張國(guó)妤,盧 樂,黎巧信,陸宏偉

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，西安 710061；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科；*通訊作者,E-mail:luler2008@163.com)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生急性和慢性肝病，對(duì)全球人群的健康產(chǎn)生了巨大影響。人群感染HBV后，部分可逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?chronic hepatitis, CH)，在體內(nèi)免疫反應(yīng)的介導(dǎo)下，可逐漸發(fā)展為肝硬化(cirrhosis of liver, LC)、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，甚至重型肝炎[1]。HBV感染后能否被機(jī)體清除，與宿主的免疫功能強(qiáng)弱密切相關(guān)[2]。與免疫調(diào)節(jié)呈負(fù)性相關(guān)的幾個(gè)重要的免疫抑制性分子—程序性細(xì)胞死亡分子-1(programmed cell death-1, PD-1)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)、T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3, TIM-3)越來(lái)越受到人們的關(guān)注[3,4]。這些分子高表達(dá)后，可引起T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能下降，導(dǎo)致機(jī)體不足以抑制HBV的感染以及由這些感染造成的損傷[5]。

這些免疫抑制性分子不僅與病毒感染相關(guān)，也在腫瘤調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，參與腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的免疫逃逸和免疫應(yīng)答。許多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境能影響某些免疫調(diào)節(jié)因子的功能，而這些因子通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答進(jìn)而促進(jìn)或者抑制腫瘤生長(zhǎng)[6]。CTLA-4可以與T細(xì)胞表面的協(xié)同刺激分子受體(CD28)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原提呈細(xì)胞表面的CD80/86，抑制CD28傳導(dǎo)共刺激信號(hào)，阻止T細(xì)胞的增殖與活化。TIM-3則在維持免疫平衡和腫瘤免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，腫瘤細(xì)胞可利用該基因逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視[4,7]。

HBV感染機(jī)體以后的臨床轉(zhuǎn)歸和HCC的發(fā)生發(fā)展不僅與宿主的免疫功能有關(guān)，也與遺傳因素密切相關(guān)。而在遺傳因素中，許多基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與HBV感染的不同結(jié)局以及HBV感染相關(guān)性HCC相關(guān)[8,9]。在以前研究中，已證實(shí)CTLA-4 +49基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)，TIM-3 -1516 G/T基因多態(tài)性與HBV感染和HCC相關(guān)[8,9]。本研究擬進(jìn)一步探討二者聯(lián)合與HBV感染及HCC的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源

收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年8月至2013年6月慢性HBV感染者439例(男333例，女106例)，年齡(39.34±13.16)歲。所有病例的診斷均符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除合并其他肝臟疾病(甲型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎、藥物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、Wilson’s病)、可引起機(jī)體發(fā)生高代謝的疾病(包括糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征、甲狀腺功能亢進(jìn))、伴隨嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及腎功能損害和年齡不滿18歲的患者。439例HBV感染者的臨床分型為無(wú)癥狀攜帶者(asymptomatic carriers，ASC)48例，慢性肝炎154例，肝硬化134例和肝癌103例。健康對(duì)照者220例(男163例，女57例)，為中國(guó)陜西籍或長(zhǎng)期居住在陜西地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系的健康獻(xiàn)血員和健康體檢者，年齡(38.68±14.09)歲。兩組間年齡和性別的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對(duì)象均知情同意和自愿參加。

1.2 主要試劑

購(gòu)買北京天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)買西安潤(rùn)德生物技術(shù)有限公司的2×Taq PCR Mix，購(gòu)買大連寶生物工程有限公司DNA Marker。

1.3 DNA提取

所有受試者清晨空腹抽全血2 ml，用EDTA抗凝，-20 ℃保存待提取人類基因組DNA。用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。按說(shuō)明書操作步驟如下：①取200 μl加入EDTA抗凝劑的血液，加入1.5 ml的離心管中，向管中加入20 μl蛋白酶K溶液，混勻。②加入200 μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 ℃放置10 min。③加入200 μl無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15 s。④將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。⑤向吸附柱CB3中加入500 μl緩沖液GD(已加入無(wú)水乙醇)，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑥向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW(已加入無(wú)水乙醇)，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。⑧將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。⑨將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200 μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。離心管中收集的液體即是洗脫下來(lái)的基因組DNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因型分析

