寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷保護(hù)作用

王仕穎,孫崇崇,鄭丹雯,王曉雯,陳文芳

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，主要病理表現(xiàn)為黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)能神經(jīng)元的選擇性死亡[1]。研究結(jié)果表明，α-突觸核蛋白(α-synuclein)的過表達(dá)和錯誤折疊與PD的發(fā)展密切相關(guān)，它在病理狀態(tài)下易聚集形成不溶性的纖維蛋白沉淀，導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡[2]。淫羊藿是一種傳統(tǒng)中草藥，在中國被廣泛用于治療骨質(zhì)疏松癥、補(bǔ)腎壯陽、改善學(xué)習(xí)記憶功能等[3-5]。寶藿苷Ⅰ是淫羊藿的主要藥理活性成分之一，多項研究已經(jīng)證實寶藿苷Ⅰ具有豐富的藥理作用，如抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，寶藿苷Ⅰ可以通過抗氧化減輕大鼠的神經(jīng)元損傷，還能夠通過雌激素受體(ER)抑制破骨細(xì)胞的分化和骨的吸收[8-9]。但是寶藿苷Ⅰ對DA能神經(jīng)元的損傷是否具有保護(hù)作用尚未見報道。本研究應(yīng)用1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)損傷人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，探討寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用SH-SY5Y細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；寶藿苷Ⅰ購自上海同田生物技術(shù)有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)配制成0.10 μmol/L溶液；MPP+購自Sigma公司，用磷酸鹽緩沖液配制成濃度10 mmol/L的溶液；ER特異性阻斷劑ICI 182,780購自Sigma公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自Duchefa公司；DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自BI公司；青霉素/鏈霉素儲存液購自北京索萊寶科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購自雅酶公司；兔抗α-synuclein抗體和兔抗β-actin抗體購自CST公司；山羊抗兔IgG-HRP二抗購自雅酶公司；ECL發(fā)光液購自Vazyme公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞分別接種于96孔板和6孔板內(nèi)，加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2MTT方法檢測細(xì)胞活力 該實驗分為對照組(A組)、MPP+組(B組)、MPP++0.01 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(C組)、MPP++0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(D組)、MPP++1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(E組)、MPP++10.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(F組)、MPP++20.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(G組)。將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板，用不同濃度寶藿苷Ⅰ(前2組不用寶藿苷Ⅰ處理，后5組寶藿苷Ⅰ濃度分別為0.01、0.10、1.00、10.00、20.00 μmol/L)處理24 h，再加1 mmol/L 的MPP+(對照組除外)作用24 h，棄掉96孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，加5 g/L的MTT 20 μL，置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h；再將MTT輕輕吸出，每孔加入100 μL的DMSO溶解沉淀，室溫避光搖床孵育10 min，待沉淀完全溶解后，用酶標(biāo)儀讀取光密度值，計算細(xì)胞存活率，根據(jù)細(xì)胞存活率篩選出寶藿苷Ⅰ的最佳用藥濃度。

1.2.3免疫印跡法(Western blot)檢測α-synuclein的表達(dá) 用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，該實驗分為對照組、MPP+組、MPP++寶藿苷Ⅰ組、MPP++寶藿苷Ⅰ+ICI 182,780組、寶藿苷Ⅰ組。對照組和MPP+組的細(xì)胞分別給予體積分?jǐn)?shù)0.001的DMSO和1 mmol/L 的MPP+處理；MPP++寶藿苷Ⅰ組細(xì)胞先應(yīng)用0.10 μmol/L的寶藿苷Ⅰ預(yù)保護(hù)24 h，再給予1 mmol/L的MPP+作用24 h；MPP++寶藿苷Ⅰ+ICI 182,780組先應(yīng)用1.00 μmol/L的ICI 182,780處理1 h，再給予寶藿苷Ⅰ和MPP+處理；寶藿苷Ⅰ組給予0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ作用48 h。藥物處理細(xì)胞后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入裂解液(lysis∶PMSF=99∶1)100 μL，冰上裂解30 min后用細(xì)胞刮刮下蛋白，收集至1.5 mL的EP管中。在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，離心后取上清80 μL，使用BCA法測蛋白濃度。每組取15 μg蛋白上樣并進(jìn)行電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA、90 min。應(yīng)用50 g/L脫脂奶粉將膜封閉1 h，加入α-synuclein、β-actin一抗，4 ℃搖床孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗孵育1 h，使用ECL發(fā)光液顯影檢測。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析，目的蛋白的表達(dá)以α-synuclein與β-actin灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，各組細(xì)胞存活率比較差異有顯著性(F=51.070，P<0.01)。組間兩兩比較，應(yīng)用MPP+處理后，SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯下降(q=3.751，P<0.05)；0.10、1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ可有效對抗MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降(q=5.549、5.453，P<0.01)，且寶藿苷Ⅰ在0.10 μmol/L時效果最顯著；而10.00和20.00 μmol/L的寶藿苷Ⅰ則會加重MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷(q=6.408、13.650，P<0.01)。故選用0.10 μmol/L的寶藿苷Ⅰ進(jìn)行后續(xù)實驗。見表1。

