張 東，祖元?jiǎng)?，?彬，魏 亮，張思艷，姜守剛*

(1.東北林業(yè)大學(xué)，森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

腸癌(colorectal cancer，CRC)是目前發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，由于早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診后多已處于晚期。腸癌患者術(shù)后易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，且主要轉(zhuǎn)移部位為肝臟，在后續(xù)的治療過(guò)程中，化療成為主要手段。目前以卡培他濱為基礎(chǔ)的三聯(lián)藥物(卡培他濱+奧沙利鉑+亞葉酸)是腸癌肝轉(zhuǎn)移疾病治療時(shí)的一線(xiàn)藥物，但其毒副作用大，且易耐藥，一旦耐藥，患者預(yù)后極差，因此，急需發(fā)展新的高效低毒且不易耐藥的藥物組合。

藤黃是藤黃科植物藤黃[Hook.f.(clusi-aceae)]樹(shù)干分泌出的干燥樹(shù)脂，其主要成分是以藤黃酸為代表的呫噸酮類(lèi)化合物，為治療腫毒的臨床用藥。有研究表明，藤黃作為一種中藥可能通過(guò)促使腸癌細(xì)胞發(fā)生G2/M、S期阻滯，調(diào)節(jié)BAX、Bcl-2和p53蛋白的表達(dá)，來(lái)達(dá)到抗腸癌效果。目前，隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，我國(guó)多采用中西醫(yī)藥聯(lián)合的方法治療結(jié)直腸癌?；谔冱S治療腸癌具有高效低毒的優(yōu)勢(shì)，該試驗(yàn)探討了藤黃與卡培他濱聯(lián)合用藥對(duì)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。

1 材料與方法

儀器。FA1204B分析天平(濟(jì)南愛(ài)來(lái)寶儀器設(shè)備有限公司)；ST40R型離心機(jī)(上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司)；CX43生物顯微鏡(南京瞭望光電技術(shù)有限公司)；QP-80型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(濟(jì)南好寶來(lái)醫(yī)療器材有限公司)；SW-CJ-3F型生物工作臺(tái)(上海滬凈醫(yī)療器械有限公司)；Zf11-01型動(dòng)物飼養(yǎng)柜(東北林業(yè)大學(xué)植物藥工程研究中心設(shè)計(jì)監(jiān)制)。

試材。藤黃(亳州仁益中藥材銷(xiāo)售有限公司)；卡培他濱(CAS號(hào)154361-50-9)、AAF固定液(50%)、烏來(lái)糖(CAS號(hào) 51-79-6)，上海源葉生物科技公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、胰酶，HyClone公司； DMSO(碧云天生物技術(shù)公司)；優(yōu)級(jí)胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；結(jié)腸癌CT26.WT細(xì)胞(北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞中心)；清潔級(jí)BALB/c小鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院動(dòng)物中心)。

腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立。將造模所用的BALB/c小鼠隨機(jī)分組，稱(chēng)重并記錄。配制20%烏來(lái)糖溶液，以5 mL/kg的麻醉劑量麻醉小鼠。待小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，手術(shù)部位剃毛，將其放在超凈臺(tái)上。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26.WT細(xì)胞進(jìn)行消化、離心，加入適量生理鹽水制備成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10個(gè)/mL。采用脾臟種植法向小鼠脾臟內(nèi)緩慢注入CT26.WT細(xì)胞懸液0.l mL，查看無(wú)出血后將小鼠脾臟納回，用可吸收縫合針線(xiàn)全層縫合、包扎，待小鼠經(jīng)過(guò)麻醉時(shí)間并恢復(fù)意識(shí)后，常規(guī)飼養(yǎng)。

分組及給藥。將4～6周齡、體重20 g左右的雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(生理鹽水)、藤黃組、卡培他濱組、藤黃聯(lián)合卡培他濱組，每組6只。造模后第2天開(kāi)始，對(duì)照組和給藥組全部采用灌胃的方式連續(xù)給藥7 d，藤黃組給藥劑量為20 mg/kg，卡培他濱組給藥劑量為60 mg/kg，聯(lián)用組藥物分別按上述劑量同時(shí)給藥。

