陳碩博，沈煜韜，謝鵬堯，陸旭琦，何 勇，岑海燕

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部光譜檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058； 浙江大學(xué)現(xiàn)代光學(xué)儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310027）

0 引 言

柑橘黃龍?。℉uanglongbing, HLB）嚴(yán)重影響柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì)，由于難以預(yù)防和控制，傳播速度快，且目前尚無(wú)根治的方法，被稱為“柑橘癌癥”。因其巨大的危害性，2020年9月中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列入《一類農(nóng)作物病蟲害名錄》。因此，對(duì)柑橘黃龍病的及時(shí)準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)有利于病害的防控，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定健康發(fā)展起著極其重要的作用。目前診斷HLB的方法主要包括田間觀察法和實(shí)驗(yàn)室生化分析法兩類。由于田間觀察法簡(jiǎn)單易行，在基層生產(chǎn)活動(dòng)中的使用較為普遍，其判別依據(jù)主要是感染黃龍病的植株顯現(xiàn)出來(lái)的典型癥狀，如葉片顏色和果實(shí)轉(zhuǎn)色程度等。但該方法對(duì)農(nóng)藝人員的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)要求較高，主觀性強(qiáng)，有其他病害如黃斑病、缺素癥等與黃龍病有相似的癥狀，極易對(duì)HLB的診斷造成誤判。實(shí)驗(yàn)室有多種方法檢測(cè)黃龍病，但這些方法過(guò)程較為復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)技能要求高、檢測(cè)成本高且檢測(cè)周期長(zhǎng)，不利于推廣應(yīng)用。

近年來(lái)隨著光譜技術(shù)與遙感技術(shù)的發(fā)展，HLB的無(wú)損檢測(cè)逐漸成為了可能。Pérez等利用一種便攜式拉曼光譜儀結(jié)合主成分分析和線性判別分析算法識(shí)別健康和HLB柑橘植株，其正確識(shí)別率可達(dá)到89.2%。Sankaran等利用傅里葉近紅外光譜儀對(duì)被干燥和粉碎的柑橘葉片進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)HLB的識(shí)別率可達(dá)到95%，但對(duì)未顯癥HLB柑橘葉片的診斷正確率僅為48.2%。劉燕德等在利用高光譜成像技術(shù)在380～1 080 nm光譜范圍內(nèi)對(duì)HLB進(jìn)行病情等級(jí)判別，對(duì)所采集的柑橘葉片高光譜圖像按染病程度和缺素分成5類，采用偏最小二乘判別分析法（Partial Least Squares Discrimination Analysis, PLS-DA）的模型誤判率僅為5.6%。蘭玉彬等獲取了柑橘果園的無(wú)人機(jī)低空高光譜影像，發(fā)現(xiàn)核函數(shù)為二次項(xiàng)的支持向量機(jī)（Support Vector Machine, SVM）判別模型對(duì)一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理的健康和HLB植株的全波段光譜分類效果最好，準(zhǔn)確率達(dá)到了94.7%。Deng等利用無(wú)人機(jī)搭載高光譜成像儀采集柑橘園的遙感影像，采用遺傳算法提取特征波段進(jìn)一步構(gòu)建多種植被指數(shù)，再結(jié)合冠層光譜特征參數(shù)構(gòu)建了多特征融合的HLB檢測(cè)方法，該方法在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的分類精度分別達(dá)到了99.33%和99.72%。

