具有區(qū)分力的葉酸片體外溶出度測(cè)定方法研究

陳倩倩 ，劉正平 ，劉藝盈，毛楷凡 ，楊雪華 ，李大偉 ,

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2. 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑技術(shù)研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；3. 中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211198；4. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

葉酸是一種水溶性維生素，因綠葉中含量十分豐富而得名，又名蝶酰谷氨酸。在自然界中有幾種存在形式，其母體化合物是由喋啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結(jié)合而成。葉酸為黃色結(jié)晶[1-2]，微溶于水，但其鈉鹽極易溶于水，不溶于乙醇；在酸性環(huán)境中易被破壞，對(duì)光、熱也不穩(wěn)定。

葉酸在體內(nèi)的吸收部位主要為小腸上部，吸收后的葉酸存在于腸壁、肝、骨髓等組織中，在還原型輔酶II（NADPH）參與下被葉酸還原酶還原成具有生理活性的四氫葉酸，參與嘌呤、嘧啶的合成。該藥屬生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS）中的III/IV類藥物，即低滲透性藥物，臨床主要用于各種原因引起的葉酸缺乏及葉酸缺乏所致的巨幼紅細(xì)胞貧血等。葉酸片（5 mg）原研廠家為法國(guó)賽諾菲公司（商品名：Speciafoldine）。根據(jù)原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公布的第一批可豁免或簡(jiǎn)化生物等效性（BE）試驗(yàn)的品種目錄，5 mg規(guī)格的葉酸片可豁免BE試驗(yàn)，采用體外評(píng)價(jià)的方法進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)。

口服固體制劑的體外評(píng)價(jià)方法主要是體外溶出度的測(cè)定[3-8]。溶出度試驗(yàn)是考察藥品內(nèi)在質(zhì)量的有效方法，同時(shí)可驗(yàn)證仿制藥與參比制劑的質(zhì)量一致性及處方工藝的一致性、合理性[9-11]。在臨床試驗(yàn)研究成本不斷攀升的背景下，采用有區(qū)分力的溶出曲線來(lái)剖析制劑的內(nèi)在質(zhì)量，無(wú)疑是提高生物等效性試驗(yàn)通過(guò)率的最有效和經(jīng)濟(jì)的手段[12-14]。本文以葉酸片為模型藥物，采用紫外分光光度法檢測(cè)葉酸含量，測(cè)定自制制劑與參比制劑在不同pH溶出介質(zhì)（0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液）中的溶出度，并使用相似因子（f2）法進(jìn)行溶出曲線的相似性評(píng)價(jià)，以期為葉酸片仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)和處方開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

860DL自動(dòng)溶出儀（美國(guó)Logan公司）；S40型pH酸度計(jì)[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Agilent 8454紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）；MS204TS/02電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；金怡SHA-2水浴振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

葉酸原料藥（河北冀衡藥業(yè)有限公司，批號(hào)：16050190）；葉酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100074-201715，含量：92.6 %）；葉酸參比制劑Speciafoldine（規(guī)格5 mg/片，批號(hào)：18FA098）；自制葉酸片（規(guī)格5 mg/片，山東省藥學(xué)科學(xué)院）；磷酸二氫鉀，乙酸鈉，氫氧化鈉，冰乙酸，鹽酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 葉酸供試品溶液的配制 取自制葉酸片，參考《中國(guó)藥典》2020年版二部中葉酸片溶出度檢查項(xiàng)方法[15]，分別以0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)（介質(zhì)體積為900 ml），轉(zhuǎn)速為75 r/min，溫度（37 ℃），分別于各時(shí)間點(diǎn)取樣，補(bǔ)液10 ml，取出的溶出液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 葉酸對(duì)照品溶液的配制 精密稱取葉酸對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置50 ml量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2 不同pH介質(zhì)中溶解度的測(cè)定

按國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》 中“溶出介質(zhì)配制方法”[16]，配制pH分別為1.0，2.0，3.5，4.5，5.0，5.5，6.0，6.8，7.8 的溶出介質(zhì)。取過(guò)量的葉酸原料藥，置 25 ml量瓶中，分別加入以上溶出介質(zhì)，超聲30 min 后置搖床中，37 ℃振蕩 24 h，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在281 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算不同 pH介質(zhì)中葉酸的溶解度，繪制葉酸在不同pH值條件下的溶解度曲線。見(jiàn)圖1。

