致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯酵母雙雜交文庫構(gòu)建及無毒蛋白PiAVR3b寄主靶標(biāo)篩選

韋 吉, 欒宏瑛, 王薈潔, 劉 晶, 王洪洋*, 陳愛娥

(1. 云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南省高校馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南師范大學(xué), 昆明 650500; 2. 云南師范大學(xué)教務(wù)處, 昆明 650500)

馬鈴薯Solanumtuberosum起源于南美洲安第斯山山脈一帶,是解決全球糧食短缺和消除貧困的重要作物。然而在生長過程中,馬鈴薯會受到各種各樣病蟲的危害,其中由卵菌中致病疫霉Phytophthorainfestans引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上最具毀滅性的病害。全球每年因馬鈴薯晚疫病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億歐元,馬鈴薯晚疫病已對世界糧食安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1]。

為了成功侵染寄主植物,病原菌會分泌大量效應(yīng)蛋白到植物細(xì)胞內(nèi)以干擾植物免疫系統(tǒng)。與大豆疫霉Phytophthorasojae、橡樹疫霉P.ramorum基因組相比,致病疫霉不僅基因組大(約 240 Mb),而且還含有更多的分泌型效應(yīng)子基因,RxLR胞質(zhì)效應(yīng)子(R:精氨酸;x: 任意氨基酸;L:亮氨酸)就是其中一類。通過對致病疫霉的基因組分析,發(fā)現(xiàn)有563個RxLR效應(yīng)子基因。這些 RxLR 效應(yīng)蛋白大多扮演著毒性因子的角色,致病疫霉通過吸器組織將其分泌到寄主細(xì)胞內(nèi)干擾植物免疫反應(yīng),從而使致病疫霉能夠快速侵染并在寄主植物中繁衍[2]。當(dāng)寄主植物細(xì)胞內(nèi)有抗病蛋白(resistance protein, R)時,R蛋白會特異性識別對應(yīng)的RxLR類效應(yīng)蛋白,從而激發(fā)ETI免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity)。然而,RxLR效應(yīng)蛋白除激發(fā)植物 ETI免疫反應(yīng)外,更多的功能是抑制病原相關(guān)分子模式激發(fā)的 PTI(PAMP-triggered immunity)或 ETI免疫反應(yīng)信號傳導(dǎo),從而大大減弱植物的抗性反應(yīng)[3-8]。

酵母雙雜交(yeast two-hybrid)技術(shù)是一種直接于酵母細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用且靈敏度很高的分子生物學(xué)方法。其原理是利用真核生物轉(zhuǎn)錄因子(GAL4等)的DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain, DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, DNA-AD),將待研究的病原菌效應(yīng)蛋白和寄主靶標(biāo)蛋白分別與BD和AD結(jié)構(gòu)域連接并共轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母菌中,若效應(yīng)蛋白和寄主靶標(biāo)蛋白存在互作,則轉(zhuǎn)錄因子的BD和AD結(jié)構(gòu)域相互靠近,即可轉(zhuǎn)錄激活下游報告基因的表達(dá),以此來檢測這2種蛋白互作的發(fā)生[9]。Du等[10]通過酵母雙雜交證實(shí)致病疫霉無毒蛋白AVR1與囊泡運(yùn)輸相關(guān)蛋白Sec5互作進(jìn)而促進(jìn)致病疫霉侵染寄主。Boevink等[11]利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白PITG_04314與植物蛋白磷酸酶 PP1c 催化亞基互作,并促進(jìn) PP1c從核仁轉(zhuǎn)運(yùn)到核質(zhì),但是 PITG_04314 并沒有影響 PP1c 的磷酸酶活性。研究者推測 PITG_04314 是通過與 PP1c 發(fā)生互作形成PITG_04314-PP1c復(fù)合體全酶形式負(fù)調(diào)控植物防御反應(yīng)。Turnbull等[12]利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)致病疫霉無毒蛋白AVR2靶向3個BSL家族成員(BSL1,BSL2,BSL3),通過調(diào)控油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)促進(jìn)致病疫霉侵染。同年,He等[13]通過酵母雙雜交證實(shí)致病疫霉效應(yīng)蛋白PiSFI3/Pi06087/PexRD16與U-box激酶 StUBK發(fā)生互作以抑制植物PTI免疫?？梢?酵母雙雜交在致病疫霉效應(yīng)蛋白與寄主靶標(biāo)蛋白研究方面有廣泛應(yīng)用。

