虎杖解毒顆粒(無糖型)的藥效毒理學研究

白雨鑫，童榮生，李晉齊，陳韻蓓

0 引言

虎杖解毒顆粒是四川省人民醫(yī)院的醫(yī)院制劑，已在臨床應(yīng)用30余年，清熱、解毒療效顯著，廣受患者好評，但其制劑輔料含大量蔗糖，易吸潮，不宜用于老年、糖尿病等禁糖患者，臨床應(yīng)用局限?；⒄冉舛绢w粒(無糖型)系在不改變原虎杖解毒顆粒方中藥味、藥量的基礎(chǔ)上，將蔗糖替換為乳糖、甜菊素而制得的無糖劑型。本課題組前期已對虎杖解毒顆粒(無糖型)的成型工藝、質(zhì)量標準等進行研究[1]。根據(jù)《藥品注冊管理辦法》要求，臨床前的藥理、毒理研究結(jié)果是綜合判斷藥物能否進入臨床研究的重要依據(jù)之一。因此，本文對虎杖解毒顆粒(無糖型)、虎杖解毒顆粒的急性毒性和解熱、抗炎情況展開研究，初步對比評價改制前后顆粒的有效性和安全性，為劑型改進的科學性、合理性提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑 虎杖解毒顆粒(無糖型)規(guī)格10 g/袋，相當于2.67 g生藥/g顆粒，成人3次/d，1袋/次，成人按標準體重60 kg計算，即成人1.335 g生藥/(kg·d)；虎杖解毒顆粒規(guī)格10 g/袋，相當于2.67 g生藥/g顆粒，成人3次/d，1袋/次，即成人 1.335 g生藥/(kg·d)；布洛芬片(安徽云鵬制藥有限公司，批號：201420122，規(guī)格1 g，成人2 g/d)；醋酸地塞米松片(安徽金太陽生化藥業(yè)有限公司，批號：130722，規(guī)格0.75 mg，成人2～4次/d，0.75～3.00 mg/次)；干酵母(英國OXIOD公司，批號：LP0021)；二甲苯(成都市科龍化工試劑廠，批號：20120721)。

1.2 動物 昆明種(KM)小鼠160只，體重 18～22 g (其中雄鼠120只，雌鼠40只)；SD雄性大鼠90只，體重 180～220 g，均由四川省醫(yī)學科學院提供，動物合格證號：SCXK(川)2013-15。所有動物實驗前于四川省醫(yī)學科學院實驗動物中心適應(yīng)性觀察1周后使用。飼養(yǎng)環(huán)境：四川省醫(yī)學科學院實驗動物中心，濕度30%～50%，溫度22～23 ℃。飼養(yǎng)方法：按組分籠飼養(yǎng)，雌雄分開，每籠5只，自由進食、進水。

1.3 實驗儀器 歐姆龍 MC-142L型電子體溫計(歐姆龍大連有限公司)；BP211D型十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)；鼠耳打孔器(上海玉研科學儀器有限公司)。

2 方法及結(jié)果

2.1 配置最大給藥濃度的藥液 稱取50 g顆粒，按梯度少量多次地加入蒸餾水，不斷攪拌，待顆粒溶解后，用灌胃針頭吸取藥液，以藥液能通過灌胃針管為臨界點，此時藥液濃度為實驗的最大給藥濃度。上法確定虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒的最大給藥濃度分別為2.43 g生藥/ml、2.225 g生藥/ml。

2.2 急性毒性實驗(最大給藥量實驗)[2]

2.2.1 半數(shù)致死量預(yù)實驗及結(jié)果 選取昆明種小鼠20只，雌雄各半。試驗前小鼠禁食不禁水12 h，按體重隨機分為虎杖組和虎杖(無糖)組，分別灌服虎杖解毒顆粒和虎杖解毒顆粒(無糖型)，以最大給藥濃度和小鼠灌胃可承受的最大體積(40 ml/kg)進行灌胃，3次/d，每次間隔8 h，給藥后自由進食和飲水，連續(xù)觀察 7 d。結(jié)果小鼠無一死亡，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，提示藥品安全范圍大，需進行小鼠的最大給藥量實驗。