圖1 葉酸的pH值-溶解度曲線

由圖1可見(jiàn)，葉酸的溶解度呈明顯的pH依賴性。隨著pH值的升高，葉酸的溶解度增大。即在酸性環(huán)境中難溶，在堿性環(huán)境中易溶。

2.3 不同pH溶液中穩(wěn)定性的測(cè)定

精密稱取葉酸原料藥適量，置100 ml量瓶中，加入pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解并定容，搖勻，作為葉酸原料藥貯備液。分別用不同介質(zhì)（0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液）對(duì)葉酸原料藥貯備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，使葉酸質(zhì)量濃度約為 5 μg/ml，分別于 0，1，2，4，8 h 取樣，按紫外-可見(jiàn)分光光度法在281 nm處測(cè)定吸光度?？疾烊~酸在不同溶出介質(zhì)中的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 葉酸在不同pH溶液中的穩(wěn)定性

結(jié)果表明，測(cè)定濃度下，葉酸在pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液中8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，但在0.1 mol/L鹽酸溶液中穩(wěn)定性相對(duì)較差，隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)其吸光度呈線性減小趨勢(shì)。

2.4 溶出曲線測(cè)定方法

取參比制劑或自制制劑12片，照溶出度檢查（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0931第二法）[17]，采用槳法，溶出介質(zhì)（0.1 mol/l鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液）經(jīng)超聲脫氣處理，介質(zhì)體積為900 ml，轉(zhuǎn)速為75 r/min，水溫為37 ℃，依法操作，在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)取溶液10 ml（同時(shí)補(bǔ)充10 ml 溶出介質(zhì)），過(guò)0.45 μm濾膜濾過(guò)，取濾液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在281 nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算每片溶出度。

式中，A為供試品溶液的吸光度；Wt為對(duì)照品質(zhì)量；S為供試品溶液的稀釋倍數(shù)；At為對(duì)照品溶液的吸光度；W為供試品標(biāo)示量；St為對(duì)照品溶液的稀釋倍數(shù)。

2.5 溶出曲線測(cè)定方法優(yōu)化

2.5.1 試驗(yàn)裝置 對(duì)于葉酸片，《日本藥典》第17版（JP17）中推薦槳法，《中國(guó)藥典》2020年版推薦籃法，因此對(duì)不同溶出裝置進(jìn)行了考察。取葉酸片的參比制劑，分別采用籃法、槳法測(cè)定其在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出度。結(jié)果見(jiàn)圖2。在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，槳法的溶出呈緩慢上升趨勢(shì)，直至全部溶出。而籃法5 min時(shí)基本已全部溶出且達(dá)平臺(tái)期，溶出速率過(guò)快，無(wú)法反應(yīng)參比制劑溶出過(guò)程中的質(zhì)量特性。且參比制劑處方中含磷酸氫鈣，密度大，易沉積，籃法不適用于本品溶出曲線研究。最終確定為槳法。

圖2 采用籃法和槳法測(cè)定的葉酸片在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出曲線

2.5.2 溶出轉(zhuǎn)速的選擇 溶出曲線研究和對(duì)比過(guò)程中應(yīng)采用較緩和的轉(zhuǎn)速，使溶出方法具有更好的區(qū)分能力。本文采用槳法，以pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液900 ml作為溶出介質(zhì)，不同時(shí)間點(diǎn)取樣10 ml，照紫外-可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)各樣品溶液和對(duì)照品溶液的吸光度，按下式計(jì)算累積溶出度。根據(jù)《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》[18]中“普通片劑槳法溶出轉(zhuǎn)速應(yīng)從低轉(zhuǎn)速開(kāi)始篩選”要求，以轉(zhuǎn)速 50，75 r/min 進(jìn)行篩選，測(cè)定參比制劑 （Speciafoldine?）的溶出曲線。

式中，Cn為各時(shí)間點(diǎn)取出的樣品溶液濃度；L為制劑標(biāo)示量；V1為各時(shí)間點(diǎn)固定的取樣體積；V2為溶出介質(zhì)體積。

結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，轉(zhuǎn)速75 r/min時(shí)，15 min已全部溶出并達(dá)到平臺(tái)期，溶出速率較快；在pH 5.0醋酸鹽緩沖液中，轉(zhuǎn)速75 r/min時(shí)，120 min全部溶出且達(dá)到平臺(tái)期。轉(zhuǎn)速降到50 r/min時(shí)，兩種介質(zhì)中溶出明顯減慢，且溶出杯底部有堆積，以至于在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)未達(dá)到溶出平臺(tái)，無(wú)法反應(yīng)參比制劑溶出過(guò)程中的質(zhì)量特性。因此溶出轉(zhuǎn)速選擇75 r/min。