PiAVR3b是一個典型的RxLR類效應(yīng)蛋白。當(dāng)寄主植物含有對應(yīng)抗病蛋白R3b時,PiAVR3b可作為無毒蛋白被R3b識別并激發(fā)ETI免疫反應(yīng)[14]。Zheng等[4]報道PiAVR3b可以抑制Flg22介導(dǎo)的早期PTI免疫反應(yīng)。Wang等[15]發(fā)現(xiàn) PiAVR3b能夠抑制致病疫霉效應(yīng)蛋白 PITG_22798 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)室前期證實(shí),瞬時表達(dá)PiAVR3b顯著促進(jìn)致病疫霉侵染本氏煙。上述研究表明,PiAVR3b在調(diào)控植物免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。但是,PiAVR3b如何參與調(diào)控植物免疫及寄主靶標(biāo)蛋白尚不清楚。本研究構(gòu)建了受致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯葉片cDNA文庫,并以PiAVR3b為誘餌篩選獲得4個寄主靶標(biāo)蛋白,為進(jìn)一步揭示PiAVR3b調(diào)控植物免疫分子機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯栽培種‘合作88’種植于云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院溫室。致病疫霉菌株88069(1.3.4.7)、PIC99183(1.3.4.5.7.8.10.11)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯課題組饋贈。對‘合作88’,PIC99183是毒性菌株;88069是無毒菌株,將兩菌株混合后接種‘合作88’用于構(gòu)建馬鈴薯酵母雙雜交cDNA文庫。PIC99183用于PiAVR3b基因克隆。根據(jù)候選互作靶標(biāo)基因編碼序列(coding sequence,CDS),利用Primer 3在線軟件(https:∥bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)進(jìn)行引物設(shè)計。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

酵母Y2HGold菌株、酵母Y187菌株、pGADT7、pGBKT7、pDONR222、pGADT7-DEST、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、DH10B、“pGADT7-T+pGBKT7-53”(1對強(qiáng)互作蛋白,后文簡稱53+T)、“pGADT7-T+pGBKT7-Lam”(1對不互作蛋白,后文簡稱Lam+T)購自上海歐易生物科技有限公司。具體載體信息、用途及構(gòu)建方法見酵母雙雜交使用手冊(Clontech,PT4084-1)。高保真酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、無縫克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。DNA純化回收試劑盒、植物總RNA提取試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司。酵母缺陷培養(yǎng)基SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade、YPD Plus液體培養(yǎng)基、X-α-Gal、鮭魚精DNA購自TaKaRa公司。CloneMiner Ⅱ cDNA 構(gòu)建試劑盒、FastTrack MAG mRNA分離試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯葉片cDNA文庫構(gòu)建