健康狀況觀察。觀察造模前后小鼠的體重變化和生存情況，每3 d稱(chēng)重一次，分析不同藥物對(duì)小鼠體重的影響，記錄小鼠的死亡時(shí)間，計(jì)算平均生存期，繪制生存曲線(xiàn)。

協(xié)同作用測(cè)定。待各組小鼠自然死亡后，解剖觀察肝臟表面及切面的轉(zhuǎn)移灶及腫瘤結(jié)節(jié)。由于轉(zhuǎn)移性腫瘤不易從肝臟剝離，稱(chēng)重肝臟也可以間接反映腫瘤的重量，計(jì)算腫瘤抑制率，公式如下：抑瘤率=(對(duì)照組肝重-給藥組肝重)/(對(duì)照組肝重-正常組肝重)×100%。

金氏公式是被用來(lái)評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥作用強(qiáng)度的公式，公式如下：

在該試驗(yàn)中，、和分別表示藤黃組、卡培他濱組和藤黃聯(lián)合卡培他濱組對(duì)模型小鼠的腫瘤抑制率。當(dāng)>1.15時(shí)，說(shuō)明藤黃和卡培他濱聯(lián)用會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，當(dāng)0.85≤≤115時(shí)，說(shuō)明藤黃和卡培他濱分別產(chǎn)生作用，當(dāng)<0.85時(shí)，說(shuō)明藤黃和卡培他濱聯(lián)用會(huì)產(chǎn)生拮抗作用。

病理學(xué)檢測(cè) 。給藥10 d后，每組隨機(jī)處死1只小鼠，解剖出完整肝臟并用生理鹽水清洗，觀察各組小鼠肝臟表面結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移情況并拍照。用4%的多聚甲醛溶液固定取出的小鼠肝臟12 ～14 h，經(jīng)過(guò)脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色、封片等一系列操作后，在顯微鏡下進(jìn)行病理觀察和分析，判斷不同藥物對(duì)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制情況。

2 結(jié)果與分析

造模后第1天，小鼠進(jìn)食、進(jìn)水量明顯減少，活動(dòng)量也減小。術(shù)后第3天，小鼠的精神狀態(tài)開(kāi)始逐漸恢復(fù)。待術(shù)后10 d左右小鼠又出現(xiàn)了攝食量減少的現(xiàn)象，并且小鼠腹部開(kāi)始隆起。術(shù)后第15天左右，小鼠開(kāi)始出現(xiàn)萎靡不振的精神狀態(tài)，行動(dòng)緩慢且反應(yīng)性降低，腹部隆起明顯。

建模后，每隔3 d測(cè)定并記錄小鼠的體重，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，各組小鼠的體重在造模后前3 d均出現(xiàn)了減輕的情況，其中藤黃組體重減輕最少。第3天起各組小鼠體重開(kāi)始逐漸增加，但是給藥組小鼠體重的增長(zhǎng)速度比對(duì)照組緩慢?？ㄅ嗨麨I組小鼠造模前后體重有所降低，而藤黃聯(lián)合卡培他濱組在造模期間體重變化不顯著，表明藤黃聯(lián)合卡培他濱組的毒副作用明顯比卡培他濱組的低。在術(shù)后第7天至術(shù)后第15天，各組小鼠的平均體重表現(xiàn)出一定的增長(zhǎng)，這是因?yàn)樵炷Ｐ∈蟾共块_(kāi)始出現(xiàn)血性腹水、體重增加。

圖1 模型小鼠的體重變化Fig.1 Weight change in model mice

各組小鼠均采用SPSS 17.0軟件中Kaplan-Meier法進(jìn)行生存期分析，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，對(duì)照組、藤黃組、卡培他濱組、藤黃聯(lián)合卡培他濱組的平均生存期分別為(18.00±1.41)、(23.33±3.08)、(27.17±3.66)、(30.83±3.06) d。藤黃聯(lián)合卡培他濱組與其他各組平均生存期均有顯著差異(<0.05)。這表明藤黃聯(lián)合卡培他濱可以有效延長(zhǎng)小鼠的生存期，有較好的抗結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移作用。