圖3 葉酸片在不同轉(zhuǎn)速下的溶出曲線

2.5.3 溶出介質(zhì)的選擇 參照《中國(guó)藥典》2020年版二部葉酸片溶出度測(cè)定方法[15]、《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》[18]及葉酸在不同pH溶液中穩(wěn)定性，葉酸溶解度呈pH相關(guān)性，溶液pH對(duì)片劑溶出度的影響較大。因此在固體制劑常用的溶出介質(zhì)基礎(chǔ)上（0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和水）增加了pH 5.0醋酸鹽緩沖液。葉酸在pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液中8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；在0.1 mol/L鹽酸溶液中穩(wěn)定性相對(duì)較差，隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)其吸光度呈線性減小趨勢(shì)，但在此介質(zhì)中，可評(píng)估自制制劑與參比制劑在酸性環(huán)境中的降解情況。因各地水質(zhì)存在差異會(huì)引起pH值變化，故未選擇水作為葉酸片的溶出介質(zhì)。因此，最終確定0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液做為溶出介質(zhì)進(jìn)行溶出曲線相似性評(píng)價(jià)。

2.6 有區(qū)分力的溶出條件確定

參考《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》，采用槳法，轉(zhuǎn)速75 r/min，以0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)，測(cè)定并繪制參比制劑在各溶出條件下的溶出曲線，從中篩選出符合有區(qū)分力的溶出條件。

結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，葉酸溶解度較高，葉酸片溶出較快，難以體現(xiàn)自制片劑與參比制劑的差異。在0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液或pH 5.0醋酸鹽緩沖液中，葉酸溶解度較低，可篩選適宜的具有區(qū)分力的溶出條件。4種溶出介質(zhì)中葉酸參比制劑的溶出曲線差異明顯，其中符合45～60 min釋放達(dá)85 %或90～120 min達(dá)85 %，且溶出曲線無(wú)拐點(diǎn)和突釋的溶出介質(zhì)為pH 5.0醋酸鹽緩沖液。因此溶出介質(zhì)確定為pH 5.0醋酸鹽緩沖液。

圖4 葉酸片在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線

綜上，確定具有區(qū)分力的溶出條件為：槳法，轉(zhuǎn)速75 r/min，以pH 5.0醋酸鹽緩沖液900 ml為溶出介質(zhì)。

2.7 采用有區(qū)分力的溶出條件篩選葉酸片處方

以不同處方制備葉酸片（A、B、C），以市售的葉酸原研片作為參比制劑，以2.6項(xiàng)下具有區(qū)分力的溶出條件對(duì)葉酸片處方進(jìn)行篩選。溶出曲線見(jiàn)圖5。采用相似因子（f2）法比較溶出曲線相似性，當(dāng)兩條溶出曲線相似因子（f2）數(shù)值不小于50時(shí)，可認(rèn)為溶出曲線相似。制備處方以所得溶出曲線與參比制劑相似者，即f2因子數(shù)值最大者為佳。

圖5 葉酸自制片與參比制劑在具區(qū)分力條件下的溶出曲線

表2 葉酸自制片處方要點(diǎn)及相應(yīng)f2因子

由結(jié)果可知，不同處方制備的葉酸片在具有區(qū)分力的溶出條件下溶出曲線與參比制劑相似，相似因子f2均大于50，且隨著處方中原料藥與磷酸氫鈣的比值不同，相似因子f2也發(fā)生變化。當(dāng)采用處方B時(shí)，f2數(shù)值最大且最佳。因此，采用pH 5.0醋酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，對(duì)葉酸片的處方工藝有區(qū)分力。

2.8 溶出度測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

2.8.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)自制制劑的處方比例，制成不含主藥的空白輔料樣品 （約相當(dāng)于5 mg規(guī)格的葉酸片輔料量）。加pH 6.8磷酸鹽緩沖液25 ml溶解，并用pH 5.0醋酸鹽緩沖液25 ml稀釋成空白輔料溶液；另精密稱取葉酸對(duì)照品適量，置100 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液，精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，加pH 5.0醋酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。過(guò)濾，取續(xù)濾液，分別對(duì)葉酸對(duì)照品溶液和空白輔料溶液按照紫外-可見(jiàn)分光光度法在281 nm處測(cè)定吸光度，紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖6。結(jié)果證明空白輔料在281nm處無(wú)吸收，該方法專屬性良好。

