征，納豆激酶可通過減少蛋白淀粉樣結(jié)構(gòu)來治療阿爾茨海默病（AD）患者。在AD 大鼠模型中，口服NK 對降低AD 通路中乙酰膽堿酯酶（AchE）活性、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、Fas 和白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量的調(diào)節(jié)具有積極作用[91]。在秋水仙堿中毒引起的AD 認(rèn)知障礙的大鼠模型中，含有NK 的納米營養(yǎng)劑被證明能夠修復(fù)其受損的學(xué)習(xí)和記憶能力，并且可有效抑制β-淀粉樣蛋白和BACE-1 活性，從而表明NK 具有神經(jīng)保護(hù)作用[92]。與未經(jīng)治療的AD 對照組相比，在360 FU/kg 的劑量下，NK 可顯著降低TGF-β、IL-6 和p53 含量以及膽堿酯酶活性，增加Bcl-2 含量[93]。以上數(shù)據(jù)表明，NK 的神經(jīng)保護(hù)作用是由于其水解蛋白、抗炎和抗凋亡作用。

納豆激酶還可以有效地治療慢性鼻竇炎、玻璃體視網(wǎng)膜疾病和長時間飛行導(dǎo)致的疾病。納豆激酶可以通過水解纖維蛋白有效收縮慢性鼻竇炎患者的鼻息肉組織，進(jìn)而緩解慢性鼻竇炎所引起的哮喘，因此NK 有望成為慢性鼻竇炎鼻息肉和共病哮喘患者的有效替代治療方案[10]。NK 還可以用于治療增殖性玻璃體視網(wǎng)膜疾病患者，這一作用是由于NK 可誘導(dǎo)玻璃體后脫離（PVD）的有效性[94]。Flite Tabs（Aidan，AZ，USA）的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Pinokinase（碧蘿芷和納豆激酶的組合）可顯著改善長時間飛行導(dǎo)致的腿部腫脹、深靜脈血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）。此外，納豆激酶在抑制小鼠肝細(xì)胞癌（HCC）[95]、改善胰島素缺乏性2 型糖尿病大鼠腸道菌群失調(diào)[96]、用作醫(yī)療器械工具涂層預(yù)防手術(shù)中血栓并發(fā)癥的發(fā)生等方面也有重要的應(yīng)用[97]。

5 結(jié)論與展望

納豆激酶生產(chǎn)菌株目前已從食物和非食物中分離得到，與非食品來源相比，食品來源的生產(chǎn)菌株，尤其是來自于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的菌株在未來NK 的生產(chǎn)應(yīng)用中更具有競爭力。其中，Bacillus種屬產(chǎn)的纖溶酶因其高特異性及酶活性而引起廣泛關(guān)注。NK 可通過固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵來制備，并通過發(fā)酵優(yōu)化、基因工程和蛋白質(zhì)工程等進(jìn)行菌株改造來提高酶的產(chǎn)量、酶活性和穩(wěn)定性。然而，目前NK 的發(fā)酵產(chǎn)量還不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)，未來新菌株選育及改造仍是未來的努力方向?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)NK 在抗血栓、降血壓、降血脂、預(yù)防AD、治療鼻竇炎等方面具有明顯的生理功效，但是關(guān)于NK 的具體作用機(jī)制尤其是體內(nèi)的作用機(jī)制研究的仍比較少，限制了NK 的推廣使用。未來關(guān)于NK 的臨床實(shí)驗(yàn)研究、體內(nèi)作用機(jī)制研究將有助于推動NK 的進(jìn)一步進(jìn)展。此外，NK 突出的溶栓效果和抗出血傾向的特性，或許可成為COVID 患者（常存在凝血功能異常問題）的輔助治療方案[98-99]。