圖2 模型小鼠的生存期曲線(xiàn)Fig.2 Survival curve of model mice

待模型小鼠自然死亡后解剖，取出完整肝臟，計(jì)算各組小鼠的平均肝重，得到給藥組的抑瘤率，結(jié)果如表1所示。藤黃聯(lián)合卡培他濱組的平均肝重較藤黃組和卡培他濱組小(< 0.01)。藤黃組、卡培他濱組、藤黃聯(lián)合卡培他濱組的腫瘤抑制率分別為31.03%、40.52%、63.79%，經(jīng)過(guò)金氏公示測(cè)定，得到協(xié)同作用結(jié)果=1.08，說(shuō)明藤黃與卡培他濱聯(lián)合用藥沒(méi)有產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，但與單一用藥相比抑制腸癌肝轉(zhuǎn)移的效果比較顯著。

表1 各組小鼠肝臟重量、抑瘤率Table 1 Liver weight and tumor inhibition rate of mice in each group

各組小鼠解剖后的肝臟標(biāo)本結(jié)果如圖3所示，與正常小鼠對(duì)比，可以觀察到模型小鼠的肝臟中都分布了大小不等的灰白色腫瘤結(jié)節(jié)。對(duì)照組肝臟大部分被癌灶所浸潤(rùn)，藤黃組、卡培他濱組的肝臟的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量遠(yuǎn)少于對(duì)照組，藤黃聯(lián)合卡培他濱組的肝臟表面僅存在離散的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，并且轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目相對(duì)來(lái)說(shuō)較少于其他各組，這表明藤黃與卡培他濱聯(lián)用具有良好的抗腸癌肝轉(zhuǎn)移作用。

將各組模型小鼠解剖后，對(duì)其肝臟進(jìn)行病理切片分析，結(jié)果如圖4所示。對(duì)照組癌細(xì)胞成團(tuán)且數(shù)量較多，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制劇烈，給藥組肝組織中癌細(xì)胞團(tuán)數(shù)量呈現(xiàn)不同程度的減少且大小明顯減小，癌細(xì)胞較疏松，說(shuō)明藥物在一定程度上抑制了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其中藤黃聯(lián)合卡培他濱組肝組織中腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核與正常肝細(xì)胞的細(xì)胞核大小相似，抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制效果最好，即藤黃聯(lián)合卡培他濱組抗結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移作用最明顯。

注：A.對(duì)照組；B.藤黃組；C.卡培他濱組；D.藤黃聯(lián)合卡培他濱組 Note:A.Control group;B.Gambogic group;C.Capecitabine group;D.Gamboge combined with Capecitabine group 圖3 模型小鼠肝臟標(biāo)本Fig.3 Liver samples from model mice

該試驗(yàn)通過(guò)BALB/c小鼠脾臟種植CT26.WT細(xì)胞建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，研究藤黃與卡培他濱聯(lián)用時(shí)對(duì)小鼠腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。通過(guò)比較對(duì)照組和給藥組模型小鼠的體重變化、平均生存期、HE染色肝臟病理切片，發(fā)現(xiàn)藤黃與卡培他濱聯(lián)合使用時(shí)可以更好地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存期。因此，當(dāng)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者使用卡培他濱幾個(gè)療程產(chǎn)生耐藥后，可以考慮將藤黃與卡培他濱聯(lián)用，這為治療腸癌肝轉(zhuǎn)移提供了新的聯(lián)合給藥方法，有望明顯延長(zhǎng)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的生存期。

注：A.對(duì)照組；B.藤黃組；C.卡培他濱組；D.藤黃聯(lián)合卡培他濱組。圖中標(biāo)有a區(qū)域的部分屬于正常肝細(xì)胞，標(biāo)有b區(qū)域的部分屬于腫瘤細(xì)胞 Note:A.Control group;B.Gambogic group;C.Capecitabine group;D.Gamboge combined with Capecitabine group圖 4 模型小鼠HE染色肝臟病理切片F(xiàn)ig.4 HE-stained liver pathological sections of model mice