崔藝燕，李家洲，田志梅，鄧盾，魯慧杰，劉志昌，容庭，馬現(xiàn)永，2*

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評(píng)定工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510640；2. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東茂名 525000）

茶（Camellia sinensis）是中國(guó)的傳統(tǒng)飲料，是僅次于水的全球第二大最常用的飲料［1］。2019 年，全球茶葉產(chǎn)量約為650 萬(wàn)t［1］。中國(guó)茶渣的排放量約為每年16 萬(wàn)t［2］。大量茶葉廢料在開(kāi)放的環(huán)境中產(chǎn)生和丟棄，這些可再生的生物質(zhì)資源給環(huán)境帶來(lái)了巨大的壓力，同時(shí)也浪費(fèi)了茶葉中的生物活性成分。茶渣的資源化利用已成為亟待解決的問(wèn)題。

實(shí)際上，茶渣中含有許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。干茶渣的主要營(yíng)養(yǎng)成分包括粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）、碳水化合物、粗纖維（crude fiber，CF）等［3-4］。此外，茶渣所含的生物活性化合物與普通茶相同，且含量相似［5］。茶渣富含功能物質(zhì)，如多酚、生物堿、皂苷、多糖和有機(jī)酸［5-8］，以及具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗肥胖和抗糖尿病等活性［5，8］。動(dòng)物研究表明，茶渣不僅能提高動(dòng)物的免疫力，調(diào)節(jié)肌肉纖維類型，還能改善動(dòng)物的消化能力、肉品質(zhì)、抗氧化能力和腸道形態(tài)［9-11］。因此，茶渣是一種很有前途的飼料添加劑。但茶渣中含有皂苷、咖啡因等抗?fàn)I養(yǎng)因子［8］，適口性差，不適合作為飼料添加劑直接使用。選擇綠色有效的生物技術(shù)改良茶渣，對(duì)于茶資源的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

固態(tài)發(fā)酵是一種經(jīng)濟(jì)有效的生產(chǎn)技術(shù)，具有規(guī)模小、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。真菌的菌絲遍布表面，生長(zhǎng)迅速，代謝活性高［12］。真菌可以產(chǎn)生代謝物并促進(jìn)化合物的生物轉(zhuǎn)化［13］。真菌分泌豐富的蛋白酶、纖維素酶等酶系，使大分子物質(zhì)分解為葡萄糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，從而改善飼料品質(zhì)?？祵幠久梗═richoderma koningii）常用于植物病原菌的生物防治中，在各種農(nóng)業(yè)廢棄物飼料轉(zhuǎn)化中也較為常見(jiàn)?？祵幠久鼓軌蛟诓焕沫h(huán)境條件下繁殖，能夠使用多種碳源和氮源［12］。研究發(fā)現(xiàn)，康寧木霉發(fā)酵桑葉（Morus alba）后的CP 含量高達(dá)31.27%，產(chǎn)蛋白酶活性高達(dá)107.173 U·mL-1［14］?？祵幠久挂彩欠纸飧吡唬⊿orghum bicolor）秸稈CF 的優(yōu)勢(shì)菌種［15］。目前，茶渣的研究集中在有機(jī)肥［4，16］、蘑菇基質(zhì)［17］、吸附重金屬、處理廢水［18］、制備磚［7］等方向，茶渣飼料化利用以直接飼喂反芻動(dòng)物為主［3，9］，對(duì)茶渣進(jìn)行發(fā)酵處理的較少。同時(shí)，未見(jiàn)康寧木霉發(fā)酵茶渣的相關(guān)研究。因此，本研究目的是通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，篩選出康寧木霉茶渣發(fā)酵條件。利用康寧木霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵茶渣，以提高茶渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能成分，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020 年1-10 月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新大樓進(jìn)行。茶渣由康師傅飲料有限公司提供，60 ℃干燥后，研磨成粉，過(guò)0.425 mm 篩。茶渣CP、EE、CF、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）的含量分別為25.93%、2.67%、25.48%、45.45%和25.23%。康寧木霉從陳皮分離篩選所得，菌絲放射狀生長(zhǎng)，菌落背面淺黃色，孢子為黃綠色。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1真菌擴(kuò)增及孢子液的制備 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基用作擴(kuò)增培養(yǎng)基。將0.2 mL 2×108~3×108個(gè)孢子·mL-1孢子液涂布到PDA 培養(yǎng)基的表面，28 ℃培養(yǎng)5~7 d。為制備孢子液，首先用無(wú)菌刀片刮擦長(zhǎng)滿真菌的培養(yǎng)基表面。用5 mL 無(wú)菌水把真菌及表面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中，加入3 顆玻璃珠，渦旋勻漿15 min。最后，采用無(wú)菌脫脂棉進(jìn)行過(guò)濾，混合液過(guò)濾2 次得孢子懸浮液。使用血球計(jì)數(shù)板（XB.K.25，上海市求精生化試劑儀器有限公司）對(duì)孢子的濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用濃度為1×107個(gè)孢子·mL-1。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 將40 g 茶渣混合物（相應(yīng)基質(zhì)比例）放入200 mL 培養(yǎng)瓶中，121 ℃滅菌20 min。冷卻后，在無(wú)菌條件下，每個(gè)瓶中加入相應(yīng)量的孢子懸浮液，用無(wú)菌玻璃棒將孢子懸液和底物攪拌50 次以上，最后用透氣蓋封口。