致病疫霉88069菌株和PIC99183菌株在黑麥固體培養(yǎng)基(每升含有黑麥60 g,蔗糖20 g,CaCO31.2 g,瓊脂15 g)上生長15 d左右,往長滿白色菌絲及孢子囊的培養(yǎng)皿里加入無菌水(3 mL/皿),用玻璃棒輕刮培養(yǎng)基表面菌絲,調(diào)整孢子囊濃度至104個/mL。將2個菌株孢子囊懸浮液等體積混合后接種‘合作88’離體葉片,取接種后24 h和48 h的葉片各20片,分別采用TRIzol 法提取兩個時間點(diǎn)總RNA并進(jìn)行等量混合,用DNaseⅠ消化酶去除殘留DNA后檢測總RNA濃度和純度,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。參照FastTrack MAG mRNA分離試劑盒和CloneMinerⅡcDNA合成試劑盒說明書,分離mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈,并合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA與attB1和attB2重組接頭連接(attB1-cDNA insert-attB2)后進(jìn)行分離與濃縮純化,利用 BP重組反應(yīng)(25℃連接16～20 h)將純化的cDNA和含有 attP1和attP2的載體pDONR222連接。將重組產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(1 500 V,200 Ω,25 μF),在轉(zhuǎn)化體系中加入 4 mL SOC培養(yǎng)基225～250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,涂布平板,次日用SOC培養(yǎng)基洗板3次,100 mL無菌離心管收集菌液,往離心管中加甘油至終濃度20%并保存于-80℃,即為初級文庫菌液。從初級文庫菌液中提取質(zhì)粒,將質(zhì)粒與pGADT7-DEST進(jìn)行 LR 重組反應(yīng)(25℃連接16～20 h),將重組產(chǎn)物純化后電激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B,在轉(zhuǎn)化體系中加入4 mL SOC培養(yǎng)基225～250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,取樣涂布平板確定庫容量;剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度 20%存于-80℃,即為次級文庫菌液。隨后從次級文庫菌液中提取質(zhì)粒,將5 μg次級文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入Y187酵母菌株中,用于后續(xù)酵母雙雜交。

1.2.2cDNA文庫容量、重組率及插入片段長度的鑒定

取初級、次級文庫細(xì)菌原液10 μL稀釋100倍,分別取50 μL初級、次級文庫稀釋液涂布于含50 mg/L Kan和50 mg/L Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上,第2天計數(shù)鑒定庫容量。文庫菌液庫容量(cfu/mL)=平板上的克隆數(shù)/50 μL×100倍×1 000 μL。文庫總庫容量=文庫菌液庫容量×文庫菌液總體積(mL)。從各級文庫中隨機(jī)挑取24個克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。初級文庫菌落PCR鑒定引物為M13(F: 5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′; R:5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′);次級文庫菌落PCR鑒定引物為pGADT7-DEST (F: 5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′; R: 5′-GTG-AACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′)。引物序列詳見酵母雙雜交使用手冊(Clontech,PT4084-1)。PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5 min;95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 3 min,35個循環(huán);72℃ 5 min;16℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,統(tǒng)計重組率及插入片段長度。

1.2.3誘餌載體構(gòu)建

參照無縫克隆試劑盒說明書,根據(jù)無毒基因PiAVR3b的核酸序列和pGBKT7載體酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ和BamHⅠ),設(shè)計基因特異引物BD-PiAVR3b(表1),以致病疫霉菌株P(guān)IC99183的DNA為模板,利用DNA高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后與pGBKT7進(jìn)行同源重組,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒,采用T7測序引物(表1)測序后獲得誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b?；驕y序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)引物1)Table 1 Primer sequences used in yeast two-hybrid peer to peer verification

續(xù)表1 Table 1(Continued)

1.2.4誘餌載體自激活和毒性檢測

挑取酵母菌株Y2HGold劃線于YPDA 平板上,30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d左右,挑取單克隆酵母制備成感受態(tài)細(xì)胞,采用PEG/LiAc法將誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b和pGBKT7空載體分別轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞,酵母菌液涂布于SD/-Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),3～5 d后觀察平板上酵母克隆的生長狀態(tài),若轉(zhuǎn)化誘餌載體與轉(zhuǎn)化空載體的克隆大小相近,生長數(shù)量近似,則證明pGBKT7-PiAVR3b對酵母菌株無毒性。將含有誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b、空載體pGBKT7、53+T (陽性對照)、Lam+T (陰性對照)的Y2HGold酵母菌,分別接種于SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上,30℃倒置培養(yǎng)3～5 d 后統(tǒng)計酵母生長情況。若pGBKT7-PiAVR3b在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上不能生長,則表明誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b不存在自激活現(xiàn)象。若生長且變藍(lán)色則說明誘餌載體存在自激活。

