劉淑琴 王浩豪 武艷群 孟俊龍 常明昌 王術(shù)榮

(山西農(nóng)業(yè)大學，太谷，030801)(晉城市綜合檢驗檢測中心)(山西農(nóng)業(yè)大學)

铦囊蘑屬(MelanoleucaPat.)隸屬于傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)[1]。1897年法國著名真菌學家Patouillard[2]正式創(chuàng)建了铦囊蘑屬，該屬真菌是單系起源。1991年Bon[3]將铦囊蘑屬劃分成Acystis、Urticocystis和Melanoleuca3個亞屬，Acystis亞屬不具囊狀體，Urticocystis亞屬有蕁麻狀至完整燒瓶狀的囊狀體，Melanoleuca亞屬有大型的梭形至燒瓶形的囊狀體。2011年Vizzini et al.[4]的研究初步印證了Bon的劃分結(jié)果，并因Acystis亞屬是多系起源而否定了該亞屬的存在，同時Aysenur Kalmer et al.[5]的研究也否定了Acystis亞屬的存在?；谀壳暗难芯?，铦囊蘑屬主要分為Urticocystis和Melanoleuca2個亞屬。

近些年，我國學者對中國铦囊蘑屬的物種進行了許多研究。2000年卯曉嵐[6]在《中國大型真菌》中報道了12種铦囊蘑，2000年Yang[7]發(fā)表了新種Melanoleucademangei；2014年Yu et al.[8]報道了在遼寧省發(fā)現(xiàn)的白柄铦囊蘑(M.leucopoda)和紫柄铦囊蘑(M.porphyropoda)兩個新種；2019年都靜[9]通過對東北地區(qū)14種铦囊蘑DNA條形碼的研究，確定了ITS基因可以作為铦囊蘑屬理想的DNA條形碼，并對其進行了詳細描述；2019年徐濟責[10-11]發(fā)表了盔孢铦囊蘑(M.galerinaspora)等4個新種和10個中國新記錄種；2021年P(guān)ei et al.[12]發(fā)表了在內(nèi)蒙古、遼寧省發(fā)現(xiàn)的M.chifengense，M.griseoflava和M.pallidorosea3個新種。

歷山國家自然保護區(qū)位于山西省中條山東段，地處沁水、翼城、陽城和垣曲4縣交界處(111°51′～112°5′E，35°16′～35°27′N)，海拔620～2 358 m，主峰舜王坪海拔高達2 380 m[13]，自然植被以溫帶、暖溫帶落葉、闊葉、針葉林和落葉灌木為主。2014年，袁海生等[14]對山西歷山和龐泉溝自然保護區(qū)的木生真菌進行了調(diào)查研究，列出123種木生真菌，并發(fā)現(xiàn)了3種我國木生真菌新記錄種齒狀真菌棉毛纖刺皮菌(Fibrodontiagossypina)、鈣生棕絨毛菌(Tomentellacalcicole)和孔狀真菌白褐叉絲孔菌(Dichomitusalbidofuscus)。2020年，劉洋等[15]在歷山發(fā)現(xiàn)了山西省新記錄物種堿紫漏斗杯傘(Infundibulicybealkaliviolascens)。目前我國對山西省歷山國家自然保護區(qū)傘菌的研究相對較少。2018年9月，在歷山國家自然保護區(qū)發(fā)現(xiàn)铦囊蘑屬一物種，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定其為中國新記錄種M.dirensis，此種曾在2017年被Farzana Nawaz et al.[16]發(fā)現(xiàn)和描述。本文對其進行了詳細的形態(tài)描述，并將其與相近種進行了比較和分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2018年9月在山西省歷山國家自然保護區(qū)采集到的一份铦囊蘑屬標本G12076，現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學菌物標本館(HMSAU)。

1.2 生態(tài)學和形態(tài)學研究

標本在采集前拍照記錄其在自然狀態(tài)下的生長情況，并記錄其生態(tài)、生境特點。對新鮮的標本及時進行宏觀特征的觀察記錄，包括子實體形態(tài)、菌蓋顏色、大小、形狀、表面特征；菌柄顏色、長度、基部是否膨大和表面特征；菌褶顏色、著生方式等。對干標本的菌褶和菌柄進行徒手切片，在質(zhì)量分數(shù)5% KOH溶液中復(fù)水，用Nikon Eclipse Ni-U光學顯微鏡觀察并記錄其微觀特征，包括擔孢子的形態(tài)和大小，擔子、囊狀體的形態(tài)和大小，囊狀體頂端是否有結(jié)晶包被，菌絲是否具有鎖狀聯(lián)合等。觀察擔孢子時隨機選取30個擔孢子測量長、寬，計算孢子大小范圍，Q值，Xav值，其中Q=長/寬，Xav=lav×wav，lav表示所測量個體長的平均值，wav表示所測量寬的平均值[17]。