1.3 單因素試驗(yàn)

在自然pH 下，研究基質(zhì)比例（茶渣∶玉米粉）、料液比（基質(zhì)∶水）、接種量、溫度和時(shí)間對(duì)茶渣發(fā)酵效果的影響。以CP、EE、還原糖、黃酮、皂苷和咖啡因含量為測(cè)定指標(biāo)，選出較好的單因素水平，據(jù)此進(jìn)行下一個(gè)單因素試驗(yàn)，每水平3 個(gè)重復(fù)。

1.3.1基質(zhì)比例對(duì)發(fā)酵茶渣的影響 茶渣∶玉米粉比例設(shè)為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，料液比為4∶6，接種量為4%，溫度為28 ℃，時(shí)間為8 d。

1.3.2料液比對(duì)發(fā)酵茶渣的影響 按1.3.1 確定的基質(zhì)比例，料液比設(shè)為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3，其他條件同1.3.1。

1.3.3接種量對(duì)發(fā)酵茶渣的影響 按1.3.2 確定的料液比，接種量設(shè)為2%、4%、6%、8%、10%，其他條件同1.3.2。

1.3.4溫度對(duì)發(fā)酵茶渣的影響 按1.3.3 確定的接種量，溫度設(shè)為25、28、31、34、37 ℃，其他條件同1.3.3。

1.3.5時(shí)間對(duì)發(fā)酵茶渣的影響 按1.3.4 確定的溫度，時(shí)間設(shè)為0、2、4、6、8、10、14、22 d，其他條件同1.3.4。

1.4 正交試驗(yàn)

為了獲得發(fā)酵茶渣的優(yōu)化組合，以基質(zhì)比例（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為影響因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)依據(jù)為單因素試驗(yàn)結(jié)果。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 所示，每個(gè)因素設(shè)3 個(gè)水平，共9 組，每組3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)中發(fā)酵pH 自然，料液比為5∶5。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)及對(duì)比試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合（A1B2C1D2 或A1B2C1D3），進(jìn)行茶渣發(fā)酵（6 個(gè)重復(fù)）。比較最優(yōu)條件下發(fā)酵茶渣和正交試驗(yàn)表中的各個(gè)指標(biāo)，驗(yàn)證最優(yōu)組合發(fā)酵茶渣效果優(yōu)于正交試驗(yàn)各組合發(fā)酵。對(duì)比試驗(yàn)即比較茶渣混合物在最優(yōu)條件下發(fā)酵前后的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

發(fā)酵產(chǎn)物冷凍干燥，粉碎過(guò)0.425 mm 篩。CP 含量測(cè)定參照GB/T6432-2018［19］，EE 含量測(cè)定參照GB/T6433-2006［20］，還原糖含量采用二硝基水楊酸法測(cè)定（DNS 試劑，D7800，Solarbio；按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定），黃酮含量測(cè)定根據(jù)Wang 等［21］的方法，皂苷含量測(cè)定參照孫萬(wàn)里［22］的方法，咖啡因含量測(cè)定參照GB/T8312-2013［23］。

1.7 發(fā)酵效果評(píng)價(jià)

參照Wang 等［21］和Guarda 等［24］的方法，使用綜合評(píng)分評(píng)估發(fā)酵效果。CP、EE、還原糖、黃酮、皂苷、咖啡因分別占比25%、20%、10%、15%、15%、15%。每個(gè)樣品的總分是所有指標(biāo)的總和。每個(gè)指標(biāo)的平均值為平均分?jǐn)?shù)，最佳結(jié)果定義為對(duì)應(yīng)的最高分，最低結(jié)果定義為0 分，最佳/差結(jié)果與平均結(jié)果設(shè)置中間分（表2）。