1.2.5PiAVR3b互作蛋白篩選

參照酵母雙雜交使用手冊(Clontech,PT4084-1),挑取直徑2～3 mm含有誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b的單克隆酵母菌株Y2HGold接種到50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中,30℃ 250～270 r/min過夜培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8;1 000 g離心濃縮去上清液,用4～5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸酵母菌并轉(zhuǎn)移到2 L無菌三角瓶中;往三角瓶中加入1 mL含次級文庫質(zhì)粒的Y187酵母菌液和45 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan);30℃ 30～50 r/min共培養(yǎng)20～24 h。顯微鏡下觀察雜交液是否出現(xiàn)米奇頭或三葉草形狀的結(jié)合子,有則繼續(xù)下面的操作:1 000 g 離心10 min,用10 mL 0.5×YPDA(含有 50 μg/mL Kan) 重懸細(xì)胞,按每皿200 μL量涂布在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal培養(yǎng)基上,培養(yǎng)5 d后,若出現(xiàn)藍(lán)色酵母克隆,則說明可能存在與PiAVR3b互作的蛋白。挑選藍(lán)色陽性克隆劃線于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)。同時,將陽性對照和陰性對照酵母菌也劃線于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后,提取正常生長酵母質(zhì)粒,并以其質(zhì)粒為模板,利用pGADT7載體測序引物(T7, 表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果在馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(PGSC: http:∥solanaceae.plantbiology.msu.edu/)和NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析。

1.2.6酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)分析

為了驗(yàn)證酵母雙雜交初篩的互作蛋白是否真的與PiAVR3b發(fā)生互作,用設(shè)計的10個候選互作基因特異引物AD系列(表1) 對‘合作88’的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以EcoRⅠ和BamHⅠ為酶切位點(diǎn),將擴(kuò)增產(chǎn)物通過無縫克隆試劑盒克隆到pGADT7載體中。將pGADT7-AD1至pGADT7-AD10分別與誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中。以53+T為陽性對照,Lam+T為陰性對照,涂布在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上。30℃倒置培養(yǎng)3～5 d左右,若酵母正常生長且變藍(lán)色則可判斷初篩的互作蛋白與PiAVR3b發(fā)生互作。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯葉片cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)量鑒定

將10 μL初級文庫細(xì)菌原液稀釋100倍后取50 μL稀釋液涂布于LB平板(含50 mg/L Kan)上,次日統(tǒng)計,平板上共有單克隆1 600個,計算得出初級文庫總庫容量為1.28×107cfu/mL。隨機(jī)挑取24個單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,24個單克隆均成功擴(kuò)增,擴(kuò)增片段平均長度在1 000 bp左右,說明初級文庫中馬鈴薯cDNA插入率為100%(圖1a和1b)。將10 μL次級文庫細(xì)菌原液稀釋100倍后進(jìn)行次級文庫庫容量鑒定。取50 μL稀釋液涂布LB平板(50 mg/L Amp)上,次日統(tǒng)計,平板上共有單克隆2 000個,計算得出次級文庫總庫容量為1.6×107cfu/mL。隨機(jī)挑取24個單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,24個單克隆均成功擴(kuò)增,擴(kuò)增片段平均長度在1 000 bp左右,說明次級文庫中馬鈴薯cDNA插入率為100%(圖1c和1d)。結(jié)果表明,構(gòu)建的馬鈴薯葉片cDNA文庫容量足夠大,可以滿足篩選互作蛋白的文庫要求。

圖1 致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯酵母雙雜交初級、次級文庫構(gòu)建及質(zhì)量檢測Fig.1 Construction and evaluation of the primary and secondary yeast two-hybrid cDNA library in potato induced by Phytophthora infestans