以上研究大多基于染病葉片與健康葉片的光譜或圖像特征差異采用分類識(shí)別算法對(duì)柑橘黃龍病進(jìn)行診斷，對(duì)未顯癥HLB的研究較少且診斷精度較低，對(duì)葉片遭受黃龍病菌侵染后的光合生理差異亦缺乏研究。植物在受到生物或非生物脅迫后，其光合作用強(qiáng)度會(huì)發(fā)生明顯變化，而葉綠素?zé)晒馀c植物的光合作用密切相關(guān)。研究表明，植物吸收的太陽(yáng)輻射能量用于3個(gè)方面：光合作用、熱耗散、熒光發(fā)射。這三者在植物生理上是密切關(guān)聯(lián)的，存在著近似此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，因此可以通過(guò)熒光更為直接地探測(cè)與植物光合作用相關(guān)的信息。Sankaran等利用手持式熒光傳感器在室內(nèi)環(huán)境下基于袋裝決策樹（Bagged Decision Tree, BDT）分類器對(duì)健康和顯癥黃龍病柑橘葉片的總體分類準(zhǔn)確率達(dá)到了97%。Cen等利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下實(shí)現(xiàn)了健康、黃龍病和缺素柑橘葉片的高精度識(shí)別。翁海勇等同樣利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)提取健康和黃龍病柑橘葉片的熒光參數(shù)結(jié)合碳水化合物代謝分析實(shí)現(xiàn)了柑橘黃龍病的檢測(cè)。但以上研究都需要主動(dòng)的激發(fā)光源且需對(duì)葉片破壞性采樣，難以滿足大田環(huán)境下對(duì)柑橘黃龍病快速無(wú)損診斷的要求。而日光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒猓⊿un-induced Chlorophyll Fluorescence, SIF）技術(shù)適合在自然環(huán)境下對(duì)植物脅迫下光合生理的變化進(jìn)行無(wú)損檢測(cè)，得到了日益廣泛的重視。競(jìng)霞等利用隨機(jī)森林協(xié)同SIF和反射率光譜實(shí)現(xiàn)了對(duì)小麥條銹病的監(jiān)測(cè)。白宗璠等利用改進(jìn)離散粒子群算法（Modified Discrete Binary Particle Swarm Optimization, MDBPSO）優(yōu)化的全波段光譜數(shù)據(jù)協(xié)同冠層SIF結(jié)合隨機(jī)森林和后向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法構(gòu)建了小麥條銹病的遙感探測(cè)模型，對(duì)小麥條銹病病情指數(shù)的反演精度達(dá)到了90%以上。而將日光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)用于柑橘黃龍病診斷的研究尚未見報(bào)道。因此本研究通過(guò)分析健康、未顯癥黃龍病、顯癥黃龍病以及與黃龍病癥狀類似的黃斑病柑橘葉片的光合參數(shù)與光合色素含量差異，嘗試揭示黃龍病菌侵染柑橘葉片的光合響應(yīng)機(jī)理，利用光譜和日光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)分析4種類型葉片的反射率光譜和SIF光譜差異，并進(jìn)一步構(gòu)建柑橘黃龍病的診斷模型，以期實(shí)現(xiàn)柑橘黃龍病的原位快速診斷。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試柑橘品種為涌泉蜜桔，果園位于浙江省臺(tái)州市臨海市沿江鎮(zhèn)上百巖村（121°16′48″ E，28°43′12″ N，海拔37 m），試驗(yàn)前根據(jù)柑橘黃龍病研究專家的建議標(biāo)記健康（Healthy）、未顯癥黃龍?。╝symptomatic HLB, aHLB）、顯癥黃龍?。╯ymptomatic HLB, sHLB）及癥狀與黃龍病相似的黃斑?。∕acular）柑橘葉片（圖1）。團(tuán)隊(duì)前期研究已對(duì)比了缺素癥和黃龍病的差異，本研究進(jìn)一步拓展了區(qū)分黃龍病與其他相似癥狀柑橘病害（如黃斑?。┑目赡苄?。田間試驗(yàn)結(jié)束后，剪下標(biāo)記葉片所在枝梢，并用去離子水浸潤(rùn)的脫脂棉包裹切口處迅速裝入標(biāo)記好的密封袋，封口后轉(zhuǎn)移至保鮮盒保存。取樣時(shí)間分別為2021年2月22日、3月22日和4月29日，采集樣品數(shù)量分別為60、54和48片。將樣品帶至實(shí)驗(yàn)室后，在葉脈兩側(cè)分別打孔以測(cè)葉片色素含量，中心葉脈剪碎后按照國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)黃龍病檢測(cè)方法-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qPCR）法對(duì)葉片進(jìn)行標(biāo)定。最后確定健康、未顯癥黃龍病、顯癥黃龍病以及黃斑病葉片分別為45、33、45、39片，共計(jì)樣本162片。

圖1 不同柑橘葉片樣本的RGB圖像 Fig.1 RGB images of different citrus leaf samples

1.2 數(shù)據(jù)采集

1）光合參數(shù)。使用Li-6800便攜式光合系統(tǒng)測(cè)量柑橘葉片的光合參數(shù)，主要包括凈光合速率（mol/(m·s)），胞間二氧化碳濃度（mol/mol），氣孔導(dǎo)度（mol/(m2·s)）和蒸騰速率（mol/(m·s)），測(cè)量前設(shè)置葉室CO濃度為400mol/mol，相對(duì)濕度為50%，葉片溫度為25℃，光強(qiáng)為1 200mol/(m·s)。再測(cè)量柑橘葉片的光合-CO響應(yīng)曲線（the photosynthetic COresponse curve, A-Ci）。A-Ci曲線CO濃度梯度設(shè)置為400、300、200、100、50、0、400、400、600、800、1 000、1 200mol/mol，測(cè)定完成后，基于Farquhar光合作用模型計(jì)算得到葉片最大羧化速率和最大電子傳遞速率。測(cè)量的健康、未顯癥黃龍病、顯癥黃龍病和黃斑病葉片樣本的數(shù)量分別為15、11、15和13片。