表2 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring criteria

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。單因素試驗(yàn)、驗(yàn)證試驗(yàn)和對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較。正交試驗(yàn)結(jié)果采用極差分析和一般線性模型進(jìn)行方差分析。結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)比例（茶渣∶玉米粉）對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

由表3 可知，隨著茶渣含量的增加，發(fā)酵茶渣的CP、皂苷、咖啡因含量增加（P<0.05），而還原糖含量則降低（P<0.05）。當(dāng)基質(zhì)比例為9∶1 時(shí)，發(fā)酵茶渣的CP 和皂苷含量最高（P<0.05）?；|(zhì)比例對(duì)發(fā)酵茶渣的黃酮含量無(wú)顯著影響（P>0.05）?；|(zhì)比例為7∶3 的發(fā)酵茶渣綜合評(píng)分最高。

表3 基質(zhì)比例（茶渣∶玉米粉）對(duì)發(fā)酵茶渣的影響Table 3 Effects of substrate ratio（tea dregs∶cornmeal）on fermented tea dregs（DM basis）

2.2 料液比（基質(zhì)∶水）對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

由表4 可知，EE 含量隨著基質(zhì)的增加而顯著降低（P<0.05），而還原糖含量則顯著增加（P<0.05）。料液比為4∶6 時(shí)，黃酮含量最高，隨后是5∶5、6∶4、3∶7，7∶3 時(shí)最低（P<0.05）。料液比為3∶7 的茶渣皂苷含量顯著高于其他比例（15.03%~24.27%，P<0.05）。料液比為7∶3 的茶渣咖啡因含量顯著低于其他比例（10.95%~14.72%，P<0.05）。各組間CP 含量差異不顯著（P>0.05）。料液比為5∶5 的發(fā)酵茶渣綜合評(píng)分最高。

表4 料液比（基質(zhì)∶水）對(duì)發(fā)酵茶渣的影響Table 4 Effects of solid-liquid ratio（substrate∶water）on fermented tea dregs（DM basis）

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

由表5 可知，不同接種量對(duì)發(fā)酵茶渣CP、EE、皂苷和咖啡因含量無(wú)顯著影響（P>0.05）。接種量為8%和10%的茶渣還原糖含量顯著高于其他接種量（P<0.05）。接種量為2%、4%、8%的茶渣黃酮含量顯著高于6%和10%的發(fā)酵茶渣（P<0.05）。接種量為8%的發(fā)酵茶渣綜合評(píng)分最高。

表5 接種量對(duì)發(fā)酵茶渣的影響Table 5 Effects of inoculation amount on fermented tea dregs（DM basis）

2.4 溫度對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

由表6 可知，當(dāng)溫度為31 ℃時(shí)，發(fā)酵茶渣的CP 含量顯著高于25 和28 ℃（P<0.05），31~37 ℃的CP 含量無(wú)顯著差異（P>0.05）。25 和31 ℃時(shí)，發(fā)酵茶渣還原糖含量顯著高于其他溫度（P<0.05）。25 ℃發(fā)酵茶渣的黃酮含量較其他溫度顯著提高24.81%~46.12%（P<0.05）。34 ℃的皂苷含量最低。31 和34 ℃時(shí)，咖啡因含量顯著高于其他溫度（P<0.05）。不同溫度的發(fā)酵茶渣EE 含量差異不顯著（P>0.05）。溫度為31 ℃的發(fā)酵茶渣綜合評(píng)分最高。

表6 溫度對(duì)發(fā)酵茶渣的影響Table 6 Effects of temperature on fermented tea dregs（DM basis）

2.5 時(shí)間對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

由表7 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，CP 和咖啡因含量增加。與未發(fā)酵茶渣相比，發(fā)酵22 d 的茶渣CP 和咖啡因含量分別顯著提高34.15% 和45.60%（P<0.05）。發(fā)酵2 d 的茶渣還原糖含量較未發(fā)酵茶渣顯著增加1039.13%（P<0.05），此后隨著時(shí)間增加而顯著減少（P<0.05），但均顯著高于未發(fā)酵茶渣（P<0.05）。發(fā)酵6 d，黃酮含量顯著提高并達(dá)到最高值（P<0.05），隨發(fā)酵時(shí)間增加而逐漸降低。隨發(fā)酵時(shí)間的增加，茶渣皂苷含量逐漸降低。與未發(fā)酵茶渣相比，22 d 的茶渣皂苷含量顯著降低36.22%（P<0.05）。發(fā)酵時(shí)間對(duì)茶渣粗脂肪含量無(wú)顯著影響（P>0.05）。發(fā)酵6 d 的茶渣綜合評(píng)分最高。

