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      比較三種不同固定液對淋巴結冷凍切片染色質量的影響

      2022-08-06 00:57:12姜陽陽成志強游淑源
      臨床與實驗病理學雜志 2022年5期
      關鍵詞:液組冰醋酸細胞核

      姜陽陽,成志強,游淑源

      淋巴結活檢的主要作用是對惡性腫瘤淋巴轉移進行分級,明確腫瘤轉移的具體范圍,減少不必要的手術及術后并發(fā)癥[1]。術中冷凍切片能在較短時間內獲得淋巴結的病理診斷結果,對手術治療方式和手術范圍具有較高的指導作用,因此越來越受到臨床醫(yī)師的青睞。淋巴結組織由于其細胞豐富,質地較脆,外圍常有脂肪包繞,在日常冷凍切片工作中較難獲取高質量切片。固定是影響冷凍切片質量的主要因素之一[2],組織固定欠佳直接導致染色質量差,嚴重影響診斷的準確性。本科室采用不同固定液對淋巴結冷凍切片進行HE染色,取得良好的效果,現(xiàn)報道如下。

      1 材料與方法

      1.1 材料收集2020年6~8月我院手術室送檢新鮮淋巴結標本,淋巴結直徑均大于0.5 cm,合計30枚,均符合快速病理標本送檢要求。

      1.2 試劑及儀器試劑:甲醇,冰醋酸,Harris蘇木精染色液,伊紅(醇溶性),櫻花OCT包埋劑,無水乙醇,二甲苯,1% 碳酸鋰水溶液,中性樹膠等。A液 ∶甲醇;B液:冰醋酸-甲醇液(冰醋酸 ∶甲醇=5 ∶95);C液:冰醋酸-95%乙醇液(冰醋酸 ∶95%乙醇=5 ∶95)。儀器:恒溫冷凍切片機(Leica CM1950),生物顯微鏡(OLYPMUS BX40)。

      1.3 方法送檢的新鮮淋巴結組織,規(guī)范取材后行冷凍切片。實驗前將A、B、C液放置在冷凍切片機內,預冷至機箱溫度(-20 ℃)。常規(guī)冷凍切片(5 μm厚),每例淋巴結連續(xù)做 9張切片,分別浸泡于3種不同固定液中,固定時間分別為 15、30、60 s。待固定完成后,流水沖洗,收集所有切片置于染色架中,流水沖洗20 s后染色。染色步驟:蘇木精染色液60 s,流水沖洗10 s,1%碳酸鋰水溶液返藍5 s,流水沖洗10 s,伊紅溶液10 s,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

      1.4 結果判斷所有切片均由本科室兩名副主任醫(yī)師采用雙盲法閱片,從組織結構、細胞核形態(tài)、細胞核染色、細胞質染色和核質對比等5項進行評分,單項總分為10分,無法診斷計為0分。

      2 結果

      2.1 HE染色本實驗經A液固定15、30 s的切片:鏡下組織結構不清晰,細胞核腫脹,核染色和胞質染色對比度差。本實驗經C液固定15、30 s的切片:鏡下見細胞間隙增大,細胞核輕度縮小,細胞核和細胞質對比度較好。本實驗經B液固定15、30、60 s的三組切片:鏡下組織結構均完整,細胞形態(tài)清晰,核仁清晰可見,細胞核和細胞染色良好。經A液固定60 s的切片和經C液固定60 s的切片:組織結構均清晰,未見細胞腫脹和收縮,核質對比度好(圖1~4)。

      2.2 評分本組結果顯示:A液組和C液組平均分隨著固定時間延長而逐漸增加,平均得分:固定60 s>固定 30 s>固定15 s。B液組平均分相對較為穩(wěn)定(表1)。

      表1 三種固定液固定不同時間的HE染色評分

      2.3 單因素方差分析固定15 s和固定30 s時,固定液影響冷凍切片HE染色質量(P<0.01),平均分:B液組>C液組>A液組。進一步兩兩比較,B液組和其他兩組評分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示冷凍切片在B液中固定15、30 s時染色質量優(yōu)于其他兩種固定液。固定60 s時,方差分析結果表明三種固定液評分差異無統(tǒng)計學意義(P=0.733),提示固定液不是影響染色評分的因素。進一步兩兩比較,B液與A、C液組評分差異無統(tǒng)計學意義(P=0.918),A液組與C液組評分差異無統(tǒng)計學意義(P=0.711),提示固定60 s時,三組切片均獲得良好的染色效果。

      圖1 淋巴結:A液(甲醇)固定15 s,組織結構不清,細胞明顯腫脹

      3 討論

      影響淋巴結冷凍切片的因素較多,如規(guī)范取材、冷凍速度、切片技巧、固定和染色均是影響切片質量的主要因素。淋巴結通常多份標本同時送檢,淋巴組織內摻雜脂肪,制片難度大,切片時間長,診斷難度大,而淋巴結冷凍切片的診斷直接關系手術進度和手術方式。淋巴結內纖維少,細胞豐富,尤其是核質比高的淋巴細胞染色質極為豐富,良好的固定十分重要。優(yōu)質的固定液,不僅能保證組織形態(tài)原有結構的完整功能,還能最大限度減少冷凍切片與石蠟切片在組織細胞形態(tài)上的差異[3]。

      本實驗評估淋巴結冷凍切片經3種固定液固定,HE染色均獲得高質量的淋巴結冷凍切片,鏡下表現(xiàn)為組織結構清晰、顏色鮮艷,細胞核呈藍色,細胞質呈不同程度紅色,細胞形態(tài)清晰,細胞核規(guī)則,細胞間隙無明顯增大,核質對比度良好,核仁和染色質清晰。甲醇為沉淀類固定劑,對組織滲透性強,能迅速沉淀清蛋白、球蛋白和核蛋白[4]。95%乙醇對抗原性保存較好,能沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白,但核蛋白被沉淀后溶解于水,造成組織收縮。因此,95%乙醇作為單純的固定液不理想[5]。多項研究證實,固定液中添加一定濃度的冰醋酸對細胞破壞小,細胞核、細胞質染色對比鮮明,本實驗也獲得類似的結論。

      冷凍切片固定時間不夠主要表現(xiàn)為細胞核腫脹,染色對比度差,組織結構不清晰,細胞收縮等。本次實驗中對比了不同固定時間對淋巴結冷凍切片HE染色質量的影響,獲得高質量的染色切片,甲醇和冰醋酸-95%乙醇液需要固定60 s,而冰醋酸-甲醇液只需固定15 s,明顯優(yōu)于另外兩種固定液。冰醋酸的穿透能力強,能沉淀核蛋白,可較好地保存染色體的結構,冰醋酸加速蛋白質沉淀,尤其核蛋白沉淀,提升細胞核染色質量。冰醋酸-95%乙醇液固定未見核蛋白溶解,切片顯示細胞核和細胞質染色質量較高,短時間固定會引起細胞收縮,但不影響診斷。冰醋酸對組織有膨脹作用,經冰醋酸-95%乙醇液固定60 s,冷凍切片染色質量高,未見明顯細胞間隙,95%乙醇能快速引起細胞收縮,而冰醋酸對組織的膨脹作用較緩慢,95%乙醇的收縮作用與冰醋酸的膨脹作用相抵消需要固定時間,實驗證明在固定60 s時取得較好的效果。

      本實驗顯示冰醋酸-甲醇混合液配制簡單,固定時間短,效果好,有利于快速制片,是一種理想的淋巴結冷凍切片固定液。

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