圖6 葉酸專屬性紫外吸收光譜圖

2.8.2 線性試驗(yàn) 精密稱取葉酸對(duì)照品適量，置100 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解至刻度，搖勻，精密量取 0.5，1，2，5，8，10 ml，分別置100 ml量瓶中，加pH 5.0醋酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，制成葉酸質(zhì)量濃度（C）分別為 0.689，1.377，2.754，6.885，11.016，13.771 μg/ml的系列溶液；分別取上述系列溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在281 nm處測(cè)定吸光度。以C為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為Y=0.0600x+0.0024，相關(guān)系數(shù)r2為1.0000。表明葉酸片在0.689～13.771 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.3 精密度 分別取線性試驗(yàn)項(xiàng)下濃度為6.885 μg/ml的對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，濃度平均值為6.903 μg/ml，RSD為0.01 %，說(shuō)明精密度良好。

2.8.4 濾膜吸附性 取濃度為 6.885 μg/ml的葉酸對(duì)照溶液，用 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，分別取過(guò)濾前溶液及5，10，15，20，25，30，40，50，60 ml濾液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在281 nm處測(cè)定吸光度（A），A的RSD為0.82 %，表明濾膜對(duì)葉酸無(wú)吸附。

2.8.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取葉酸對(duì)照品適量，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液超聲溶解至刻度，搖勻， 作為對(duì)照品貯備液。精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，加pH 5.0醋酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品貯備液3，5，7 ml各3份，分別置9個(gè)100 ml量瓶中，加空白輔料約95 mg，加pH 5.0醋酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取對(duì)照品溶液及供試品溶液各適量，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在281 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為100.41 %，RSD為0.64 %，結(jié)果表明，方法準(zhǔn)確度良好。

以上溶出度方法學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)均滿足要求，提示建立的溶出度檢查方法可行。

2.9 自制制劑與參比制劑溶出對(duì)比

參照《普通口服固體制劑溶出度實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[18]，采用非模型依賴法中的相似因子（f2）法[19]比較自制制劑與參比制劑在0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出曲線相似性。按下式計(jì)算相似因子值。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 葉酸自制制劑和參比制劑在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線

式中，Rt為t時(shí)間參比樣品平均溶出量；Tt為t時(shí)間受試樣品平均溶出量；n為取樣時(shí)間點(diǎn)的個(gè)數(shù)。

由圖7可見(jiàn)，葉酸片自制制劑與參比制劑在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，15 min溶出度大于85 %，在其他3種介質(zhì)中，f2值均大于50。說(shuō)明自制制劑與參比制劑在4種溶出介質(zhì)中的溶出行為相似。

3 討論與結(jié)論

在口服固體制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)中，最為有效的手段是建立能體現(xiàn)參比制劑內(nèi)在質(zhì)量、具有區(qū)分力的溶出曲線。本研究通過(guò)篩選試驗(yàn)裝置、溶出轉(zhuǎn)速、溶出介質(zhì)等，確定葉酸片具有區(qū)分力的溶出條件：槳法，最佳轉(zhuǎn)速為75 r/min，pH 5.0醋酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)。此條件下，藥物的溶出曲線呈明顯的上升期和平臺(tái)期?？捎糜趨^(qū)別不同處方的葉酸片，經(jīng)驗(yàn)證方法重復(fù)性較好。

評(píng)價(jià)溶出曲線相似性的方法眾多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，有些側(cè)重于對(duì)整體溶出度進(jìn)行評(píng)價(jià)，有些則側(cè)重于對(duì)局部進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究采用的f2法為整體比較法，其中f2計(jì)算簡(jiǎn)便，能比較自制制劑與參比制劑溶出曲線的差異。具有區(qū)分力的葉酸片溶出曲線測(cè)定方法可用于區(qū)分不同處方工藝產(chǎn)品的質(zhì)量差異，有利于進(jìn)一步的處方篩選和工藝優(yōu)化。本研究建立的體外溶出度測(cè)定方法可為評(píng)價(jià)葉酸片仿制制劑的內(nèi)在質(zhì)量及一致性評(píng)價(jià)研究提供試驗(yàn)依據(jù)。在本品的一致性評(píng)價(jià)中，還應(yīng)關(guān)注原料藥粒徑、晶型等因素的影響，為處方工藝優(yōu)化提供全面技術(shù)支撐。