2）SIF光譜。利用ASD FieldSpec 4（analytical spectral device，ASD，美國(guó)ASD公司）便攜式地物光譜儀結(jié)合FluoWat葉片夾測(cè)量葉片的SIF光譜。由于葉片夾上下2個(gè)位置都可以插入光纖，因此可以同時(shí)測(cè)得葉片正面和背面的SIF光譜。葉片夾入FluoWat葉片夾后，將入射的太陽(yáng)光束人工對(duì)準(zhǔn)相對(duì)于葉片表面45°方向的開孔，測(cè)量并記錄葉片的反射和透射數(shù)據(jù)集。然后使用高性能低通濾波片（＜650 nm）對(duì)650 nm以上的光進(jìn)行截?cái)?，分別得到上行和下行的SIF光譜。FluoWat葉片夾的工作原理如圖2所示。測(cè)量點(diǎn)保持在葉片葉寬最大位置的中央葉脈左側(cè)。由于試驗(yàn)期間太陽(yáng)光光入射強(qiáng)度可能受太陽(yáng)角度和云量的影響而不同，通過(guò)對(duì)測(cè)量的SIF光譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算得到SIF產(chǎn)量指數(shù)。具體計(jì)算公式參考文獻(xiàn)[26]。

圖2 FluoWat工作原理圖 Fig.2 The working diagram of FluoWat

3）反射率光譜。將剪下的枝梢?guī)雽?shí)驗(yàn)室內(nèi)后，迅速按照SIF光譜測(cè)量標(biāo)記的順序?qū)θ~片的反射率光譜進(jìn)行逐一測(cè)定。使用儀器為ASD FieldSpec 4 地物光譜儀結(jié)合內(nèi)置光源的葉片夾。測(cè)量前使用葉片夾自帶的標(biāo)準(zhǔn)板進(jìn)行暗電流和白板標(biāo)定，將灰度值轉(zhuǎn)化為反射率值。每個(gè)葉片樣本保存5條光譜曲線，取其算數(shù)平均值作為該樣本最終的反射率值。ASD高光譜儀測(cè)定的波段范圍為 350～2 500 nm，測(cè)量結(jié)果輸出間隔1 nm的光譜反射率數(shù)據(jù)。反射率光譜測(cè)定完成后，迅速進(jìn)行光合色素含量的測(cè)定。

4）光合色素含量。采用分光光度法測(cè)定柑橘葉片的葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量。在葉片葉脈兩側(cè)分別打孔得到小圓葉，裝入5 mL離心管，加入研磨珠至研磨機(jī)研磨后再對(duì)每個(gè)樣品加入95%乙醇并再次研磨。將樣品在暗室環(huán)境下靜置2～3 h后離心。取上清液于96孔微孔板，使用美國(guó)BioTek公司生產(chǎn)的Epoch 2酶標(biāo)儀配合96孔微孔板測(cè)定樣品溶液在665、649和470 nm波長(zhǎng)下的吸光度，并以95%乙醇為參照，參考文獻(xiàn)分別計(jì)算葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量。測(cè)量的健康、未顯癥黃龍病、顯癥黃龍病和黃斑病葉片樣本的數(shù)量分別為45、33、45和39片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別基于反射率光譜和SIF光譜建立柑橘HLB的診斷模型。構(gòu)建反射率光譜診斷模型時(shí)，首先利用競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)加權(quán)算法（Competitive Adaptive Reweighted Sampling, CARS）算法篩選特征波段，再將特征波段的反射率作為輸入結(jié)合K最鄰近法（K-nearest Neighbor, KNN）對(duì)4種類型的柑橘葉片進(jìn)行分類識(shí)別。構(gòu)建SIF光譜診斷模型時(shí)，首先參考已有文獻(xiàn)確定SIF光譜的峰值位置，再基于峰值位置波長(zhǎng)的SIF產(chǎn)量指數(shù)結(jié)合KNN算法構(gòu)建4類葉片的診斷模型。通過(guò)比較兩類模型的最終診斷正確率，確定柑橘HLB的最佳診斷模型。