CTLA-4 +49 A/G(rs231775)和TIM-3 -1516 G/T(rs10053538)多態(tài)性的基因型分別采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)進(jìn)行分析[9,10]。引物序列、內(nèi)切酶、產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

表1 CTLA-4和TIM-3基因多態(tài)性使用的引物序列、內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

使用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：DNA 6.0 μl，2×Master Mix 12.5 μl，上下游引物各1.0 μl，ddH20 4.5 μl，總體系25 μl；反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，64 ℃(CTLA-4 +49 A/G)或59 ℃(TIM-3 -1516 G/T)退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸10 min，共30個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 16.0軟件(SPSS，Inc.，Chicago，IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；蛐皖l率用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)分析基因型頻率、等位基因頻率在HBV感染組與對(duì)照組的分布情況以及在肝癌組與非肝癌組的分布情況。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTLA-4和TIM-3的基因型和等位基因

HBV感染組的CTLA-4 +49 GA、AA基因型和含A基因型(GA+AA)頻率高于對(duì)照組(P<=0.001)。HBV感染組的CTLA-4 +49 A等位基因頻率高于對(duì)照組(P<0.001)。HBV感染組的TIM-3 -1516 GT基因型和含T基因型(GT+TT)頻率高于對(duì)照組(P<0.001)。HBV感染組的TIM-3 -1516 T等位基因頻率高于對(duì)照組(P=0.002，見表2)。

表2 CTLA-4和TIM-3基因型和等位基因頻率分析 頻次(%)

2.2 CTLA-4和TIM-3基因型的聯(lián)合作用

以HBV易感基因型CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GT+TT作為參照，基因型組合在HBV感染組和對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。由于CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GT+TT基因型數(shù)量太少，將CTLA-4 +49 AA和AG基因型合并后，CTLA-4 +49 AA+AG/TIM-3 -1516 GG、CTLA-4 +49 GG/TIM-3 -1516 GG基因型組合在HBV感染組中的分布頻率低于對(duì)照組(分別為P=0.048和P<0.001，見表3)，即基因型組合CTLA-4 +49 AA+AG/TIM-3 -1516 GT+TT在HBV感染組中的分布頻率更高。

表3 CTLA-4和TIM-3在HBV感染組和對(duì)照組的基因型組合頻率分析 頻次(%)

2.3 CTLA-4和TIM-3基因型和等位基因與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系

將HBV感染組按疾病嚴(yán)重程度分為無(wú)癥狀攜帶者(ASC)組、慢性肝炎(CH)組、肝硬化(LC)組和肝癌(HCC)組，CTLA-4 +49基因型和等位基因頻率在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TIM-3 -1516在各組間無(wú)顯著性差異(見表4)。

表4 CTLA-4和TIM-3在乙肝不同臨床診斷組的基因型和等位基因頻率分析 頻次(%)

TIM-3 -1516基因型和等位基因進(jìn)一步組間分析，HCC組的GT+TT基因型頻率高于CH組(P=0.039,OR=1.923,95%CI 1.027～3.603)。HCC組的T等位基因頻率高于CH組(P=0.034,OR=1.869,95%CI 1.039～3.361)。提示攜帶有T的基因型(GT+TT)和T等位基因可能與肝癌相關(guān)。