1.3 DNA提取

取7 mg子實體，使用E.Z.N.A.?Forensic DNA Kit試劑盒(Omega)，按照說明步驟提取DNA。提取后的DNA經(jīng)超微量高精度紫外可見光分光光度計測定濃度，于-20 ℃條件下保存，備用。

1.4 PCR擴增和產(chǎn)物測序

以總DNA為模板，使用引物ITS8F/LR3進行ITS區(qū)的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增。PCR擴增反應(yīng)25 μL體系：DNA模板2 μL，5 μmol/L上、下游引物各1 μL，2×Easy Taq PCR SuperMix(+dye)11 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴增程序：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸5 min。將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳程序為100 V，45 min。PCR擴增產(chǎn)物用E.Z.N.A.?Cycle-Pure Kit試劑盒(Omega)純化后送擎科生物科技有限公司西安分公司進行正、反向測序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將獲得的標本ITS序列在MEGA X[18-19]軟件中進行復(fù)檢，經(jīng)過人工校正排除程序誤讀，然后和從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的近似種序列構(gòu)成數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集以柳光柄菇Pluteussalicinus為外類群，在MEGA X軟件中通過Clustal W程序進行校對和序列長度處理，然后進行模型選擇，選擇的最佳模型為Tamura 3-parameter，采用最大似然法[20](Maximum Likehood Method，ML)，自舉值1 000次建ML樹。

用PAUP、MrModelTest、ModelTest對片段模型進行選擇，基于赤池系數(shù)(AIC，Akaike Information Criterion)和貝葉斯系數(shù)(BIC，Bayesian information criterion)進行對數(shù)似然的線性擬合，然后進行模型選擇，選擇的最佳模型為GTR+I，采用貝葉斯分析法[21](Bayesian Inference，BI)，用軟件MrBayes 3.2.6建MrBayes樹，最后用軟件Figtree v1.4對進化樹進行后續(xù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學分析

擔子果(圖1A)口蘑狀，中等。菌蓋直徑3.2～4.3 cm，菌蓋中央灰褐色，向邊緣顏色逐漸變淺，表面干燥，光滑，無毛，菌蓋邊緣內(nèi)卷。菌褶(圖1B)近白色，直生，密集，邊緣波狀，菌肉白色。菌柄(圖1C)長5.2～6.8 cm，直徑0.3～0.5 cm，菌柄上部黃棕色，向基部逐漸變白中空，有縱向條紋，纖維狀?；烤z白色，豐富。

孢子(圖2A，B)(6.5～9.1)μm×(3.6～5.9)μm，Q=1.6，Xav=7.5 μm×4.6 μm，橢圓形，無色透明有疣狀物，薄壁，淀粉質(zhì)，一端有小尖。擔子(圖2C，D)(20.4～29.2)μm×(6.3～10.3)μm，棒狀，無色，薄壁，具2～4個擔子小梗。緣囊體(圖2F)(43.6～63.1)μm×(9.6～17.5)μm，紡錘形至燒瓶形，無間隔，頂端未見結(jié)晶包被，側(cè)囊體與緣囊體相似。柄囊體(圖2E)(43.1～63.0)μm×(5.5～7.7)μm，燒瓶形，無間隔，頂端有結(jié)晶。菌蓋表皮細胞菌絲狀，菌絲直徑5.9～12.3 μm，圓柱形，有隔膜，有分枝。菌柄表皮細胞菌絲狀，菌絲直徑4.8～10.8 μm，圓柱形，透明，有隔膜，有分枝。無鎖狀聯(lián)合。

