張 磊，李紅俠，鮑道源,毛雨晴,

劉羽佳，付春情，蘇 博，姚沛琳①

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

白背三七(Gynuradivaricata(L.) DC.)是一種多年生草本植物，廣泛分布于臺(tái)灣及華南、西南一帶，一般生長在山野樹林或潮濕的陰涼地。近年來，發(fā)現(xiàn)其對于多種炎癥都有一定的治療作用，民間用其入藥和食用[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)白背三七地上部分含有較多的黃酮類成分[2]，這些成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、降低血糖等多種作用[37]。

超聲波提取技術(shù)主要是利用超聲波的振動(dòng)空化作用，使植物組織中的細(xì)胞破裂，利于溶劑浸入到細(xì)胞內(nèi)部，加速植物中有效成分與溶劑的相互滲透、溶解，為此，利用超聲波提取技術(shù)可增加白背三七中黃酮類化合物在溶劑中的溶解，進(jìn)而大大提高浸提效率[8]。

研究藥物的抗菌活性，一般是測定其使微生物的生長出現(xiàn)明顯抑制的最低藥物濃度[9-10]。本實(shí)驗(yàn)使用TTC比色法研究藥物對各菌生長的抑制作用，其原理是活細(xì)菌內(nèi)的脫氫酶能使無色的TTC變成紅色且不易溶于水。當(dāng)溶液中沒有活的細(xì)菌時(shí)，TTC不變色，溶液還呈無色，所以可用TTC作為觀察細(xì)菌存活狀況的顯色劑，以此判斷藥物對微生物生長的抑制作用[11-13]。

黃酮類物質(zhì)具有特定的結(jié)構(gòu)鄰酚羥基，可以在酸性環(huán)境下與一些金屬發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，使溶液變成黃色至橙紅色。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

藥材：白背三七(Gynuradivaricata(L.) DC.)葉，購于宿州市中藥店；菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和大腸桿菌(Escherichiacoli)，宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

肉湯培養(yǎng)基(MH)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(阿拉丁信息股份有限公司)；青霉素(武漢卡諾斯科技有限公司)；其他試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器

JK-450B型超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵(上海鵬奕儀器有限公司)；722N型紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；FA2004N型電子天平(上海圣科有限公司)；KYC-1102型空氣恒溫?fù)u床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；WMK-02型電熱恒溫培養(yǎng)箱(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總黃酮提取方法

2.1.1 白背三七葉總黃酮含量測定方法

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，加入NaNO2、Al(NO3)3和NaOH使溶液顯色，可觀察到溶液顯橙紅色，然后在510 nm波長處測溶液的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。將白背三七葉提取液的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出其總黃酮的含量。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇使其溶解，然后倒入50 mL容量中定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，將其避光保存。

準(zhǔn)確吸取配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于10 mL比色管中，以不加標(biāo)準(zhǔn)品為空白對照。用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇定容到5 mL，加入質(zhì)量濃度為0.05 g/L的NaNO2溶液0.5 mL，搖勻。6 min后，加質(zhì)量濃度為0.10 g/L的 Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻。放置6 min后再加入質(zhì)量濃度為0.04 g/L的NaOH溶液2 mL，然后用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇定容到10 mL，搖勻，靜置15 min。以空白對照為參比，在510 nm波長下測定各標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，然后以所得的吸光度值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 總黃酮提取率計(jì)算

準(zhǔn)確吸取白背三七葉提取液1.0 mL于10 mL比色管中，以不加提取液的作為空白對照，按測定標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的方法測其吸光度，將測得的值代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程可得總黃酮提取液的含量，再根據(jù)下式計(jì)算總黃酮含量：

X=C×n×V/W×100%

式中：X為總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL;C為測出的吸光度值對應(yīng)的總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液的體積，mL；W為樣品質(zhì)量，g。

2.1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1)準(zhǔn)確稱取白背三七葉干粉各1.00 g，共6份，置于50 mL錐形瓶中，分別加入30 mL 體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，然后放入60 ℃超聲波清洗器中，40 min后進(jìn)行抽濾。把濾渣再提取1次，將2次的濾液用對應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容至100 mL，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。然后移取各提取液1.0 mL，按測蘆丁溶液的方法測其吸光度，并計(jì)算提取率，再對3次所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2)準(zhǔn)確稱取白背三七葉干粉各1.00 g，共6份，于50 mL錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇15、20、25、30、40 mL，然后放入60 ℃超聲波清洗器中，提取40 min后進(jìn)行抽濾，將濾渣再提取1次，合并2次的濾液并用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容至100 mL，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。然后準(zhǔn)確移取各提取液1.0 mL，按測蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的方法測其吸光度，并計(jì)算提取率，再對3次所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3)準(zhǔn)確稱取白背三七葉干粉各1.00 g，共6份，于50 mL錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇30 mL，將其放入超聲波清洗器中，在30、40、50、60、70、80 ℃條件下進(jìn)行提取，40 min后抽濾將濾渣再提取1次，合并2次的濾液并用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容至100 mL，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。然后準(zhǔn)確移取各提取液1.0 mL，按測蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的方法測其吸光度，并計(jì)算提取率。

2.1.5 白背三七提取液的純化結(jié)晶

稱取白背三七葉干粉10.00 g，于500 mL錐形瓶中，加300 mL 體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，然后在60 ℃超聲波清洗器中進(jìn)行提取，40 min后抽濾，將殘?jiān)偬崛?次。將提取液蒸發(fā)濃縮得浸膏，加適量無水乙醇用玻璃棒攪拌，減壓抽濾，將濾液再蒸發(fā)濃縮，底部有淡黃色沉淀析出。減壓抽濾，將濾渣刮入小燒杯中，用適量無水乙醇將其溶解，再蒸發(fā)濃縮底部析出淡黃色粉末，將析出的淡黃色粉末放入40 ℃恒溫干燥箱中進(jìn)行干燥。