表7 時(shí)間對(duì)發(fā)酵茶渣的影響Table 7 Effects of time on fermented tea dregs（DM basis）

2.6 正交試驗(yàn)極差分析

通過(guò)極差分析法，比較表8 中極差（R）大小可知，對(duì)CP 含量影響因素大小排序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（D）、基質(zhì)比例（A）、接種量（C）。根據(jù)Ki值的大小判斷最優(yōu)水平，得到各因素對(duì)CP 含量的最優(yōu)組合為A1B2C1D3。同理，對(duì)EE 含量影響因素大小排序?yàn)椋篈、C、B、D，EE 含量最優(yōu)的組合為A3B1C1D3。還原糖、黃酮、皂苷、咖啡因的最優(yōu)組合分別為A2B2C1D2、A3B1C2D3、A2B2C1D1、A1B1C1D1。根據(jù)綜合得分最優(yōu)組合A1B2C1D3，茶渣發(fā)酵最優(yōu)方案為A1B2C1D3，即基質(zhì)比例為7.0∶2.5，發(fā)酵溫度為31 ℃，接種量為7%，發(fā)酵時(shí)間為7 d。

表8 正交試驗(yàn)極差分析Table 8 Range analysis of orthogonal test

2.7 正交試驗(yàn)方差分析

由表9 可知，基質(zhì)比例（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（D）顯著影響發(fā)酵茶渣CP 含量，說(shuō)明因素A、B、D是影響發(fā)酵茶渣CP 含量的主要因素。根據(jù)F值得到，對(duì)CP 含量影響因素大小排序?yàn)椋築、D、A、C。由表10 可知，對(duì)因素A分析，A1 的CP 含量顯著高于A2、A3，因此選擇A1。同理，因素B選擇B2，因素D選擇D2、D3。因素A、B、D對(duì)CP 含量的最優(yōu)組合為A1B2CiD2 或A1B2CiD3。

表9 正交試驗(yàn)方差分析Table 9 Analysis of variance of orthogonal test

表10 正交試驗(yàn)方差分析多重比較Table 10 Multiple comparison analysis of variance of orthogonal test

同理，因素A是影響EE、黃酮含量的主要因素，因素A、B是影響咖啡因含量的主要因素。對(duì)EE、黃酮、咖啡因含量的最優(yōu)組合為A3BiCiDi、A2BiCiDi 或A3BiCiDi、A2B2CiDi 或A3B2CiDi。各 因 素 對(duì) 還 原糖、皂苷得分無(wú)顯著影響。

上述組合中A1、A2、A3、B2、D2、D3 出現(xiàn)次數(shù)最多。根據(jù)成分重要程度，CP 含量最為重要，選擇CP含量最優(yōu)的組合A1B2CiD2 或A1B2CiD3 作為茶渣發(fā)酵最優(yōu)方案。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

綜合極差分析（A1B2C1D3）和方差分析（A1B2CiD2 或A1B2CiD3）結(jié)果，茶渣發(fā)酵的最優(yōu)組合為A1B2C1D2 或A1B2C1D3。由于分析得到的最優(yōu)組合不在表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)之內(nèi)，因此對(duì)該組合進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)（表11）。測(cè)得發(fā)酵茶渣CP 和黃酮含量高于正交試驗(yàn)表最高CP 含量（27.06%）和黃酮含量（5.92 g·100 g-1），咖啡因低于正交試驗(yàn)表最低咖啡因含量（115.38 mg·100 g-1），EE 含量與正交試驗(yàn)表最高EE 含量（1.53%）接近，還原糖和皂苷含量在正交試驗(yàn)表的范圍內(nèi)。

由表11 可知，與未發(fā)酵茶渣相比，發(fā)酵茶渣A1B2C1D2 和A1B2C1D3 的CP、還原糖、黃酮、咖啡因含量均顯著提高（P<0.001），皂苷含量顯著降低（P<0.001），EE 含量與未發(fā)酵茶渣無(wú)顯著差異（P>0.05）。發(fā)酵茶渣A1B2C1D2 和A1B2C1D3 的營(yíng)養(yǎng)成分和活性物質(zhì)含量無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表11 發(fā)酵茶渣營(yíng)養(yǎng)成分和活性物質(zhì)Table 11 Nutrient components and active substance of fermented tea dregs（DM basis）