表1 藥物最大給藥量實驗的測定結(jié)果

2.3 抗炎藥效-對二甲苯所致小鼠耳腫脹模型的影響實驗[3-4]

2.3.1 實驗方法 取體重18～22 g雄性昆明種小鼠80只，隨機分為模型組，地塞米松組，虎杖高、中、低劑量組，虎杖(無糖)高、中、低劑量組，每組10只。配制濃度為0.1 mg/ml的地塞米松藥液。根據(jù)“動物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表”，人∶小鼠=1∶9.01換算，計算出小鼠用藥劑量的臨床治療等效劑量為12.03 g生藥/(kg·d)，設(shè)定高、中、低3個劑量組小鼠給藥劑量分別為26.7 g生藥/kg、13.4 g生藥/kg、6.6 g生藥/kg，相當于人臨床推薦每日用量的20倍、10倍、5倍。配制虎杖組和虎杖(無糖)組的高劑量(1.335 g生藥/ml)、中劑量(0.67 g生藥/ml)、低劑量(0.33 g生藥/ml)藥液。

各組小鼠均按20 ml/kg體積灌胃給藥，1次/d，連續(xù)灌服給藥4 d，模型組灌服等量的蒸餾水。第4天，給藥后60 min，用移液槍吸取10 μl二甲苯涂于各組小鼠右耳的內(nèi)外兩面，左耳不涂作為對照。30 min后頸椎脫臼法處死小鼠，分別剪下左、右耳片，對齊，用直徑9 mm的打孔器在耳片上固定位置打孔，得面積相同的耳圓片，迅速用電子天平稱量。

表2 藥物對二甲苯所致小鼠耳腫脹模型的影響

由表2可知，與模型組相比，地塞米松組、虎杖(高、中)組、虎杖無糖(高、中)組的腫脹度差異顯著(P<0.05)，對炎癥抑制作用強；虎杖(低)組、虎杖無糖(低)組的腫脹度較空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，對炎癥抑制作用不明顯。同時，虎杖(無糖)組和虎杖組在所試劑量范圍內(nèi)，對二甲苯所致小鼠耳腫脹均有抑制作用，且抑制程度相近。

2.4 解熱藥效-對干酵母所致大鼠發(fā)熱模型的影響實驗[6]

2.4.1 實驗方法 取體重180～220 g雄性SD大鼠80只，隨機分為空白組、模型組、布洛芬組，虎杖高、中、低劑量組，虎杖(無糖)高、中、低劑量組，每組10只。配制濃度為0.016 7 mg/ml的布洛芬混懸藥液[7]。

根據(jù)“動物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表”，人∶大鼠=1∶6.25換算，計算出大鼠用藥劑量的臨床治療等效劑量為8.34 g生藥/(kg·d)，設(shè)定高、中、低3個劑量組大鼠給藥劑量分別為26.7 g生藥/kg、13.4g生藥/kg、6.6 g生藥/kg，相當于人臨床推薦每日用量的20倍、10倍、5倍?；⒄?無糖)、虎杖組的高劑量(1.335 g生藥/ml)、中劑量(0.67 g生藥/ml)、低劑量(0.33 g生藥/ml)藥液以及10%的干酵母混懸液[8]。

實驗前6 h禁食不禁水，將受試大鼠的3次體溫平均值作為基礎(chǔ)體溫，各組大鼠均按20 ml/kg體積灌胃給藥，1次/d，連續(xù)灌服給藥3 d，模型組灌服等量的蒸餾水。第3天給藥后，立即在大鼠背部皮下注射10%干酵母混懸液10 ml/kg致熱，在致熱后1、2、4、6、8、12 h后，分別測量并記錄各組大鼠體溫[9]。