生長環(huán)境：夏末單生于落葉松下。

分布地：亞洲(中國，巴基斯坦)[16]。

研究標本：山西省歷山國家自然保護區(qū)沁水縣下川村，采集號G12076，采集人王術(shù)榮和郭富寬，采樣時間2018年9月3日。

(A)中央灰褐色的菌蓋；(B)白色的菌褶；(C)上部黃棕色，向基部逐漸變白的中空的菌柄；標尺=1 cm。

A、B.擔孢子；C、D.擔子；E.柄囊狀體；F.緣囊狀體；標尺=10 μm。

2.2 分子系統(tǒng)學分析結(jié)果

通過DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)特異性擴增和人工復(fù)檢后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進行比對發(fā)現(xiàn)，本研究標本的ITS序列與Melanoleucadirensis(序列號：KU575243)的序列相似度高達99.84%。基于M.dirensis及其相似種的ITS序列，采用最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可以看出，本文所描述物種與M.dirensis(KU556797、KU575243)聚在一起，并有85最大似然支持率和0.99貝葉斯支持率。

發(fā)育樹以柳光柄菇Pluteus salicinus為外類群，節(jié)點支持值由最大似然百分數(shù)與貝葉斯支持率共同組成，并且僅顯示大于50%最大似然支持率或0.5貝葉斯支持率的值。

3 結(jié)論與討論

铦囊蘑屬的主要特點是擔子果金錢菌狀至口蘑狀，菌蓋凸至輕微下凹，有奶白色或近黃色、灰棕色、黃棕色至黑棕色，少數(shù)顏色明亮。孢子無色淀粉質(zhì)有疣狀物；緣囊體有燒瓶形、紡錘形，蕁麻狀，蕁麻狀囊狀體一般頂端有結(jié)晶；側(cè)囊體與緣囊體相似；無鎖狀聯(lián)合。目前，大多學者都認可铦囊蘑屬包括Urticocystis和Melanoleuca2個亞屬。兩個亞屬的主要區(qū)別是Urticocystis亞屬中緣囊體蕁麻狀至完整的燒瓶形，有間隔。Melanoleuca亞屬中有大型的梭形至燒瓶形的囊狀體，沒有間隔。

本研究標本囊狀體沒有間隔，顯然屬于Melanoleuca亞屬。通過系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，本文所描述物種與2017年Farzana Nawaz[16]發(fā)表的新種模式種M.dirensis(KU575243)聚類在同一分枝，具有85/0.99的支持率。在宏觀形態(tài)上，研究標本與模式標本相比較，除菌蓋較模式標本略小外，其他宏觀特征均相似，這可能與環(huán)境條件有關(guān)。在微觀形態(tài)上，兩者的擔子、側(cè)囊體和緣囊體大小都接近。孢子大小也極為接近，本研究標本的長寬比均值(1.58)略大于模式標本(1.31)，這可能與測量誤差或環(huán)境因子有關(guān)。通過形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，確定其為铦囊蘑屬中國新記錄種下迪铦囊蘑(M.dirensis)。在生境上，本研究標本采自落葉松林下，模式種采自巴基斯坦潘杰科拉河附近濕潤的溫帶針葉林下。目前此物種僅發(fā)現(xiàn)在巴基斯坦和中國，尚需更多調(diào)查研究來表明其分布區(qū)域和生境生態(tài)。

下迪铦囊蘑(M.dirensis)與普通铦囊蘑(M.communis)、鉛灰铦囊蘑(M.polioleuca)、灰棕铦囊蘑(M.cinereifolia)的區(qū)別在于菌蓋及菌柄的顏色，普通铦囊蘑菌蓋黃棕色，菌柄白色至淺黃色[22]，鉛灰铦囊蘑菌蓋鉛灰色，菌柄棕色，灰棕铦囊蘑菌蓋菌柄均為灰咖啡色，而M.dirensis的菌蓋中央灰褐色，向邊緣顏色逐漸變淺，菌柄上部黃棕色，向基部逐漸變白。此外，M.dirensis與灰棕铦囊蘑的區(qū)別還有后者菌柄中實，緣囊狀體頂端多有晶體，前者菌柄中空，緣囊體頂端未見晶體[10]。

铦囊蘑屬的很多物種都是可食的[23]，比如鐘形铦囊蘑(M.exscissia)、黑白铦囊蘑(M.melaleuca)、灰褐铦囊蘑(M.paedida)等。目前下迪铦囊蘑的食藥用價值尚不十分確定。洪常青等[24]研究發(fā)現(xiàn)黑柄铦囊蘑(M.arcunta)中含有的礦質(zhì)元素K、Mg、Fe、Zn和Mn含量均高于其它常見食用菌，蛋白質(zhì)含量比較高。由此可見，铦囊蘑屬具有重要研究和開發(fā)價值。本研究對中國铦囊蘑屬物種作了重要補充，為铦囊蘑屬研究提供了科學資料。