1）特征波段篩選算法。CARS算法可以有效降低各波長(zhǎng)變量之間的高度共線性問(wèn)題，進(jìn)而提高預(yù)測(cè)模型的速度和精度。在實(shí)際波長(zhǎng)變量?jī)?yōu)選過(guò)程中，通過(guò)偏最小二乘（Partial Least Squares，PLS）模型回歸系數(shù)絕對(duì)值較大的波長(zhǎng)變量，剔除模型回歸系數(shù)絕對(duì)值較小的波長(zhǎng)變量，可以得到多個(gè)優(yōu)選變量子集，再利用交叉驗(yàn)證的方法建模，次蒙特卡羅采樣后選擇個(gè)子集，獲得個(gè)模型的交叉驗(yàn)證均方根誤差（Root Mean Square Error of Cross-validation，RMSECV），RMSECV最小的優(yōu)選變量子集即為最優(yōu)變量子集，包含的變量即為篩選得到的特征波段集合。本次試驗(yàn)將蒙特卡羅采樣次數(shù)設(shè)置為50，在MATLAB R2021a（The Mathworks Inc.，USA）軟件環(huán)境中運(yùn)行。

2）分類算法。KNN通過(guò)計(jì)算維空間中一個(gè)樣本點(diǎn)與其他樣本點(diǎn)的距離來(lái)判斷該樣本與其他樣本點(diǎn)的差異來(lái)選擇類別，訓(xùn)練簡(jiǎn)單高效，數(shù)學(xué)原理易理解，應(yīng)用廣泛。采用5折交叉驗(yàn)證來(lái)防止模型過(guò)擬合，經(jīng)多次測(cè)試，鄰點(diǎn)個(gè)數(shù)設(shè)置為10時(shí)，分類精度較高且運(yùn)行速度較快，距離度量采用Euclidean距離法，距離權(quán)重設(shè)置為等距離。

3）模型評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究采用混淆矩陣評(píng)價(jià)判別模型的識(shí)別效果。混淆矩陣把預(yù)測(cè)類別與實(shí)際類別的所有結(jié)果進(jìn)行組合，形成了真正（True Positive, TP）、假正（False Positive, FP）、真負(fù)（True Negative, TN）和假負(fù)（False Negative, FN）四種情形。進(jìn)而可以計(jì)算出真正率（True Positive Rate，TPR）=TP/(TP+FN)，假負(fù)率（False Negative Rate，F(xiàn)NR）=FN/(FP+TN)，以及總體正確率（Overall Accuracy，OA）=TP/(TP+FP)。

4）SIF產(chǎn)量指數(shù)。計(jì)算公式如式（1）～（5），本文參考已有文獻(xiàn)使用687和741 nm波長(zhǎng)處的發(fā)射峰計(jì)算SIF產(chǎn)量指數(shù)。具體描述如表1所示。

表1 本文用到的日光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量指數(shù) Table 1 Sun-induced Chlorophyll Fluorescence (SIF) yield indices used in this study

式中為波長(zhǎng)，nm；為太陽(yáng)輻照度，mW/(m·nm·sr)；PAR（Photosynthetically Active Radiation）為光合有效輻射，mW/(m·sr)；為反射率，無(wú)量綱；為透射率，無(wú)量綱；fAPAR（Fraction of Absorbed Photosynthetically Active Radiation）為植物光合有效輻射吸收比例，無(wú)量綱；APAR（Absorbed Photosynthetically Active Radiation）為植物吸收的光合有效輻射，mW/(m·sr)；為上行SIF，mW/(m·nm·sr)；為下行SIF，mW/(m·nm·sr)；FY為上行SIF產(chǎn)量，nm；FY為下行SIF產(chǎn)量，nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘黃龍病對(duì)柑橘葉片光合參數(shù)與色素含量的影響

