許錦程，畢亞玲，李君君，戴魏真，許孟桃，谷承文

(1.安徽科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，安徽鳳陽 233100；2.安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安徽鳳陽 233100)

隨著除草劑使用面積的大幅度增加，雜草抗性問題已成為其高效應(yīng)用的阻礙?；瘜W(xué)除草劑長期施用導(dǎo)致抗性雜草的數(shù)量快速上升[1]。截至目前，共有263種雜草(雙子葉植物152種，單子葉植物111種)對除草劑產(chǎn)生不同程度抗藥性[2]。精噁唑禾草靈(fenoxaprop-P-ethyl)屬于乙酰輔酶A羧化酶抑制劑(acetyl-coA carboxylase,ACCase)，在我國用藥歷史較長，因其活性高、防效好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于防治日本看麥娘(Alopecurusjaponicus)[3-5]。其主要通過抑制丙二酰輔酶和ADP的形成從而發(fā)揮作用，使植物無法正常合成所需的脂肪酸，導(dǎo)致日本看麥娘死亡[6]。但郭 峰[7]于2011年報(bào)道，采自河南、江蘇、山東等地的日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈已產(chǎn)生不同程度的抗藥性，抗性指數(shù)高達(dá)35.64；畢亞玲等[3]在2015年報(bào)道，采自安徽省定遠(yuǎn)縣的日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性指數(shù)達(dá)33.82?？剐匀毡究贷溎锏群瘫究齐s草的大面積發(fā)生，現(xiàn)已成為威脅小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要阻礙。

目前，關(guān)于雜草抗性的研究主要集中在靶標(biāo)抗性(TSR)和非靶標(biāo)抗性(NTSR)兩方面。徐洪樂[8]在2015年證實(shí)，基因表達(dá)量差異是導(dǎo)致日本看麥娘產(chǎn)生靶標(biāo)抗性的原因之一；趙 寧[9]在2019年發(fā)現(xiàn)，乙酰乳酸合成酶基因1 781位突變是導(dǎo)致日本看麥娘對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性的重要原因。非靶標(biāo)抗性主要包括屏蔽、隔離、代謝三種作用方式，其中除草劑的代謝作用較廣泛，所涉及的代謝酶類主要為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases,GSTs)和細(xì)胞色素P450氧化酶等，其能夠在機(jī)體受到有毒物質(zhì)威脅時(shí)，將有毒物質(zhì)代謝掉，保護(hù)細(xì)胞免受傷害，在許多生物體內(nèi)擔(dān)任解毒系統(tǒng)角色[10]；因其能夠參與調(diào)節(jié)雜草內(nèi)部的解毒代謝活性，所以其代謝能力增強(qiáng)目前被認(rèn)為是高等植物對除草劑產(chǎn)生非靶標(biāo)抗性的主要原因[11]。

江淮地區(qū)是我國重要的小麥產(chǎn)區(qū)之一，日本看麥娘等禾本科雜草在小麥田的發(fā)生較為嚴(yán)重[12]。而目前關(guān)于雜草抗性的研究多集中在靶標(biāo)抗性和抗性檢測方面[13-17]?；诖耍驹囼?yàn)采集江淮部分地區(qū)日本看麥娘種群，測定其對精噁唑禾草靈的抗性水平及部分種群的ACCase基因，將GSTs酶抑制劑滅草環(huán)、三聚氯氰、NBD-Cl和P450s酶抑制劑PBO、馬拉硫磷與精噁唑禾草靈聯(lián)合作用，以探尋日本看麥娘可能存在的靶標(biāo)抗性機(jī)制和GSTs、P450s代謝酶抑制劑對精噁唑禾草靈的作用；并測定抗精噁唑禾草靈種群對8種不同類型除草劑的抗性，為該麥區(qū)科學(xué)防除抗性日本看麥娘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試種群

供試日本看麥娘種群種子于2019-2020年采自江淮部分地區(qū)麥田，以未施用除草劑的非耕地田塊種子為對照，具體種群信息如表 1，種子晾曬風(fēng)干后置于0～5 ℃冷藏庫中保存待用。