2.2 誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b構(gòu)建

以致病疫霉菌株P(guān)IC99183的DNA為模板,BD-PiAVR3b為基因特異引物(表1),PCR擴(kuò)增得到片段大小與預(yù)期目標(biāo)片段大小一致(387 bp)(圖2a)。利用膠回收試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化,通過同源重組方式將基因片段插入pGBKT7載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,菌落PCR篩選陽性克隆,提取陽性克隆的質(zhì)粒,經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證確定誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b構(gòu)建成功(圖2b)。

圖2 pGBKT7-PiAVR3b誘餌載體構(gòu)建Fig.2 Construction of bait vector pGBKT7-PiAVR3b

2.3 PiAVR3b自激活和毒性檢測

以質(zhì)粒組合53+T為陽性對照,質(zhì)粒組合Lam+T為陰性對照,將構(gòu)建好的pGBKT7-PiAVR3b和pGBKT7空載體按照Clontech酵母轉(zhuǎn)化方案進(jìn)行酵母細(xì)胞毒性和自激活驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化pGBKT7-PiAVR3b的酵母單克隆和轉(zhuǎn)化pGBKT7空載體的克隆相比,大小和數(shù)量較一致,說明其對酵母細(xì)胞不產(chǎn)生毒性,可用于后續(xù)的馬鈴薯酵母雙雜交文庫篩選(圖3a)。質(zhì)粒pGBKT7-PiAVR3b和pGBKT7空載體均可在SD/-Trp培養(yǎng)基中正常生長,而不能在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長,而陽性對照單克隆酵母可正常生長且顯藍(lán)色,陰性對照則不生長,表明構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b無自激活(圖3b)。

圖3 pGBKT7-PiAVR3b誘餌載體自激活驗(yàn)證Fig.3 Validation of self-activation of bait vector pGBKT7-PiAVR3b

2.4 PiAVR3b互作蛋白的篩選

將含有誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b的Y2HGold酵母菌株與含有經(jīng)致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯酵母文庫的Y187酵母菌株進(jìn)行雜交,雜交24 h后涂布在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩,培養(yǎng)5 d后將初篩藍(lán)色陽性克隆轉(zhuǎn)移至SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上,經(jīng)篩選后共獲得28個陽性克隆(圖4)。提取28個陽性酵母克隆的質(zhì)粒,以質(zhì)粒為模板,T7為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行純化、回收、測序。測序序列經(jīng)BLAST比對分析,去除相同序列的陽性克隆,初步獲得10個候選靶標(biāo)(表2)。

圖4 無毒蛋白PiAVR3b互作蛋白的篩選Fig.4 Screening of candidate interaction protein for avirulence protein PiAVR3b

表2 無毒蛋白PiAVR3b的互作蛋白Table 2 Candidate interaction proteins of avirulence protein PiAVR3b

2.5 酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證候選PiAVR3b靶標(biāo)蛋白

為了進(jìn)一步驗(yàn)證候選靶標(biāo)與無毒蛋白PiAVR3b存在互作,將上述10個候選靶標(biāo)基因的CDS序列分別重組連接到pGADT7載體上,將構(gòu)建好的10個pGADT7-候選靶標(biāo)質(zhì)粒分別與pGBKT7-PiAVR3b共同轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證,以53+T為陽性對照,Lam+T為陰性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上只有4個候選靶標(biāo)蛋白與PiAVR3b存在互作(圖5),分別是馬鈴薯線粒體外膜孔蛋白(AD-6)、MYB-like蛋白(AD-7)、碳分解代謝抑制蛋白(AD-9)、肽基脯氨酰異構(gòu)酶(AD-10)。

圖5 酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證無毒蛋白PiAVR3b 靶標(biāo)蛋白Fig.5 Validation of the target proteins for avirulence protein PiAVR3b by using yeast two-hybrid peer to peer verification