計(jì)算不同類型柑橘葉片的光合參數(shù)的總體平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，如圖3所示。健康柑橘葉片的凈光合速率明顯大于黃斑病和黃龍病葉片（圖3a），說(shuō)明柑橘葉片被病原菌侵染后光合作用強(qiáng)度明顯減弱，而柑橘黃龍病侵染后的葉片又明顯小于黃斑病葉片的凈光合速率，可能是因?yàn)辄S龍病屬于細(xì)菌性病害，對(duì)葉片組織內(nèi)部光合機(jī)構(gòu)的破壞要大于真菌型病害黃斑病的緣故。黃龍病顯癥與未顯癥葉片的凈光合速率無(wú)明顯差異，說(shuō)明健康柑橘葉片的光合機(jī)構(gòu)在受到黃龍病菌侵染后開始遭受破壞，在柑橘黃龍病未表現(xiàn)出明顯特征的潛伏期已經(jīng)表現(xiàn)出來(lái)。健康葉片的胞間二氧化碳濃度明顯低于其他三類染病葉片（圖3a），由于二氧化碳是光合作用的主要原料，所以健康葉片相較于染病葉片的光合作用較強(qiáng)，因此消耗了更多的二氧化碳，使得細(xì)胞間二氧化碳濃度較低。由于控制環(huán)境二氧化碳濃度為400mol/mol，3種染病葉片的光合作用強(qiáng)度較弱，幾乎對(duì)二氧化碳沒(méi)有消耗，其胞間二氧化碳濃度維持在400mol/mol左右，而健康葉片的胞間二氧化碳濃度則明顯低于400mol/mol，維持在300mol/mol左右。蒸騰速率的快慢反映了植物的水分代謝能力，可以一定程度上反映植物的健康狀況。當(dāng)植物收到生物或非生物脅迫時(shí)，蒸騰速率均會(huì)表現(xiàn)出與正常植物的明顯差異。從圖3b中可以看出，健康葉片的蒸騰速率明顯高于其他3類染病葉片，說(shuō)明受到病害脅迫的柑橘葉片的水分代謝出現(xiàn)了異常。而受黃龍病菌侵染的柑橘黃龍病葉片的蒸騰速率又明顯低于受柑橘球腔菌侵染的黃斑病葉片，這從一定程度上揭示了黃龍病對(duì)柑橘的危害大于黃斑病的原因。氣孔導(dǎo)度表示葉片氣孔的張開程度，是影響植物光合作用的主要因素。從圖3b中可以看出，健康柑橘葉片的氣孔導(dǎo)度明顯高于其他3類染病葉片，這是造成健康葉片的凈光合速率和蒸騰速率明顯高于其他3類染病葉片的主要原因。

圖3 不同柑橘葉片樣本的光合參數(shù) Fig.3 Photosynthetic parameters of different citrus leaf samples

通過(guò)設(shè)置不同的二氧化碳濃度得到光合-二氧化碳響應(yīng)曲線，基于Farquhar模型計(jì)算得到不同染病類型柑橘葉片的最大羧化速率和最大電子傳遞速率（圖4a）。最大羧化速率反映了的表觀羧化活性，其大小取決于的數(shù)量和活化程度，是植物光合能力強(qiáng)弱的特性參數(shù)。最大電子速率用來(lái)估算植物分配到碳同化的光合電子流和分配到光呼吸的光合電子流。從圖4a中可以看出，健康葉片的最大羧化速率和最大電子傳遞速率均明顯大于其他3種染病葉片，而黃龍病葉片的最大羧化速率和最大電子傳遞速率最低，說(shuō)明活化的酶的數(shù)量在柑橘葉片遭受黃龍病菌侵染后明顯減少，其直接造成了葉片光合作用中碳同化速率的降低，進(jìn)而影響柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì)。

光合色素在光合作用中起到參與吸收、傳遞光能或引起原初光化學(xué)反應(yīng)的作用，主要包括葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素等。不同類型柑橘葉片的光合色素含量如圖4b所示。4種類型葉片的3種色素含量分布一致，均表現(xiàn)為健康葉片的含量最高，顯癥黃龍病葉片的含量最低。顯癥黃龍病的葉綠素含量顯著小于健康和未顯癥葉片，盡管其類胡蘿卜素含量亦小于健康和未顯癥葉片，但健康或者未顯癥黃龍病葉片的葉綠素與類胡蘿卜素含量比值大于顯癥黃龍病葉片，這可能是造成黃龍病葉片出現(xiàn)黃化的主要原因。

圖4 不同柑橘葉片樣本的光合能力和色素含量 Fig.4 Photosynthetic capacity and pigment content of different citrus leaf samples

2.2 柑橘葉片的反射率特征與黃龍病診斷結(jié)果

4種不同類型的柑橘葉片的反射率光譜如圖5所示。無(wú)論是健康葉片還是染病葉片均表現(xiàn)出典型的植被光譜特征。整體來(lái)看，在可見光波段（500～680 nm）和近紅外波段（750～1250 nm），顯癥黃龍病和黃斑病葉片的反射率高于健康和未顯癥黃龍病葉片。而健康葉片與黃龍病未顯癥葉片的光譜反射率十分接近，這為利用光譜區(qū)分潛伏期黃龍病葉片和健康葉片帶來(lái)一定的困難。同樣地，顯癥黃龍病葉片由于和黃斑病葉片都出現(xiàn)一定的黃化癥狀，在反射率光譜的表現(xiàn)亦差異不大。