表1 不同日本看麥娘種群信息

1.1.2 供試藥劑

除草劑：69 g·L-1精噁唑禾草靈水乳劑(fenoxaprop-P-ethyl)，拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司；108 g·L-1高效氟吡甲禾靈乳油(haloxyfop-R-methyl)，山東湯普樂作物科學(xué)有限公司；15%炔草酯可濕性粉劑(clodinafop-propargyl)，浙江天豐生物科學(xué)有限責(zé)任公司；5%唑啉草酯乳油(pinoxaden)，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；12.5%烯禾啶乳油(sethoxydim)，中農(nóng)立華(天津)農(nóng)用化學(xué)品有限公司；30 g·L-1甲基二磺隆油懸浮劑(mesosulfuron-methyl)，拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司；7.5%啶磺草胺水分散粒劑(pyroxsulam)，科迪華農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司；70%氟唑磺隆水分散粒劑(flucarbazone-sodium)，浙江天一生物科技有限公司；50%異丙隆可濕性粉劑(isoproturon)，江蘇快達(dá)農(nóng)化股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 日本看麥娘培養(yǎng)

選擇飽滿度相同的日本看麥娘種子，用75%酒精對種子進(jìn)行消毒3～5 min，再用蒸餾水清洗種子三次；置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，于GXZ型光照智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)(光/暗): 12 h/12 h; 溫度：24 ℃/20 ℃)；待種子催芽露白(3 d)之后，均勻播入含有營養(yǎng)混合土(砂土∶基質(zhì)=1∶1，總養(yǎng)分含量63%)的直徑為12 cm塑料盆中，每盆15顆，覆土0.5 cm以蓋住種子，吸透水后置于溫室內(nèi)(光/暗): 16 h/8 h; 溫度：25 ℃; 相對濕度60%～75%)培養(yǎng)。定期觀察日本看麥娘的生長情況，當(dāng)日本看麥娘長至一葉一心期，剔除過大和過小幼苗，定苗至每盆10株。

1.2.2 不同日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性水平測定

采用整株水平生物測定法，參照《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則》NY/T 1155.4-2006進(jìn)行[18]。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量，麥田種群劑量為0、15.0、45.0、135.0、405.0和1 215.0 g(a.i.)·hm-2，對照種群劑量為0、1.7、5.0、15.0、45.0和135.0 g(a.i.)·hm-2。不同種群共設(shè)6個(gè)處理，每處理3次重復(fù)。藥劑的配制使用母液稀釋梯度法，用0.1%的吐溫-80水溶液稀釋定容配制成母液，以0.1%吐溫-80水溶液(不含藥劑)做空白對照[19]。待日本看麥娘長至3葉1心，使用HCL-2000行走式噴霧塔對日本看麥娘精準(zhǔn)噴霧，噴液壓力40 psi，扇形噴頭，噴液量450 L·hm-2，噴液面距離日本看麥娘頂端葉片50 cm[20]。施藥后置于日光溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，溫、濕度管理同上。藥后21 d剪取日本看麥娘地上部分，稱量鮮重，計(jì)算鮮重抑制率(對照地上部分鮮重-各處理地上部分鮮重)/對照地上部分鮮重×100%)；以試驗(yàn)劑量對數(shù)值(x)與鮮重抑制率幾率值(y)擬合毒力回歸方程(y=a+bx)，計(jì)算GR50值及95%置信限；計(jì)算抗性指數(shù)(resistance index,RI抗性種群GR50/敏感種群GR50)。雜草抗性分級標(biāo)準(zhǔn)如下，中抗性：RI≤10.00；高抗RI>10.00[2]。

1.2.3 不同抗性日本看麥娘種群ACCase基因差異檢測

從各地區(qū)中各選取一個(gè)高抗、中抗種群和敏感種群進(jìn)行測定。日本看麥娘培養(yǎng)至3葉1心時(shí)，剪取植株幼嫩葉片組織，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。DNA的提取采用CTAB法[21]。使用已報(bào)道的ACCase基因序列(JQ068820.1)設(shè)計(jì)引物[22]，擴(kuò)增引物為FP : 5′-TTTCCCAGCGGCAGACAGAT-3′，RP : 5′-TCCCTGGAGT- CTTGCTTTCA- 3′，瓊脂糖凝膠電泳后，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，對測序結(jié)果進(jìn)行分析。擴(kuò)增的區(qū)域包含已證實(shí)的ACCase CT區(qū)域發(fā)生突變的7個(gè)位點(diǎn)[3]。