CTLA-4 +49基因型和等位基因進(jìn)一步組間分析，ASC組的GA、AA、GA+AA基因型頻率高于HCC組(分別為P=0.005,OR=3.279,95%CI 1.387～7.752;P=0.002,OR=4.821,95%CI 1.670～13.918和P=0.001,OR=3.637,95%CI 1.599～8.274)，CH組的GA、AA、GA+AA基因型頻率高于HCC組(分別為P<0.001,OR=2.842,95%CI 1.610～5.017;P=0.007,OR=2.892,95%CI 1.313～6.373；P<0.001,OR=2.854,95%CI 1.662～4.900)，LC組的GA、AA、GA+AA基因型頻率高于HCC組(P=0.028,OR=1.885,95%CI 1.068～3.328;P=0.041,OR=2.260,95%CI 1.024～4.988；P=0.012,OR=1.972,95%CI 1.154～3.371)。ASC組的A等位基因頻率高于HCC組(P=0.001,OR=2.250,95%CI 1.373～3.689)，CH組的A等位基因頻率高于HCC組(P=0.001,OR=1.813,95%CI 1.258～2.613)，LC組的A等位基因頻率高于HCC組(P=0.016,OR=1.586,95%CI 1.088～2.311)。提示GG基因型和G等位基因可能與肝癌相關(guān)。

2.4 CTLA-4和TIM-3基因型組合與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系

以肝癌相關(guān)基因型CTLA-4 +49GG/TIM-3 -1516 GT+TT作為參照，基因型組合在各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表5)。進(jìn)一步組間分析，CTLA-4 +49 GA/TIM-3 -1516 GG和CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GG基因型組合在CH組的分布頻率高于HCC組(分別為P=0.001,OR=5.214,95%CI 1.822～14.921和P=0.007，OR=4.924，95%CI 1.484～16.340)。

表5 CTLA-4和TIM-3在乙肝不同臨床診斷組的基因型組合頻率分析 頻次(%)

由于CTLA-4 +49 GG/TIM-3 -1516 GT+TT基因型組合例數(shù)太少(在ASC組為0)，進(jìn)一步將攜帶有CTLA-4 +49肝癌相關(guān)基因，即GG和GA基因型合并，基因型組合在各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表5)。進(jìn)一步組間分析，CTLA-4 +49 GG+GA/TIM-3 -1516 GG、CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GT+TT和CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GG基因型組合在ASC組的分布頻率高于HCC組(分別為P=0.023,OR=4.000,95%CI 1.122～14.256;P=0.010,OR=12.000,95%CI 1.392～103.480和P=0.008,OR=6.545,95%CI 1.477～29.009)。CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GG基因型組合在CH組的分布頻率高于HCC組(P=0.031，OR=2.727，95% CI 1.082～6.876)。

2.5 CTLA-4和TIM-3基因型與肝癌的關(guān)系

以HCC易感基因型CTLA-4 +49 GG作為參照，非HCC組(ASC、CH和LC患者)的GA基因型和AA基因型頻率高于HCC組(分別為P<0.001和P=0.003)。以HCC易感基因型TIM-3 -1516 GT+TT作為參照，非HCC組的GG基因型頻率高于HCC組(P=0.042，見表6)。

表6 CTLA-4和TIM-3基因型頻率與肝癌的關(guān)系 頻次(%)

進(jìn)一步基因型組合分析，CTLA-4 +49 GA/TIM-3 -1516 GG和CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GG基因型組合在非HCC組的分布頻率高于HCC組(分別為P=0.001和P=0.003，見表7)。

表7 CTLA-4和TIM-3基因型組合頻率與肝癌的關(guān)系 頻次(%)