3 討論

高質(zhì)量cDNA文庫是酵母雙雜交系統(tǒng)篩選互作蛋白的有力保證,而cDNA文庫質(zhì)量主要取決于RNA完整性、文庫容量[16]。本研究構(gòu)建的經(jīng)致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯酵母雙雜交次級文庫庫容量為1.6×107cfu/mL,插入片段平均在1 000 bp以上,重組插入率為100%,可以滿足低豐度表達(dá)蛋白的互作篩選。對文庫中10個互作蛋白的CDS序列分析結(jié)果顯示，其中4個互作蛋白是全長CDS。上述結(jié)果說明構(gòu)建的馬鈴薯酵母雙雜交文庫質(zhì)量較好,能夠用于致病疫霉效應(yīng)蛋白的寄主靶標(biāo)蛋白篩選。

RxLR效應(yīng)蛋白通過調(diào)控植物轉(zhuǎn)錄因子、蛋白降解、泛素化、RNA 剪切等方面干擾植物免疫信號傳導(dǎo),從而促進(jìn)致病疫霉侵染。然而,目前只發(fā)現(xiàn)了少數(shù)RxLR效應(yīng)蛋白的寄主靶標(biāo)[17]。篩選與鑒定效應(yīng)蛋白的寄主互作靶標(biāo)對進(jìn)一步揭示效應(yīng)子毒性功能和致病疫霉的致病機(jī)理至關(guān)重要。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核酵母細(xì)胞內(nèi)研究蛋白之間是否存在互作的一種方法,具有高靈敏度、廣泛應(yīng)用等特點(diǎn)。本研究構(gòu)建了致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯酵母雙雜交cDNA文庫,并以無毒蛋白PiAVR3b為誘餌,篩選到4個候選靶標(biāo)蛋白。經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn),這4個候選靶標(biāo)蛋白分別是馬鈴薯MYB-like蛋白、線粒體外膜孔蛋白、碳分解代謝抑制蛋白、肽基脯氨酰異構(gòu)酶。其中,碳分解代謝抑制蛋白在植物和微生物中功能保守,與植物免疫無關(guān)。推測其為假陽性互作蛋白。

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生長發(fā)育的多個方面起著重要的作用,是植物中較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[18]。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁重要成分,在增強(qiáng)植物ETI免疫方面發(fā)揮著重要功能。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥ArabidopsisthalianaMYB15突變體細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量降低,接種丁香假單胞菌Pseudomonassyringae無毒菌株后抗性下降,有病斑形成,而對照野生型則表現(xiàn)明顯的過敏反應(yīng)[19]。另外,擬南芥MYB20、MYB42、MYB43和MYB85轉(zhuǎn)錄因子均有促進(jìn)次生細(xì)胞壁中的木質(zhì)素和苯丙氨酸生物合成功能[20]。植物細(xì)胞表皮蠟質(zhì)對抵抗生物脅迫具有重要功能。蘋果MaluspumilaMdMYB30通過調(diào)控蠟質(zhì)合成基因MdKCS1表達(dá)促使細(xì)胞表皮蠟質(zhì)合成,從而增加對蘋果輪紋病的抗性[21]。蘋果MdMYB73通過調(diào)控體內(nèi)水楊酸合成進(jìn)而增強(qiáng)其對潰瘍病的抗性[22]。超量表達(dá)番茄LycopersiconesculentumMYB49可以顯著增強(qiáng)番茄植株對致病疫霉的抗性以及對干旱、鹽脅迫等的耐受性[23]。另外,MYB轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物黃酮醇、花青素等次生代謝產(chǎn)物合成方面也發(fā)揮著重要作用[24]。課題組前期分析馬鈴薯MYB轉(zhuǎn)錄因子家族共有217個基因,其中1R-MYB類有90個,R2R3-MYB類有124個,R1R2R3-MYB類有3個[24]。本研究篩選獲得的候選靶標(biāo)蛋白MYB-like屬于1R-MYB類,推測PiAVR3b靶向調(diào)控該轉(zhuǎn)錄因子影響寄主木質(zhì)素,蠟質(zhì)或水楊酸等合成,從而導(dǎo)致馬鈴薯抗病性降低。