表3 藥物對干酵母所致大鼠發(fā)熱模型的影響

由表3、圖1可知，與空白組比較，模型組在致熱后1 h有明顯降溫，之后模型組升溫明顯(P<0.05)，說明造模成功。與模型組比較，在致熱后的4、6、8 h，布洛芬組、虎杖(高)、虎杖無糖(高)組對干酵母致大鼠發(fā)熱模型的解熱作用較明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，虎杖(中、低)、虎杖無糖(中、低)組在致熱后的各時段，解熱作用不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。致熱12 h后，模型組升溫效果減弱，與各組差異減小。

圖1 藥物對干酵母所致大鼠發(fā)熱模型的影響

結(jié)果表明，口服虎杖解毒顆粒(無糖型)、虎杖解毒顆粒對干酵母致熱大鼠具有解熱作用，其中高劑量的解熱效果最好，中、低劑量的效果不明顯。同時，兩組實驗顆粒各濃度的解熱程度相近，說明制劑改制后，其解熱療效未受明顯影響。

3 討論

本實驗為明確虎杖解毒顆粒(無糖型)、虎杖解毒顆粒的復(fù)方毒性，對制劑灌胃給藥小鼠的急性毒性進行了研究，結(jié)果均未能測出其LD50，表明藥品的毒性很小，進行最大給藥量實驗。已知按體重和日服生藥量計算，若小鼠的最大給藥量相當于臨床成人日劑量的100倍以上，則說明藥品較安全，可以提供臨床應(yīng)用[10]。在本文最大給藥量實驗中，顆粒用量分別相當于成人日劑量的218倍和200倍，結(jié)果小鼠無一死亡，生存狀況無異常，提示藥品毒性低，臨床使用安全。

在抗炎藥效研究實驗中，選用地塞米松作為陽性對照藥，以二甲苯為致炎劑，建立持久穩(wěn)定且操作簡便的小鼠耳腫脹模型，來驗證藥物的抗炎作用。該模型的作用機制是二甲苯可作用于血管，使毛細血管擴張，通透性增加，引起組織液大量滲出，局部紅腫[11]。中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)中，常以二甲苯誘發(fā)小鼠耳殼急性腫脹,模擬機體急性炎癥的病理狀態(tài)，以評價藥物抗炎作用[12]。本研究結(jié)果表明，虎杖解毒顆粒(無糖型)、虎杖解毒顆粒對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有一定的抑制作用，且較模型組差異明顯，腫脹抑制作用明顯，為藥品的抗炎作用提供了理論支持。

在解熱藥效研究實驗中，選用布洛芬作為陽性對照藥，以干酵母為致熱劑，建立大鼠發(fā)熱模型，實驗要求低且成功率高，其中干酵母的致熱成分是全菌體及菌體內(nèi)所含的莢膜多糖和蛋白質(zhì)。干酵母所致的發(fā)熱是由于注射部位的局部潰爛引發(fā)的劇烈炎癥反應(yīng),是最常用的大鼠發(fā)熱模型[13]。已知皮下注射干酵母混懸液，注射初期體溫下降，2～3 h開始升溫，6～7 h達峰值，升溫持續(xù)20 h，本實驗造模成功。結(jié)果表明，虎杖解毒顆粒(無糖型)、虎杖解毒顆粒均可緩解干酵母引起的大鼠發(fā)熱反應(yīng)，其中高劑量組[26.7 g生藥/(kg·d)]在大鼠致熱后4～8 h有明顯的降溫作用，且降溫幅度相近。

本實驗研究證明，虎杖解毒顆粒(無糖型)、虎杖解毒顆粒毒性均較低，具備一定解熱、抗炎作用。同時，制劑改制前后急性毒性及藥效強度未發(fā)生明顯改變，結(jié)合課題組前期實驗證明改制前后制劑質(zhì)量標準、指紋圖譜共有模式基本一致，證明了更改輔料對本制劑處方中的化學成分、物質(zhì)基礎(chǔ)基本沒有影響。

本研究通過大量實驗結(jié)果表明，虎杖解毒顆粒(無糖型)的工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控、安全有效，為該制劑研發(fā)的科學性、合理性提供了依據(jù)。