3 討論

CTLA-4是由CTLA-4基因編碼的一種跨膜蛋白質(zhì)，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞表面，與T細(xì)胞表面的協(xié)同刺激分子受體(CD28)競(jìng)爭(zhēng)，抑制T細(xì)胞的增殖與活化。其外顯子1的+49位點(diǎn)A/G突變會(huì)導(dǎo)致丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸，并增加了CTLA-4 mRNA和蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)T細(xì)胞活化的抑制作用[11]。CTLA-4 +49 A等位基因可能通過增加細(xì)胞表面CTLA-4的表達(dá)來(lái)抑制T細(xì)胞的增殖和活化，增加HBV的易感性[10]。TIM-3也是一種負(fù)性調(diào)節(jié)分子，表達(dá)于Th1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)、CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞等，與配體半乳糖苷酶結(jié)合蛋白9(galectin-9，Gal9)結(jié)合，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和免疫耐受[12,13]。位于TIM-3啟動(dòng)子區(qū)的-1516 G/T位點(diǎn)可能通過調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子，與疾病的易感性或耐受性有關(guān)[14,15]。本研究結(jié)果也證實(shí)CTLA-4 +49 AA基因型和A等位基因與慢性HBV感染發(fā)生相關(guān)，TIM-3 -1516含T基因型(GT+TT)和T等位基因也與HBV感染相關(guān)?；蛐徒M合進(jìn)一步增加了HBV感染的風(fēng)險(xiǎn)。CTLA-4 +49 AA+AG/TIM-3 -1516 GT+TT基因型組合分別增強(qiáng)了慢性乙型肝炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),與CTLA-4 +49 AA+GG相比，OR從1.924增至4.131，與TIM-3 -1516 GG+TT基因型相比，OR從2.263增至4.131。因此，CTLA-4 +49基因與TIM-3 -1516基因結(jié)合時(shí)，它們的相互作用可能增加HBV感染的易感性。

免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生的調(diào)控中起著重要作用，參與腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的免疫逃逸和免疫應(yīng)答。許多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境可以影響某些免疫調(diào)節(jié)因子的功能，這些因子通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)[16,17]。CTLA-4和TIM-3均屬于這一重要的免疫調(diào)節(jié)因子。降低CTLA-4的表達(dá)可增強(qiáng)T細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能和抗癌能力。位于CTLA-4外顯子區(qū)的+49位點(diǎn)基因多態(tài)性同樣會(huì)通過影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列而影響CTLA-4蛋白的表達(dá)，在肺癌、結(jié)直腸癌以及肝癌等腫瘤中均有研究，CTLA-4 +49GG基因型和G等位基因與肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌的易感性相關(guān)[18-20]。TIM-3也與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、臨床分期和腫瘤浸潤(rùn)密切相關(guān)，高水平TIM-3預(yù)示腫瘤惡性度較高，患者的總體生存率更低且預(yù)后差[21,22]。而TIM-3的基因多態(tài)性也與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。胃癌患者的TIM-3 -574G/T，-882C/T、-1516G/T基因多態(tài)性與胃癌顯著相關(guān)，+4259 G/T基因型與胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[23]。TIM-3 -1516G/T多態(tài)性也與HCC的一些性狀相關(guān)，包括腫瘤分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[9]。近期，也有一項(xiàng)meta分析證實(shí)，TIM-3 -1516 G/T基因位點(diǎn)與人類許多癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[24]。本研究結(jié)果與上述結(jié)果也是一致的。CTLA-4 +49 GG基因型、G等位基因，TIM-3 -1516含T基因型(GT+TT)和T等位基因與HCC的發(fā)生相關(guān)。當(dāng)CTLA-4和TIM-3基因型組合后，基因型組合也增加了HCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。CTLA-4 +49 GG/TIM-3 -1516 GT+TT基因型組合分別增強(qiáng)了HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),與CTLA-4 +49 GG基因型相比，OR從2.798增至4.032，與TIM-3 -1516 GT+TT基因型相比，OR從1.725增至4.032。

但是，本研究也存在不足之處：首先，研究樣本比較小，HBV感染組為439例，因此，在進(jìn)一步分組和基因分型后，每個(gè)組別的例數(shù)比較少，有些組別數(shù)只有1個(gè)或0個(gè)，在分析時(shí)需要將這些組與其他組合并后進(jìn)行分析。第二，本研究為單中心研究，研究隊(duì)列僅為西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究人群，大規(guī)模的多中心的病例對(duì)照研究將會(huì)更有說(shuō)服力。

總之，CTLA-4和TIM-3的表達(dá)水平、遺傳變異與慢性HBV感染和HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為從基因水平探討HBV感染易感性、疾病進(jìn)展以及結(jié)局提供依據(jù)。在本研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行大樣本多中心的隊(duì)列研究，探討多個(gè)基因的協(xié)同或阻遏作用，有助于從多基因角度了解HBV感染發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，為HBV感染基于基因信息的個(gè)體化防治提供新的策略。