線粒體外膜孔蛋白負(fù)責(zé)線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間的信息傳遞,對細(xì)胞功能的正常發(fā)揮具有重要作用。在植物受到病原菌侵染時,部分線粒體外膜孔蛋白被誘導(dǎo)表達(dá),促使活性氧從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放從而增強(qiáng)植物抗病免疫[25]。研究發(fā)現(xiàn)線粒體外膜孔蛋白VpVDAC3通過與病程相關(guān)蛋白VpPR10.1互作增強(qiáng)葡萄對霜霉病菌的抗性[26]。擬南芥受丁香假單胞菌侵染時,體內(nèi)4個線粒體外膜孔蛋白均上調(diào)表達(dá)[27]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),研究人員發(fā)現(xiàn)線粒體外膜孔蛋白在油菜抗黑腐病品種中表達(dá)豐度明顯高于感病品種[28]。候選靶標(biāo)線粒體外膜孔蛋白有可能參與馬鈴薯抗晚疫病,同時與PiAVR3b發(fā)生互作,兩者之間如何調(diào)控馬鈴薯對晚疫病的抗性有待深入研究。

肽基脯氨酰異構(gòu)酶廣泛參與植物響應(yīng)生物與非生物脅迫反應(yīng)[29]。研究發(fā)現(xiàn)丁香假單胞菌侵染擬南芥時,肽基脯氨酰異構(gòu)酶類AtCYP19-1和AtCYP57基因被誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)抑制AtCYP19-1和AtCYP57基因表達(dá)時,植株表現(xiàn)感病,超量表達(dá)則增強(qiáng)植株抗病性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AtCYP19-1和AtCYP57超量表達(dá)植株促進(jìn)類活性氧爆發(fā)和胼胝質(zhì)積累從而增強(qiáng)植株抗病性[30-31]。肽基脯氨酰異構(gòu)酶FKBP15在擬南芥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫感知和介導(dǎo)植物免疫方面發(fā)揮重要功能,研究發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉Phytophthoracapsici無毒蛋白PcAvr3a12可以抑制FKBP15酶活從而促進(jìn)辣椒疫霉侵染擬南芥[32]。另外,肽基脯氨酰異構(gòu)酶類AtCYP20-3以茉莉酸合成途徑中對12-氧-植物二烯酸的受體形式調(diào)控擬南芥對腐生真菌的抗性[33]。本研究中,候選靶標(biāo)肽基脯氨酰異構(gòu)酶是否影響致病疫霉侵染及PiAVR3b是否依賴其發(fā)揮毒性有待進(jìn)一步研究。

4個候選靶標(biāo)蛋白均與PiAVR3b互作,一方面可能由于PiAVR3b通過靶向寄主不同蛋白來調(diào)控植物免疫,類似PiAVR-blb2[34-35]。因此需要對4個候選靶標(biāo)是否參與寄主抗病免疫反應(yīng)進(jìn)行鑒定。另一方面由于酵母雙雜交技術(shù)存在一定的假陽性[17],需要進(jìn)一步通過其他蛋白質(zhì)互作技術(shù)對候選靶標(biāo)與PiAVR3b的互作真實(shí)性進(jìn)行鑒定,例如蛋白質(zhì)免疫共沉淀、雙分子熒光互補(bǔ)、蛋白體外pull-down技術(shù)等。通過上述兩個方面進(jìn)行PiAVR3b靶標(biāo)蛋白鑒定,將為進(jìn)一步揭示PiAVR3b的作用機(jī)制提供依據(jù)。

綜上,本研究構(gòu)建了經(jīng)致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯酵母雙雜交cDNA文庫,文庫具有較高轉(zhuǎn)化效率和重組效率,并以致病疫霉無毒蛋白PiAVR3b為誘餌,經(jīng)酵母雙雜交篩選到4個候選PiAVR3b靶標(biāo)蛋白,為后續(xù)研究PiAVR3b如何調(diào)控植物免疫及致病疫霉與馬鈴薯互作奠定基礎(chǔ)。