譚韓英，高 丹，謝冬娣，陳振林，李淑梅，韋佳萍

(賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899)

紅瓜子是籽用西瓜的種子，其殼呈紅色，其仁富含蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷和多種維生素[1-2]。紅瓜子仁粗脂肪含量在40%左右，油中不飽和脂肪酸含量達(dá)79%[3], 可作為一種優(yōu)質(zhì)的食用植物油進(jìn)行開發(fā)。

水酶法提油雖然在提取過程中易形成乳化層，對(duì)提取率有一定的影響[4]，但由于其具有提取溫度比較低、易于處理、污染少等優(yōu)勢，在花生油[5]、椰子油[6]、南瓜籽油[7]、蓖麻籽油[8]等方面均有研究報(bào)道。此外，研究發(fā)現(xiàn)水酶法提取的花生油[9]、大豆油[10]、橄欖油[11]等與壓榨法、溶劑浸出法的相比，油脂的風(fēng)味物質(zhì)得到較好的保留。

揮發(fā)性物質(zhì)是形成植物油風(fēng)味的重要成分，是判斷植物油質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)，也可以作為油脂貯藏期品質(zhì)變化的指標(biāo)[12]。目前對(duì)揮發(fā)性成分檢測使用的方法主要有頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用 (HS-SPME-GC-MS)[13-14]、氣相-離子遷移譜(GC-IMS)[15]、氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-O-MS)[16]等。目前尚未有對(duì)水酶法提取紅瓜子仁油工藝及其揮發(fā)性成分的研究，因此本文以紅瓜子為原料，對(duì)水酶法提取紅瓜子仁油工藝條件進(jìn)行研究，并采用頂空氣相色譜-離子遷移譜(HS-GC-IMS)對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，為水酶法提取紅瓜子仁油提供一定技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅瓜子，賀州信都。堿性蛋白酶 Alcalase 2.4L(酶活 2.4 AU/g)，丹麥諾維信公司；氫氧化鈉(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；石油醚(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；1 mol/L鹽酸溶液，廣州和為醫(yī)藥科技有限公司。

FW100高速萬能粉碎機(jī)；HWS電熱恒溫水浴鍋；EX224ZH電子天平；SZC-C脂肪測定儀；TDL-5C低速大容量離心機(jī)；BPG-9070A精密鼓風(fēng)干燥箱；FlavourSpec?風(fēng)味分析儀， 德國G.A.S.公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅瓜子仁油的水酶法提取工藝

紅瓜子→剝殼取仁→烘干(80℃，2 h)→粉碎(15 s)→取5.0 g紅瓜子仁粉并加水(料液比1∶5)→加酶并在設(shè)定條件下酶解→升溫滅酶(100℃，15 min)→離心(5 000 r/min，10 min)→紅瓜子仁油。

1.2.2 紅瓜子仁油提取率的計(jì)算

紅瓜子仁油提取率(Y)按式(1)計(jì)算。

Y=m1/m0×100%

(1)

式中：m1為提取的紅瓜子仁油質(zhì)量；m0為紅瓜子仁中油的質(zhì)量。

1.2.3 紅瓜子仁油揮發(fā)性成分分析

采用HS-GC-IMS分析紅瓜子仁油的揮發(fā)性成分。

1.2.3.1 樣品制備

以最佳提取工藝提取的紅瓜子仁油，貯藏期0 d，作為樣品1(編號(hào)為HGZY-1)；將紅瓜子仁油置于4℃冰箱中存放1年，作為樣品2(編號(hào)為HGZY-2)。

1.2.3.2 樣品處理

取2.0 mL油樣于20 mL頂空瓶中，在500 r/min、60℃下孵育15 min后進(jìn)樣。

1.2.3.3 GC-IMS 分析條件

MXT-5色譜柱(15 m×0.53 mm×0.25 μm)；柱溫60℃；IMS溫度45℃；分析時(shí)間20 min；自動(dòng)進(jìn)樣量500 μL；進(jìn)樣針溫度85℃；載氣E1(漂移氣)流速150 mL/min；載氣E2(氣相載氣)流速為0～2 min 2 mL/min，2～10 min 10 mL/min，10～20 min 100 mL/min。通過儀器內(nèi)置NIST氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫和IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水酶法提取紅瓜子仁油單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶添加量對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響

在pH 9、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3 h條件下，按1.2.1方法提取紅瓜子仁油，考察堿性蛋白酶添加量對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 酶添加量對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，紅瓜子仁油提取率逐漸增加然后趨于平緩，當(dāng)酶添加量為5%時(shí)，紅瓜子仁油提取率最高。這是因?yàn)槊柑砑恿吭蕉?，酶與底物反應(yīng)越充分，蛋白質(zhì)被酶解，與蛋白質(zhì)結(jié)合的油脂被釋放，使紅瓜子仁油提取率增加，但當(dāng)酶與底物達(dá)到飽和時(shí)，酶添加量增多并不能使紅瓜子仁油提取率增加。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響

在堿性蛋白酶添加量3%、pH 9、酶解溫度50℃條件下，按1.2.1方法提取紅瓜子仁油，考察酶解時(shí)間對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長，紅瓜子仁油提取率先快速增加后趨于平緩，當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，紅瓜子仁油提取率最高。這是由于延長酶解時(shí)間，紅瓜子仁中的蛋白質(zhì)不斷被酶解，油脂得到充分釋放，油脂提取率不斷增大，但隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長，底物與酶結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和，提取率不再增加。

