郎超

（山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西太原 030031）

黃芩，又名山茶根，是唇形科黃芩屬多年生草本植物，主要分布于我國(guó)東北地區(qū)和內(nèi)蒙古自治區(qū)中東部，味苦而寒，清熱、抗病毒、消炎和抗氧化等作用顯著[1-3]。黃芩藥材中含有黃芩苷、黃芩素等多種有效提取物成分。近年來的報(bào)道稱，黃芩苷除了具有傳統(tǒng)抗炎、抗氧化、抗病毒等功效外，還具有較為廣泛的抗癌活性[4-6]。本研究選用黃芩苷處理人肝癌細(xì)胞HepG2，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黃芩苷對(duì)腫瘤細(xì)胞存活的影響，并使用細(xì)胞流式檢測(cè)、Western Blot實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，對(duì)黃芩苷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)效應(yīng)做了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

黃芩苷（baicalin），95%，溶于DMSO，上海源葉生物科技有限公司；Caspase3、Bcl-2、Bax等抗體試劑，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol-RNA提取試劑、q-RTPCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑盒，日本TAKARA公司；DMEM培養(yǎng)基，生工生物工程（上海）股份有限公司；penicillin-streptomycin，日本同仁公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，前塵生物科技有限公司；引物由Invitrogen（上海）合成。

Galaxy 170 S二氧化碳培養(yǎng)箱，德國(guó)Eppendorf公司；MX2型微孔板振蕩器，韓國(guó)FINEPCR公司；Infinite F50型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；TG-16型離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BD FACSCalliburⅡ型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；PowerPac HC型電泳儀、CFX Connect型熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7（人類乳腺癌上皮細(xì)胞株）于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入10% FBS及1% penicillin-streptomycin，培養(yǎng)條件：5% CO2、37 ℃、55%濕度。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

選取適量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，接種在96孔板中，細(xì)胞充分貼壁后，分別加入200 μL含20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L黃芩苷的培養(yǎng)基，每組5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照為PBS，在5% CO2、37 ℃、55%濕度條件下培養(yǎng)24 h后取出；更換100 μL新鮮培養(yǎng)基，再加入20 μL MTT（5.0 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)約4 h后終止細(xì)胞培養(yǎng)。在避光環(huán)境下，將孔內(nèi)培養(yǎng)液吸凈后加入150 μL的DMSO，低速震蕩10 min。置于酶標(biāo)儀，檢測(cè)570 nm處各孔的吸光度值。按照式（1）計(jì)算黃芩苷對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。

其中，A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度均值，A0為對(duì)照組吸光度均值。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將經(jīng)不同濃度黃芩苷（0、50 μmol/L、100 μmol/L）處理24 h的HepG2細(xì)胞收集起來后，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入1×結(jié)合緩沖液100 μL重懸細(xì)胞沉淀，并轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管中，加Annexin V-FITC 5 μL和 PI 5 μL，避光染色 15 min；加入1×結(jié)合緩沖液400 μL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC熒光通道為FL1-H，PI熒光通道為FL2-H，獲取細(xì)胞數(shù)量為15 000個(gè)/樣，不足15 000個(gè)收取全部細(xì)胞；最后于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果用FlowJo軟件分析，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡百分率。

1.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)

將黃芩苷處理過的HepG2細(xì)胞收集起來，經(jīng)裂解提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取樣20 μL電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉2 h。接對(duì)應(yīng)蛋白一抗孵育過夜（4 ℃、搖床緩慢搖動(dòng)）。次日，接經(jīng)辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗孵育2 h（室溫、搖床緩慢搖動(dòng)）。TBST溶液充分洗凈雜交膜后，在暗室內(nèi)滴加發(fā)光液，經(jīng)X-光膠片曝光、顯影、定影處理后，條帶記錄對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。用Image Lab軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集加黃芩苷后培養(yǎng)24 h的HepG2細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋。5 ng cDNA、引物各0.4 μmol/L（序列見表 1）和 7.5 μL Mix組成的 15 μL反應(yīng)體系上機(jī)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。ΔΔCt法分析其表達(dá)情況。

表1 相關(guān)引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩苷抑制HepG2細(xì)胞的增殖

通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了黃芩苷對(duì)HepG2是否存在增殖抑制效應(yīng)，如圖1所示，黃芩苷濃度與HepG2細(xì)胞增殖抑制率正相關(guān)。

圖1 黃芩苷抑制HepG2細(xì)胞增殖（劑量依賴）

2.2 黃芩苷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)黃芩苷處理后的HepG2細(xì)胞凋亡情況，如圖2所示。對(duì)照組HepG2細(xì)胞的凋亡率為3.71%，早、晚期凋亡率分別為3.08%和0.63%；經(jīng)50 μmol/L與100 μmol/L黃芩苷處理后，HepG2細(xì)胞凋亡率分別為22.20%（19.70%+2.50%）、54.87%（48.80%+6.07%）。結(jié)果表明，黃芩苷可有效促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

圖2 黃芩苷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

2.3 黃芩苷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白高表達(dá)

經(jīng) 30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L 黃 芩 苷處理24 h后，HepG2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)情況如圖3所示，相對(duì)表達(dá)量如圖4所示。從圖中可以看出，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），Bcl-2相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），Bax的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05)，且呈濃度依賴關(guān)系。

圖3 黃芩苷處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Western Blot結(jié)果

圖4 黃芩苷處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.4 黃芩苷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)分子mRNA高表達(dá)

實(shí)時(shí)定量熒光PCR法檢測(cè)不同濃度黃芩苷處理后HepG2細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2及Bax的表達(dá)量，如圖5所示。可以看出，Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），Bcl-2相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），Bax的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），且呈濃度依賴關(guān)系。

圖5 黃芩苷處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量

以上結(jié)果表明黃芩苷可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，且與Bcl-2/Caspase-3信號(hào)通路相關(guān)。Bcl-2家族和Caspase家族是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性分子，Caspase-3是Caspase家族中多條凋亡通路的共同下游；Bcl-2和Bax可作為上游分子，通過線粒體途徑激活死亡蛋白執(zhí)行酶Caspase-3，參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。其中，Bax基因參與促凋亡，而Bcl-2參與抑制凋亡[7-8]。

近年來，越來越多的報(bào)道開始聚焦于黃芩苷抗腫瘤的機(jī)制研究，如何更為高效地發(fā)揮中藥小分子類藥物的抗腫瘤效應(yīng)成為熱點(diǎn)課題。通過本研究前期實(shí)驗(yàn)及相關(guān)研究表明，黃芩苷的抗腫瘤機(jī)制主要有抑制增殖、調(diào)控周期、誘導(dǎo)自噬、促進(jìn)凋亡等[9-11]。細(xì)胞凋亡作為一種細(xì)胞起始死亡過程，在腫瘤發(fā)展與治療中具有重要作用[12]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)初步研究了黃芩苷對(duì)肝癌腫瘤細(xì)胞HepG2的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，結(jié)果表明其誘導(dǎo)凋亡與Bcl-2/Caspase-3信號(hào)通路相關(guān)。Caspase家族相關(guān)的細(xì)胞凋亡的途徑廣泛，其上下游效應(yīng)分子及相關(guān)調(diào)控機(jī)制也很復(fù)雜，本研究?jī)H探討了其中可能的一種通路，還需要進(jìn)一步探尋黃芩苷發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為其抗腫瘤機(jī)制的研究提供新的參考。