2.9 發(fā)酵對(duì)茶渣游離氨基酸的影響

由表12 可知，與未發(fā)酵茶渣相比，發(fā)酵茶渣（A1B2C1D2、A1B2C1D3）的異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、?；撬帷⒔z氨酸、磷酸絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、γ-氨基正丁酸、必需氨基酸、非必需氨基酸、總氨基酸、風(fēng)味氨基酸的含量以及必需氨基酸/總氨基酸、風(fēng)味氨基酸/總氨基酸顯著提高（P<0.05 或P<0.001），氨含量和非必需氨基酸/總氨基酸顯著降低（P<0.05 或P<0.001）。發(fā)酵茶渣（A1B2C1D2、A1B2C1D3）生成了苯丙氨酸、谷氨酰胺、β-丙氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、鳥(niǎo)氨酸。與A1B2C1D2 發(fā)酵茶渣相比，A1B2C1D3 發(fā)酵茶渣的蘇氨酸、牛磺酸、絲氨酸、磷酸絲氨酸含量顯著降低（P<0.05 或P<0.001），賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量顯著提高（P<0.05 或P<0.001），兩種發(fā)酵茶渣的其他氨基酸含量差異不顯著（P>0.05）。

表12 發(fā)酵茶渣游離氨基酸Table 12 Free amino acids of fermented tea dregs（DM basis，mg·100 g-1）

3 討論

3.1 基質(zhì)比例對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

不同的基質(zhì)比例影響著微生物的代謝活動(dòng)。通過(guò)正交試驗(yàn)得知，基質(zhì)比例是影響發(fā)酵茶渣CP、EE、黃酮、咖啡因含量的主要因素。隨著茶渣含量的增加，發(fā)酵茶渣的CP、皂苷、咖啡因含量增加，而還原糖含量降低。這是符合猜測(cè)的，茶渣的CP、皂苷、咖啡因含量較高，當(dāng)茶渣添加比例增加，這些成分的含量也隨之增加。還原糖含量降低主要是由于玉米粉添加比例的降低造成的。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵底物含糖量和生物質(zhì)產(chǎn)量呈正相關(guān)［25］。玉米粉經(jīng)過(guò)高溫高壓后，可產(chǎn)生大量還原糖。玉米粉添加量減少，發(fā)酵底物的還原糖含量隨之減少。即玉米粉含量較高的發(fā)酵底物能夠?yàn)榭祵幠久固峁└嗟哪芰?，有利于菌體生長(zhǎng)。在相同條件下，孢子萌發(fā)生長(zhǎng)需要消耗的還原糖含量相似，那么底物固有還原糖含量高，在被微生物消耗后余下的還原糖含量則高。另外，還原糖也來(lái)源于纖維素的降解。菌體代謝強(qiáng)，纖維素酶活性高，則產(chǎn)生的還原糖含量高。黃酮存在于茶渣中，在玉米粉中未檢測(cè)到。猜測(cè)隨著茶渣添加量的增加，黃酮含量應(yīng)當(dāng)提高，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明基質(zhì)比例對(duì)發(fā)酵茶渣的黃酮含量無(wú)顯著影響。但是正交試驗(yàn)方差分析表明，基質(zhì)比例是影響黃酮含量的主要因素，7∶3 與7.0∶3.5 的黃酮含量顯著高于7.0∶2.5。這可能與康寧木霉對(duì)黃酮的代謝轉(zhuǎn)化有關(guān)，目前缺乏相關(guān)研究。單因素試驗(yàn)中基質(zhì)比為7∶3 的發(fā)酵茶渣綜合評(píng)分最高，即以較少的玉米粉配合茶渣發(fā)酵，生產(chǎn)含量較高的CP 和還原糖以及含量較少的皂苷和咖啡因的發(fā)酵產(chǎn)物。