2.1.3 酶解溫度對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響

在堿性蛋白酶添加量3%、pH 9、酶解時(shí)間3 h條件下，按1.2.1方法提取紅瓜子仁油，考察酶解溫度對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，紅瓜子仁油提取率不斷增加，在酶解溫度為50℃時(shí)達(dá)到最高，之后隨著酶解溫度的繼續(xù)升高紅瓜子仁油提取率降低。這是因?yàn)闇囟葘?duì)酶催化反應(yīng)速率的影響有雙重效應(yīng)，溫度升高，反應(yīng)速率加快，達(dá)到酶最適反應(yīng)溫度時(shí)，酶的活性發(fā)揮到最高，但隨著溫度的繼續(xù)升高，酶逐漸變性，催化反應(yīng)速率下降[17]。

2.1.4 pH對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響

在堿性蛋白酶添加量3%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3 h條件下，按1.2.1方法提取紅瓜子仁油，考察pH對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 pH對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響

由圖4可知，pH為9時(shí)，紅瓜子仁油提取率最高。pH影響酶的活性，酶在最適pH條件下催化活性最高，pH過低或過高都會(huì)引起酶變性而失活。另外試驗(yàn)過程中觀察到pH為7、8時(shí)，乳化現(xiàn)象相對(duì)嚴(yán)重。

2.2 水酶法提取紅瓜子仁油正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶添加量(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)、pH(D)為因素，以紅瓜子仁油提取率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)水酶法提取紅瓜子仁油的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2和表3可知，各因素對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響大小順序?yàn)镈 (pH)>A(酶添加量)>C(酶解溫度)>B(酶解時(shí)間)，且各因素對(duì)紅瓜子仁油提取率的影響均極顯著，最佳提取條件為A2B2C2D2。在最佳提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，紅瓜子仁油提取率為76.67%，將其結(jié)果與試驗(yàn)方案A2B1C2D3、A3B1C3D2、A1B2C2D2的結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明，A2B2C2D2與A2B1C2D3、A3B1C3D2試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著，考慮到提取時(shí)間越長、酶用量越多，成本更高，因此確定最佳提取條件為A2B1C2D3，即酶添加量5%、酶解時(shí)間3 h、酶解溫度50℃、pH 10，在此條件下紅瓜子仁油提取率為75.68%。

2.3 紅瓜子仁油揮發(fā)性成分

2.3.1 新鮮紅瓜子仁油揮發(fā)性成分

按照1.2.3方法對(duì)水酶法提取的新鮮紅瓜子仁油進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，結(jié)果見表4。由表4可知，紅瓜子仁油中共鑒定出25 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括13種醛類、8種酮類、2種醇類、2種萜類，揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量與大豆油、玉米油[18]相近。

2.3.2 不同貯藏時(shí)間下紅瓜子仁油揮發(fā)性成分的指紋圖譜

按照1.2.3方法對(duì)貯藏0 d和1年的紅瓜子仁油進(jìn)行揮發(fā)性成分分析(每個(gè)樣品平行測定3次)，并制作指紋圖譜，結(jié)果如圖5所示。圖5中顏色越深表示揮發(fā)性成分的含量越高。

由圖5可知，兩種紅瓜子仁油樣品的揮發(fā)性物質(zhì)含量存在明顯差異。A區(qū)域物質(zhì)在1號(hào)樣品(HGZY-1,貯藏時(shí)間0 d)中含量最高，明顯大于2號(hào)樣品(HGZY-2,貯藏時(shí)間1年)，可作為特征揮發(fā)性成分用于區(qū)分樣品間差異的主要物質(zhì)是 3-甲基-1-丁醇和3-羥基-2-丁酮；B區(qū)域物質(zhì)在2號(hào)樣品中的含量明顯高于1號(hào)樣品中的，主要為3-甲基丁醛、丁醛、戊醛、β-蒎烯、2-丁酮、丙酮、2-戊酮、E-2-庚烯醛、己醛、2-庚酮、庚醛、3-甲基-2-丁烯醛、2-辛酮和2-甲基丙烯醛等。上述結(jié)果說明貯藏時(shí)間對(duì)紅瓜子仁油揮發(fā)性物質(zhì)的含量有一定影響，可結(jié)合揮發(fā)性成分分析的相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步研究貯藏期間各揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，為紅瓜子仁油貨架期預(yù)測提供參考。

圖5 不同紅瓜子仁油樣品揮發(fā)性成分的指紋圖譜

3 結(jié) 論

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，獲得水酶法提取紅瓜子仁油最佳工藝條件，即料液比1∶5、堿性蛋白酶添加量5%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3 h、pH 10，在此條件下紅瓜子仁油提取率為75.68%。本研究過程中發(fā)現(xiàn)水酶法提取紅瓜子仁油存在一定的乳化現(xiàn)象，如果能找到合適的方法破乳，將進(jìn)一步提高油脂提取率。通過HS-GC-IMS技術(shù)鑒定出紅瓜子仁油中主要的揮發(fā)性成分有25種，其中 3-羥基-2-丁酮和 3-甲基-1-丁醇可初步確定為新鮮紅瓜子仁油揮發(fā)性成分的標(biāo)志物。貯藏時(shí)間影響紅瓜子仁油中揮發(fā)性物質(zhì)的組成及含量，通過研究紅瓜子仁油貯藏期間揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，可以為預(yù)測紅瓜子仁油貨架期提供參考。