2.2 抗菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 PBS緩沖液的配制

準(zhǔn)確稱取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、0.20 g KH2PO4、3.58 g Na2HPO4·12H2O，加800 mL左右的蒸餾水?dāng)嚢瑁幤啡芙夂髮⑷芤簆H值調(diào)至7.4，再定容至1 000 mL，滅菌完成后放入4 ℃冰箱中冷藏備用。

2.2.2 MH肉湯培養(yǎng)基及含TTC培養(yǎng)基的配制

稱取21.0 g MH肉湯培養(yǎng)基于燒杯中，加1 000 mL蒸餾水加熱使其溶解，待其溶化后轉(zhuǎn)移至錐形瓶中進(jìn)行滅菌；準(zhǔn)確稱取0.025 g TTC加5 mL蒸餾水將其溶解，再121 ℃滅菌20 min。取MH肉湯培養(yǎng)基100 mL，加滅菌的TTC溶液500 μL，作為含TTC的培養(yǎng)基。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)菌種懸液的制備

從4 ℃冰箱中取出各菌種，在無菌操作臺(tái)上將各菌分別接種至盛有MH肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中，加塞、包扎，放在設(shè)定為37 ℃、44 r/min的空氣恒溫?fù)u床上，5 h后可看到培養(yǎng)液變渾濁，說明菌種已被活化，開始生長了，12 h后將菌種放入4 ℃冰箱中冷藏備用。

取已活化好的菌種1 mL，將其接種至盛有30 mL MH肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中，放在空氣恒溫?fù)u床培養(yǎng)9 h后備用。

2.2.4 總黃酮抗菌活性研究

1)精確稱取提取的白背三七葉總黃酮0.002 g于2.0 mL的EP管中，加二甲基亞砜500 μL 將其溶解；用 PBS緩沖液稀釋，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的藥液。

精確稱取青霉素和氯霉素各0.002 g于2.0 mL的EP管中，用蒸餾水將其溶解，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的藥液。

2)取滅菌后的TTC溶液與MH培養(yǎng)基混合配制成混合培養(yǎng)基，加入到 96 孔培養(yǎng)板中，每行第1個(gè)孔 150 μL，剩余孔100 μL。取50 μL的藥物存儲(chǔ)液加入到第1個(gè)孔，然后用2倍稀釋法將藥品稀釋成一定質(zhì)量濃度梯度。即將第1個(gè)孔吹打均勻后吸取100 μL到第2個(gè)孔，吹打均勻后吸取100 μL加入下1孔，反復(fù)至第 11個(gè)孔。第11個(gè)孔中棄去 100 μL 混有藥物的培養(yǎng)基，第 12 個(gè)孔設(shè)置為陰性對照，每個(gè)藥物溶液濃度平行3次。將對數(shù)期的細(xì)菌用培養(yǎng)基稀釋到A600為0.5，依次在96孔培養(yǎng)板中加入 100 μL 菌懸液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 提取結(jié)果與分析

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可得回歸方程y=0.010 3x+0.002 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

3.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

1)溶劑體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

由表1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮的提取率也增加。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮提取率為4.35%，達(dá)到最大，隨后總黃酮提取率又有小幅度降低，因此，本實(shí)驗(yàn)選取體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇作為提取劑。

表1 溶劑體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

2)料液質(zhì)量濃度對提取率的影響

由表2可知，隨料液質(zhì)量濃度增加，總黃酮的提取率也逐漸增加；但當(dāng)料液質(zhì)量濃度增加到1/40時(shí)，提取率增加不明顯，當(dāng)適料液質(zhì)量濃度為1/30時(shí)，總黃酮的得率為4.31%。

表2 料液質(zhì)量濃度對總黃酮提取率的影響

3)溫度對提取率的影響

由表3可知，隨溫度的升高，總黃酮的提取率也升高，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，總黃酮提取率為4.37%，達(dá)到最大，隨后隨溫度的增加提取率反而有小幅度降低，因此60 ℃為最佳提取溫度。

表3 溫度對總黃酮提取率的影響

3.1.3 總黃酮鑒定結(jié)果

加入HCl-鋅粉后發(fā)生劇烈的反應(yīng)，溶液變成橙紅色，說明結(jié)晶析出的物質(zhì)中含有黃酮類物質(zhì)。

3.2 抗菌結(jié)果與分析

由表4可知，總黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、綠膿桿菌生長具有一定的抑制作用，效果雖不如青霉素，但比氯霉素的略好，4種菌種中對金黃色葡萄球菌的效果最好，最低抑菌質(zhì)量濃度為15.63 μg/mL。

表4 總黃酮、青霉素、氯霉素對各菌的最低抑菌質(zhì)量濃度 單位：μg/mL

4 結(jié)論

以體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇作提取劑、料液質(zhì)量濃度為(1/30)/(g/mL)、溫度為60 ℃時(shí)白背三七葉總黃酮的提取率較高。TTC比色法用于體外抗菌活性的研究操作簡便，能夠較快地得出藥物對菌株的抗性。本實(shí)驗(yàn)采用TTC比色法以青霉素、氯霉素作為對照研究總黃酮的抗菌活性，由結(jié)果可知白背三七葉總黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、綠膿桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度分別為15.63、31.25、62.50、31.25 μg/mL，還可知總黃酮對菌體生長的抑制作用不如青霉素，但比氯霉素的略好。對金黃色葡萄球菌的效果最好，最低抑菌質(zhì)量濃度為15.63 μg/mL。