2.2 寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞α-synuclein蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，各組細(xì)胞α-synuclein蛋白表達(dá)比較差異有顯著性(F=7.913，P<0.01)。組間兩兩比較，與對照組相比，MPP+組SH-SY5Y細(xì)胞中α-synuclein蛋白表達(dá)水平明顯增高(q=5.709，P<0.01)；而MPP++寶藿苷Ⅰ組細(xì)胞中α-synuclein蛋白表達(dá)水平較MPP+組明顯降低(q=3.485，P<0.05)；ICI 182,780預(yù)處理可以阻斷寶藿苷Ⅰ的神經(jīng)保護(hù)作用(q=4.350，P<0.05)；寶藿苷Ⅰ單獨應(yīng)用對α-synuclein蛋白的表達(dá)無明顯影響。見圖1。

表1 不同濃度寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率的影響

①Western blot檢測各組細(xì)胞中α-synuclein蛋白表達(dá)；②各組細(xì)胞α-synuclein蛋白表達(dá)水平的比較(n=4)。Control為對照組，MPP+為MPP+組，Bao+MPP+為MPP++寶藿苷Ⅰ組，Bao+MPP++ICI為MPP++寶藿苷Ⅰ+ ICI 182,780組，Bao為寶藿苷Ⅰ組。與對照組相比較，**q=5.709，P<0.01；與MPP+組相比較，∧q=3.485，P<0.05；與MPP++寶藿苷Ⅰ組相比較，#q=4.350，P<0.05。

3 討 論

PD主要的病理改變?yōu)槁芬仔◇w的堆積和黑質(zhì)致密帶DA能神經(jīng)元的變性死亡，其機(jī)制與α-synuclein的聚集有關(guān)[2,10-12]。Parkin蛋白通過與神經(jīng)突觸素-1相互作用引起α-synuclein的泛素化，從而促進(jìn)路易小體的形成[13]。研究表明，過度表達(dá)的α-synuclein可抑制囊泡內(nèi)吞而影響神經(jīng)傳遞過程，并且通過破壞DA的合成、儲存、回收、再攝取和流出而導(dǎo)致PD[14]。

近年來，大量研究已證實傳統(tǒng)中草藥活性成分可以改善PD模型的病理進(jìn)程[15]。本課題組前期的工作已證實，淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷、淫羊藿素可通過ER途徑發(fā)揮其對DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用。寶藿苷Ⅰ作為淫羊藿總黃酮的重要活性成分，具有多種藥理作用。在鵝膏蕈氨酸誘導(dǎo)的腦功能障礙大鼠模型中，寶藿苷Ⅰ可以通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導(dǎo)對抗鵝膏蕈氨酸誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷[16]。在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的高度分化的大鼠神經(jīng)元PC12細(xì)胞模型中，寶藿苷Ⅰ通過減弱細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生、線粒體損傷和激活糖原合酶激酶-3β來抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[17]。此外，在側(cè)腦室注射脂多糖所致急性神經(jīng)炎癥的大鼠模型中，寶藿苷Ⅰ預(yù)處理不僅能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，還可以通過抑制TOLL樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)/核因子κB(NF-κB)通路顯著逆轉(zhuǎn)多種炎癥因子的表達(dá)[18]。為探討寶藿苷Ⅰ對DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制，本研究利用MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷，觀察寶藿苷Ⅰ是否能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果顯示，0.10、1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ能明顯對抗MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞損傷，而10.00、20.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ對SH-SY5Y細(xì)胞具有毒性作用；0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ預(yù)保護(hù)可以顯著抑制MPP+誘導(dǎo)的α-synuclein表達(dá)上調(diào)。在本課題組前期的研究中，ER激動劑17β-雌二醇(E2)能夠明顯降低MPP+的毒性作用，但E2作為一種雌激素，長期使用可對人體產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找具有類雌激素樣作用且副作用相對更小的植物雌激素，對中國傳統(tǒng)中藥的推廣應(yīng)用具有重要意義。已有研究表明，寶藿苷Ⅰ可以通過ER依賴性途徑在刺激大鼠骨肉瘤UMR-106細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性和NF-κB受體活化因子配體基因表達(dá)等方面發(fā)揮與雌激素相似的骨保護(hù)作用[19]。為進(jìn)一步探討寶藿苷Ⅰ神經(jīng)保護(hù)作用是否與ER信號途徑有關(guān)，本研究觀察了ER特異性阻斷劑ICI 182,780對寶藿苷Ⅰ神經(jīng)保護(hù)作用的阻斷效應(yīng)，結(jié)果顯示寶藿苷Ⅰ對α-synuclein蛋白表達(dá)的抑制作用可被ICI 182,780所阻斷。以上結(jié)果表明，寶藿苷Ⅰ通過激活雌激素信號途徑抑制MPP+誘導(dǎo)的α-synuclein蛋白表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮保護(hù)DA能神經(jīng)元的作用。

綜上所述，寶藿苷Ⅰ能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與ER信號途徑有關(guān)。本文結(jié)果為研究寶藿苷Ⅰ神經(jīng)保護(hù)作用的靶點和可能機(jī)制提供了新的實驗依據(jù)。