圖5 不同柑橘葉片樣本的反射率光譜特征 Fig.5 Reflectance spectra of different citrus leaf samples

圖6表示根據(jù)CARS算法篩選的特征波段結(jié)果圖。隨著運(yùn)行次數(shù)的增加，RMSECV呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)，在運(yùn)行次數(shù)為20時(shí)，RMSECV達(dá)到最小值，為0.494（圖6a）。從圖6b可以看出，隨著運(yùn)行次數(shù)的增加，被篩選出來(lái)的波段數(shù)量呈減少趨勢(shì)，前10次運(yùn)行的波段數(shù)量迅速減少，30次以后逐漸平穩(wěn)。當(dāng)RMSECV最小，運(yùn)行次數(shù)為20時(shí)，對(duì)應(yīng)的波段數(shù)量為144個(gè)。因此將篩選出來(lái)的144個(gè)波段的作為特征波段，輸入其反射率結(jié)合KNN算法對(duì)4類葉片進(jìn)行分類。

圖6 CARS算法篩選特征波段 Fig.6 Screening optimal wavebands by Competitive Adaptive Reweighted Sampling (CARS) algorithm

基于特征波段反射率的4種類型柑橘葉片的分類結(jié)果的混淆矩陣如圖7所示。4類葉片的分類真正率均在60%以上，未顯癥黃龍病和顯癥黃龍病的真正率分別72.7%和75.6%，健康葉片的分類真正率最高，達(dá)到了82.2%。黃斑病葉片的分類真正率僅為64.1%，有23.1%錯(cuò)分的是把其分類為顯癥黃龍病，而顯癥黃龍病葉片的分類真正率也僅為75.6%，20.0%被識(shí)別為黃斑病，這說(shuō)明顯癥黃龍病葉片與黃斑病葉片較為接近的反射率光譜為柑橘黃龍病的診斷帶來(lái)的一定的難度。未顯癥黃龍病葉片的分類真正率為72.7%，而有21.2%的葉片被誤分為健康葉片，同時(shí)健康葉片的分類精度雖然達(dá)到了82.2%，但是仍有13.3%被誤分為未顯癥黃龍病葉片，同樣地，十分接近的反射率光譜，使兩類葉片被互相誤判的可能性較大。

圖7 基于特征波段反射率的KNN分類結(jié)果 Fig.7 K-nearest Neighbor (KNN) classification results based on reflectance of optimal wavebands

2.3 柑橘葉片的SIF光譜特征與黃龍病診斷結(jié)果

不同類型柑橘葉片的上行SIF產(chǎn)量和下行SIF產(chǎn)量如圖8所示。從圖8a可以看出，不同病害類型的柑橘葉片的上行SIF產(chǎn)量均表現(xiàn)出雙峰的特征，這是由光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ共同貢獻(xiàn)，峰值位置位于紅光區(qū)域的690 nm和遠(yuǎn)紅光區(qū)域的740 nm波長(zhǎng)附近，且在690 nm波長(zhǎng)附近，顯癥黃龍病的SIF產(chǎn)量明顯大于其他3類葉片，而在740 nm附近未顯癥黃龍病葉片的SIF產(chǎn)量大于其他3類葉片。4種染病類型的柑橘葉片的下行SIF產(chǎn)量則表現(xiàn)出單峰的特征（圖8b），這是由于當(dāng)透射光從葉片表面穿過(guò)葉肉細(xì)胞到達(dá)葉片背面時(shí)，葉綠素對(duì)紅光的重吸收效應(yīng)造成的。而遠(yuǎn)紅光區(qū)域的峰值位置亦出現(xiàn)在位740 nm波長(zhǎng)附近，但在紅光區(qū)域內(nèi)，顯癥黃龍病的SIF產(chǎn)量明顯大于其他3類葉片，這可能與自身葉綠素含量減少有關(guān)系。峰值位置的SIF產(chǎn)量表現(xiàn)出一定差異，4種類型葉片可以實(shí)現(xiàn)較好的區(qū)分識(shí)別。

圖8 不同柑橘葉片樣本的上行和下行SIF產(chǎn)量光譜 Fig.8 Upward and downward sun-induced Chlorophyll (SIF) yield spectra of different citrus leaf samples