3.2 料液比對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

水分對(duì)微生物生長(zhǎng)、生物合成和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生及分泌具有重大影響［26］。據(jù)報(bào)道，在水分增加或減少的情況下，酶的產(chǎn)生會(huì)受到不利影響［27］。隨著水分含量的增加，還原糖含量顯著降低，這可能由于高水分導(dǎo)致纖維素酶產(chǎn)生減少，對(duì)纖維素降解能力減弱，導(dǎo)致還原糖的減少。另外，水分含量高會(huì)改變底物顆粒的結(jié)構(gòu)，減少氣體體積，減緩微生物生長(zhǎng)［28］。康寧木霉是好氧菌，發(fā)酵基質(zhì)水分高，則溶氧量較低，菌絲集中生長(zhǎng)在發(fā)酵基質(zhì)表面，內(nèi)部菌絲較少或活力較弱，對(duì)纖維素降解不足，產(chǎn)生的還原糖含量則較低。料液比為7∶3 時(shí)，還原糖含量最高，而EE 含量是最低的，還原糖與EE 趨勢(shì)是相反的，這也說(shuō)明了微生物代謝產(chǎn)生不同代謝物的適合條件是不同的。EE 的成分不是單一的，脂肪、色素、脂溶性物質(zhì)的合成代謝是十分復(fù)雜的，可考慮研究脂肪酸的組成、脂溶性物質(zhì)的含量來(lái)探討EE 的變化。結(jié)果表明，低水分有利于皂苷和咖啡因的降解，這可能與菌體生長(zhǎng)速度較快和還原糖的大量生成有關(guān)。料液比為5∶5 的發(fā)酵茶渣綜合評(píng)分最高，與以往研究一致，即霉菌的生長(zhǎng)繁殖所需的水分含量為40%~50%［29］。

3.3 接種量對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

接種量可能會(huì)明顯影響發(fā)酵過(guò)程中的微生物生長(zhǎng)速率［30］。較高的接種量可能會(huì)加快真菌的生長(zhǎng)速度，但同時(shí)會(huì)增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗速度［31］，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡會(huì)減緩真菌的生長(zhǎng)。接種量較小，延長(zhǎng)了發(fā)酵過(guò)程所需的時(shí)間。在單因素和正交試驗(yàn)中，不同接種量對(duì)發(fā)酵茶渣CP、EE、皂苷和咖啡因含量無(wú)顯著影響。可能由于接種量均處于一個(gè)較合適的范圍導(dǎo)致本試驗(yàn)中接種量對(duì)這些指標(biāo)無(wú)顯著影響。8 d 的生長(zhǎng)，所有培養(yǎng)基中康寧木霉均達(dá)到了最大生物量，對(duì)茶渣的代謝轉(zhuǎn)化達(dá)到最高值。接種量為8%和10%的茶渣還原糖含量顯著高于其他接種量，可能是由于孢子初始數(shù)量較高，加快了康寧木霉的生長(zhǎng)和代謝，還原糖是生命活動(dòng)中末端代謝物，初始階段還原糖生成較多。二者沒(méi)有差異主要是孢子數(shù)已達(dá)到了能轉(zhuǎn)化利用的最大值，在底物一致的情況下，生長(zhǎng)代謝強(qiáng)度不能繼續(xù)增加。結(jié)果表明，接種量為6%和10%的發(fā)酵茶渣黃酮含量較低，暫未能解釋不同接種量對(duì)黃酮含量的影響，可能是隨機(jī)效應(yīng)。

3.4 溫度對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

溫度對(duì)微生物代謝有重要影響，溫度過(guò)高過(guò)低均會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)和代謝。發(fā)酵溫度一般為25~32 ℃，與微生物的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)［32］?？祵幠久沟淖罴焉L(zhǎng)溫度是25~30 ℃，但是康寧木霉對(duì)外界條件的適應(yīng)性相對(duì)較廣，生長(zhǎng)溫度范圍較廣［33］。不同溫度對(duì)真菌代謝物的生成或轉(zhuǎn)化有重要影響，與最佳生長(zhǎng)溫度不一定一致。發(fā)酵溫度為25~31 ℃時(shí)，CP 產(chǎn)量顯著增加。正交試驗(yàn)中，發(fā)酵溫度是影響發(fā)酵茶渣CP 含量的主要因素，31 ℃的CP 含量顯著高于29、33 ℃的。這些結(jié)果表明，康寧木霉在31 ℃下能夠提高茶渣CP 含量。康寧木霉發(fā)酵茶渣在25 和31 ℃能產(chǎn)生較高含量的還原糖。還原糖的含量是還原糖的產(chǎn)生和消耗的差值，除了纖維素的降解外，菌體生長(zhǎng)旺盛也會(huì)產(chǎn)生和消耗還原糖［34］。在25 ℃，菌體生長(zhǎng)慢，消耗的還原糖較產(chǎn)生的少，則還原糖含量高。31 ℃菌體生長(zhǎng)快，產(chǎn)生和消化還原糖均較多，有可能其差值與25 ℃的還原糖含量一致，具體機(jī)制需要更深入的研究才能解釋。25 ℃的黃酮含量最高，表明康寧木霉在較低溫度時(shí)累積黃酮。也有可能是，在較高的溫度條件下，菌體代謝加快，對(duì)茶渣黃酮的利用加強(qiáng)，黃酮被消耗，因此其他溫度的黃酮含量較低。這需要更多的研究來(lái)驗(yàn)證這些猜測(cè)?？祵幠久乖?4 ℃降解皂苷的效果最佳，可能是降解皂苷的酶系在34 ℃時(shí)活力最高。咖啡因含量在31 和34 ℃時(shí)含量較高，說(shuō)明康寧木霉在31~34 ℃時(shí)適合累積咖啡因。正交試驗(yàn)表明，發(fā)酵溫度是影響發(fā)酵茶渣咖啡因含量的主要因素，31 ℃時(shí)咖啡因含量顯著高于29 ℃?？Х纫蚬I(yè)可考慮通過(guò)優(yōu)化條件對(duì)茶渣資源再利用生產(chǎn)咖啡因。溫度過(guò)高或過(guò)低對(duì)康寧木霉的生命活動(dòng)或產(chǎn)生一定的脅迫作用，對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分、功能成分的累積、合成效率有不同的效果。