圖9顯示了基于不同SIF產(chǎn)量指數(shù)的KNN算法對(duì)4種不同類型柑橘葉片的分類效果。比較兩組上行SIF產(chǎn)量指數(shù)Up687和Up741的診斷效果（圖9a、9b），健康和顯癥黃龍病葉片的分類真正率均達(dá)到了80.0%，基于Up741的模型較基于Up687的模型將未顯癥黃龍病和黃斑病的分類真正率從69.7%和61.5%分別提升到了75.8%和71.8%。分析兩組下行SIF產(chǎn)量指數(shù)Dw687和Dw741的診斷效果（圖9c、9d）可知，未顯癥黃龍病和黃斑病葉片的分類真正率均為78.8%，基于Dw687的模型對(duì)健康葉片和顯癥黃龍病葉片的分類真正率分別為82.2%和84.4%，基于Dw741的模型對(duì)健康和顯癥黃龍病葉片的分類精度均達(dá)到了85%以上。綜合4種SIF產(chǎn)量指數(shù)來(lái)看，基于Dw741的KNN模型對(duì)顯癥黃龍病葉片的診斷精度最高，達(dá)到了88.9%，對(duì)其他3類葉片的識(shí)別精度較其他3種模型也較高或者相當(dāng)，但對(duì)于未顯癥黃龍病和黃斑病葉片的識(shí)別精度僅為78.8%和73.3%，仍有一定的提升空間。為此，通過(guò)兩個(gè)波段SIF產(chǎn)量進(jìn)行比值處理，構(gòu)建比值SIF產(chǎn)量指數(shù)，嘗試進(jìn)一步提升模型的診斷精度（圖9e、9f）。基于Dw687/741的模型對(duì)未顯癥黃龍病和黃斑病的診斷精度均提升到80%左右，對(duì)健康葉片的診斷精度提升到了將近90%，對(duì)顯癥黃龍病的診斷精度無(wú)變化，為81.8%。反觀基于兩組上行SIF產(chǎn)量指數(shù)構(gòu)建的比值SIF產(chǎn)量指數(shù)Up687/741，參與構(gòu)建的KNN模型對(duì)相較于其他兩組模型，對(duì)4種葉片的識(shí)別精度均有不同程度的提高，均達(dá)到了80%以上，其中對(duì)健康葉片和顯癥黃龍病葉片的識(shí)別精度分別為88.9%和91.1%，對(duì)未顯癥黃龍病葉片和黃斑病葉片的識(shí)別精度均超過(guò)80%，分別為84.8%和82.1%。綜上所述，基于Up687/741的KNN模型對(duì)柑橘黃龍病的診斷精度最高。

圖9 基于不同SIF產(chǎn)量指數(shù)的KNN分類結(jié)果 Fig.9 K-nearest Neighbor (KNN) classification results based on different Sun-induced Chlorophyll Fluorescence (SIF) yield indices

2.4 特征波段反射率模型與SIF產(chǎn)量指數(shù)模型的診斷精度對(duì)比

柑橘受黃龍病菌侵染后，內(nèi)部生理生化指標(biāo)發(fā)生一定程度的變化，這些指標(biāo)的變化導(dǎo)致光譜的響應(yīng)。由于未顯癥時(shí)期葉片組織內(nèi)部生化組分含量的變化十分微弱，或使反射率光譜對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別存在一定困難。而黃斑病與黃龍病癥狀相似度較高，使反射率光譜模型對(duì)其進(jìn)行識(shí)別時(shí)常出現(xiàn)誤判（圖9）。如果在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)黃斑病植株誤判為黃龍病植株進(jìn)行挖除，將會(huì)對(duì)果農(nóng)造成不可挽回的損失。因此本研究設(shè)計(jì)的4種類型柑橘葉片都需要有較高的診斷精度。由2.1節(jié)可知，柑橘的光合作用在未顯癥時(shí)期已經(jīng)遭到破壞，而SIF技術(shù)正是光合作用的探針，在田間對(duì)黃龍病進(jìn)行原位檢測(cè)值得探索。對(duì)比分析基于特征波段反射率和SIF產(chǎn)量指數(shù)的KNN模型的總體分類精度可知（表2），SIF產(chǎn)量指數(shù)模型的分類精度除Up687模型精度與特征波段反射率模型相當(dāng)外，其余均優(yōu)于特征波段反射率模型?；趩畏逦恢肧IF指數(shù)的總體識(shí)別正確率均在80%左右，基于雙峰位置的比值SIF指數(shù)的總體識(shí)別正確率則達(dá)到了85%以上，其中基于Up687/741的KNN模型的正確率最高，達(dá)到了87.0%，且對(duì)于每類葉片的分類準(zhǔn)確率均是所有模型里最高的。結(jié)合圖8與圖4b分析可知，由于顯癥黃龍病葉片的葉綠素含量顯著低于健康葉片和黃斑病葉片，致使上行SIF和下行SIF在紅光區(qū)域的重吸收效應(yīng)減弱，因此顯癥黃斑病的上行SIF和下行SIF在687 nm的峰值位置處均大于其他3類葉片。由于葉綠素對(duì)紅光區(qū)域的SIF的重吸收，使得紅光區(qū)域SIF與遠(yuǎn)紅光區(qū)域SIF的比值能夠反映葉片受黃龍病菌侵染而造成的脅迫狀態(tài)，這可能是比值SIF指數(shù)模型診斷精度較高的原因。這與前人的研究結(jié)果是一致的。