3.5 時(shí)間對(duì)發(fā)酵茶渣的影響

發(fā)酵時(shí)間是影響茶渣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的因素之一?？祵幠久拱l(fā)酵茶渣CP 含量隨時(shí)間增加而增加，這與朱飛等［35］的研究結(jié)果一致，黑曲霉發(fā)酵茶渣CP 含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。這可能是由于茶渣中菌體蛋白的不斷累積所致。EE 不受發(fā)酵時(shí)間影響，可能是康寧木霉對(duì)茶渣中的EE 利用較少，也有可能是康寧木霉代謝與合成的EE 成分相互抵消，如康寧木霉的綠色孢子，色素可溶于乙醚。還原糖是許多生物過(guò)程和酶反應(yīng)的最終產(chǎn)物，真菌代謝產(chǎn)生的纖維素酶可以催化纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖［36-37］。還原糖在第2 天達(dá)到最高值，與以往研究一致［34］。這是康寧木霉進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)迅速，代謝活性高的表現(xiàn)。菌體生長(zhǎng)分泌各種淀粉酶、糖化酶將淀粉分解為低分子的還原糖，則還原糖含量提高。雖然，還原糖含量隨時(shí)間延長(zhǎng)較第2 天下降，但依然高于未發(fā)酵的茶渣。這與綠色木霉發(fā)酵甘草（Glycyrrhiza uralensis）藥渣的還原糖含量先升后降的情況一致［38］。這說(shuō)明，真菌發(fā)酵茶渣能產(chǎn)生大量的還原糖，為菌體的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，還改善了發(fā)酵茶渣的風(fēng)味。黃酮含量在第6 天最高，此后下降。這說(shuō)明菌體對(duì)黃酮的轉(zhuǎn)化達(dá)最高值，隨著康寧木霉的生長(zhǎng)，黃酮又被吸收代謝。有研究表明，黑曲霉和綠色木霉發(fā)酵降低了桑葉茶黃酮含量［39］。隨時(shí)間延遲，康寧木霉對(duì)黃酮的消耗高于產(chǎn)生速度，表現(xiàn)為發(fā)酵6 d 后，隨時(shí)間延遲，黃酮含量降低。黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化能力，這是改善動(dòng)物腸道和免疫功能的主要特性之一［40-41］。微生物代謝降解抗?fàn)I養(yǎng)因子被認(rèn)為是最有前途的處理方法。高水平的皂苷會(huì)降低動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，限制茶渣在飼料中的使用［42］。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，茶渣皂苷含量降低。以往有研究表明，真菌能降解皂苷［43］。但未有文獻(xiàn)表明康寧木霉能降解皂苷，暫不清楚降解機(jī)理?？Х纫蚴遣枞~中含量最豐富的生物堿［5］，其含量的提高降低了茶渣對(duì)動(dòng)物的適口性。然而，適量的咖啡因具有抗氧化、抗糖尿病和減肥的作用［44］。結(jié)果表明，發(fā)酵茶渣的咖啡因含量隨時(shí)間增加而提高?？Х纫蜃鳛橐环N中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮劑［5］，適量使用發(fā)酵茶渣可以刺激動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)血液循環(huán)。單因素試驗(yàn)中發(fā)酵6 d 的綜合評(píng)分最高，可見(jiàn)茶渣發(fā)酵6 d 即可使用，同時(shí)6~10 d的評(píng)分接近，說(shuō)明發(fā)酵茶渣在一定時(shí)間保存，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不會(huì)降低。正交試驗(yàn)中，發(fā)酵6 和7 d 的CP 含量差異不顯著，均顯著高于發(fā)酵5 d。在實(shí)際生產(chǎn)中，選擇發(fā)酵6 d 能減少生產(chǎn)成本，加快飼料的生產(chǎn)和應(yīng)用。