表 2 基于特征波段反射率和SIF產(chǎn)量指數(shù)的KNN模型的總體精度對(duì)比 Table 2 Overall accuracies of K-nearest Neighbor (KNN) models based on reflectance of optimal wavebands and Sun-induced Chlorophyll Fluorescence (SIF) yield indices

3 討 論

柑橘黃龍病主要由韌皮部桿菌屬類細(xì)菌Liberibacter 引起，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，影響中國(guó)的主要為亞洲種（Liberibacter asiaticus，Las）病菌。由于黃龍病菌潛伏期較長(zhǎng)，侵染柑橘后并不立即顯癥，但其傳染性與危害性在新宿主已經(jīng)存在。因此在黃龍病菌侵染柑橘初期（未顯癥黃龍病時(shí)期），控制蛋白合成的基因受病菌影響或上調(diào)表達(dá)或下調(diào)表達(dá)，下調(diào)表達(dá)的基因可能控制著酶的合成，從而使酶數(shù)量較少，活性減弱，直接造成減?。▓D4a），葉片光合作用被極大削弱（圖3）。而上調(diào)表達(dá)的基因可能使篩管阻塞蛋白含量增加進(jìn)行阻塞防御，亦阻塞了糖類等營(yíng)養(yǎng)分子的運(yùn)輸，導(dǎo)致根系無(wú)法及時(shí)吸收利用有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致根系吸收礦質(zhì)元素能力下降，從而造成柑橘植株地上部分缺乏部分礦質(zhì)元素（如N、Fe、Mg、Zn等），而這些元素與葉綠素合成有關(guān)，任一元素含量的減少都將導(dǎo)致黃化癥狀，此時(shí)已進(jìn)入黃龍病的顯癥時(shí)期。圖4b顯示的未顯癥黃龍病柑橘葉片的葉綠素含量略高于黃龍病葉片的原因可能是因?yàn)樵诟涕偎拗髋c黃龍病病原菌互作的過(guò)程中，病原操縱宿主一些其他生物學(xué)過(guò)程引發(fā)了植物的防御反應(yīng)。

盡管研究提出的模型對(duì)柑橘黃龍病的原位快速診斷取得了較好的效果，但診斷精度仍有較大的提升空間，對(duì)SIF光譜進(jìn)行進(jìn)一步的預(yù)處理，不同SIF指數(shù)的構(gòu)建，多種分類算法的進(jìn)一步嘗試都有可能不同程度提高對(duì)黃龍病的診斷精度。對(duì)不同生育階段、不同品種、不同氣候類型下的柑橘組合研究更有利于提高模型的普適性和應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

1）黃龍病菌的侵染使柑橘葉片光合色素含量發(fā)生顯著變化，未顯癥時(shí)期含量升高，顯癥時(shí)期降低；黃龍病菌的侵染使柑橘葉片光合作用明顯減弱，在未顯癥時(shí)期已經(jīng)表現(xiàn)出來(lái)；

2）基于CARS算法提取的特征波段反射率構(gòu)建的KNN分類模型對(duì)健康柑橘葉片的分類正確率為82.2%，對(duì)未顯癥黃龍病和顯癥黃龍病的分類正確率分別為72.7%和75.6%，21.2%的未顯癥黃龍病被診斷為健康，對(duì)黃斑病的分類正確率為64.1%，23.1%被誤診為顯癥黃龍??；

3）基于687和741 nm SIF產(chǎn)量峰值位置構(gòu)建的上行比值SIF產(chǎn)量指數(shù)Up687/741結(jié)合KNN模型對(duì)顯癥柑橘黃龍病的診斷精度達(dá)到了91.1%，對(duì)未顯癥黃龍病達(dá)到了84.8%，均優(yōu)于特征波段反射率模型，說(shuō)明其對(duì)于潛伏期黃龍病的診斷具有一定的優(yōu)越性，為實(shí)現(xiàn)柑橘黃龍病的田間原位、快速、早期診斷提供了參考。