3.6 發(fā)酵對(duì)茶渣營(yíng)養(yǎng)成分和活性物質(zhì)的影響

發(fā)酵后的茶渣CP 含量較高，原因可能是康寧木霉利用發(fā)酵基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)合成菌體蛋白質(zhì)，繼而增加了CP 含量。與以往研究一致，即黑曲霉發(fā)酵能夠提高茶渣的CP 含量［35］。CP 含量的提高，表明了茶渣經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵可以作為動(dòng)物飼料，這有利于推進(jìn)廢棄物飼料化利用的研究。還原糖含量的提高主要與康寧木霉的代謝有關(guān)，菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生各種酶將淀粉、纖維素等分解為還原糖［36-37］。還原糖具有甜味，能改善發(fā)酵茶渣的適口性。還原糖作為小分子物質(zhì)，容易被動(dòng)物消化吸收。還原糖含量的增高主要來(lái)源于纖維素的降解，從這個(gè)角度來(lái)說(shuō)，發(fā)酵茶渣能被動(dòng)物較好地消化利用。康寧木霉增加了茶渣的黃酮含量，與以往研究結(jié)果不一致。黑曲霉和綠色木霉發(fā)酵降低了桑葉茶黃酮含量［39］。這歸因于康寧木霉與黑曲霉、綠色木霉酶系的不同、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝途徑的不同。發(fā)酵茶渣黃酮含量提高，有利于增加飼料的抗氧化能力，增強(qiáng)動(dòng)物氧化應(yīng)激的抵抗力［40-41］。真菌能降解皂苷［43］，本試驗(yàn)結(jié)果與此一致。皂苷含量的降低，有利于減少抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)的負(fù)面作用，可改善發(fā)酵茶渣的適口性。EE 含量與未發(fā)酵茶渣無(wú)顯著差異，可能是康寧木霉利用與生產(chǎn)EE 達(dá)到平衡狀態(tài)。

3.7 發(fā)酵對(duì)茶渣游離氨基酸的影響

游離氨基酸在蛋白質(zhì)、脂肪和脂肪酸代謝、機(jī)體生長(zhǎng)、免疫系統(tǒng)中起重要作用。必需氨基酸的含量與種類能反映出飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［45］。發(fā)酵茶渣中含有8 種必需氨基酸。康寧木霉發(fā)酵顯著提高了茶渣各種必需氨基酸和總氨基酸含量，即發(fā)酵有利于改善茶渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值?？祵幠久购铣纱x中分泌多種蛋白酶，分解茶渣混合物中蛋白質(zhì)，產(chǎn)生游離氨基酸。在康寧木霉的生長(zhǎng)中，合成了苯丙氨酸、谷氨酰胺、β-丙氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、鳥(niǎo)氨酸（未發(fā)酵茶渣中未檢測(cè)到）。經(jīng)過(guò)發(fā)酵，茶渣中氨含量顯著降低，可以推測(cè)康寧木霉利用茶渣中的氨合成、轉(zhuǎn)化為游離氨基酸或蛋白質(zhì)。游離氨基酸是重要的呈味物質(zhì)［46］。發(fā)酵提高了茶渣的風(fēng)味氨基酸含量和比例，能改善茶渣適口性。?；撬峋哂锌寡趸?、促生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)等功能［47］，γ-氨基正丁酸能減輕畜禽熱應(yīng)激［48］。?；撬岷挺?氨基正丁酸含量的提高，增強(qiáng)發(fā)酵茶渣作為動(dòng)物飼料添加劑的功效。發(fā)酵6 或7 d 的部分氨基酸含量不同，這與發(fā)酵時(shí)間有關(guān)。不同時(shí)間下，微生物的新陳代謝有所不同，產(chǎn)生的游離氨基酸量則有差異?？傊?，康寧木霉發(fā)酵改善了茶渣的游離氨基酸含量和種類，是一種潛在的有價(jià)值的動(dòng)物飼料。

4 結(jié)論

試驗(yàn)表明，康寧木霉發(fā)酵茶渣（料液比為5∶5）的最佳條件是：基質(zhì)比例為7.0∶2.5，發(fā)酵溫度為31 ℃，接種量為7%，發(fā)酵時(shí)間為6 或7 d?？祵幠久拱l(fā)酵改善了茶渣的營(yíng)養(yǎng)成分、活性物質(zhì)以及游離氨基酸含量。