1.2.4 GSTs、P450s酶抑制劑對精噁唑禾草靈的效應(yīng)測定

供試種群同1.2.3，待日本看麥娘長至3葉1心，分別噴施滅草環(huán)150 g(a.i.)·hm-2、三聚氯氰180 g(a.i.)·hm-2、NBD-Cl 270 g(a.i.)·hm-2、PBO 4 200 g(a.i.)·hm-2、馬拉硫磷 1 000 g(a.i.)·hm-2，待葉片上霧滴晾干(約 1 h)，噴施不同劑量精噁唑禾草靈，噴施劑量同 1.2.2，以單獨(dú)施用精噁唑禾草靈對照，不同處理三次重復(fù)。藥后28 d計(jì)算施用酶抑制劑后的GR50和各參數(shù)，按下式計(jì)算增效倍數(shù)。

增效倍數(shù)(SR)=單劑的GR50/(酶抑制劑+單劑)的GR50

1.2.5 抗精噁唑禾草靈種群對其他除草劑的抗性測定

為明確抗性種群對不同類型除草劑的抗性，選取8種小麥田除草劑進(jìn)行試驗(yàn)，方法同1.2.2，試驗(yàn)劑量見表2。

表2 供試除草劑及測定劑量

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用DPS 7.05對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本看麥娘對精噁唑禾草靈的抗性分析

由表3可見，供試日本看麥娘各種群均對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了不同程度的抗性。對照AH-7對精噁唑禾草靈較敏感，GR50值為25.21 g(a.i.)·hm-2。安徽省供試種群AH-40、AH-42、AH-43、AH-44均達(dá)到高抗水平，抗性指數(shù)分別為18.54、14.90、14.68、 14.12，占種群總數(shù)的40%；其中，采自安徽省淮南市鳳臺縣夏集鎮(zhèn)的種群AH-40的GR50值最高，為467.28 g(a.i.)·hm-2，是其大田推薦劑量62.1 g(a.i.)·hm-2的7.5倍。江蘇省供試日本看麥娘種群僅有JS-19達(dá)到高抗水平，占供試種群總數(shù)的10%，其他均為中抗，但其GR50仍高于該藥劑的推薦劑量。供試日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性為：AH-40>AH-42>AH-43>AH-44>JS-19>JS-21>JS-20>JS-18>AH-41(表3)。

表3 日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性水平

2.2 抗性日本看麥娘ACCase基因分析

對日本看麥娘敏感種群AH-7、抗性種群AH-40、AH-41、JS-19、JS-20進(jìn)行ACCase基因擴(kuò)增序列(JQ068820. 1)同源性均達(dá)95.8%以上，確定擴(kuò)增序列為日本看麥娘ACCase基因序列。將測序結(jié)果與日本看麥娘(A.japonicus)的ACCase基因序列進(jìn)行比對，供試種群在可引起靶標(biāo)抗性的位點(diǎn)處均未發(fā)現(xiàn)突變。

2.3 GSTs、P450s代謝酶抑制劑對精噁唑禾草靈的效應(yīng)

如表4所示，噴施GSTs酶抑制劑后，敏感種群AH-7對精噁唑禾草靈的敏感性略有增加；抗性種群AH-40、JS-19 對精噁唑禾草靈的GR50值均下降，其中，NBD-Cl能顯著降低抗性種群AH-40對精噁唑禾草靈的抗性，增效倍數(shù)達(dá)2.45；而抗性種群AH-41、JS-20對精噁唑禾草靈的GR50并未有下降的趨勢，表明GSTs酶抑制劑未對其產(chǎn)生增效作用。由表5可知，施用2種P450s酶抑制劑后，AH-40種群對精噁唑禾草靈的GR50有所下降，增效倍數(shù)為1.64～2.03，表明P450s酶抑制劑對該種群具有增效作用；而AH-41、JS-19、JS-20在施用P450s酶抑制劑后，并未產(chǎn)生增效作用。結(jié)果顯示，施用代謝酶抑制滅草環(huán)、三聚氯氰、NBD-Cl、PBO、馬拉硫磷后，抗性種群AH-40對精噁唑禾草靈的GR50均有所下降；施用滅草環(huán)、三聚氯氰、NBD-Cl后，抗性種群JS-19對精噁唑禾草靈的GR50有所下降。供試酶抑制劑對其他抗性種群未產(chǎn)生明顯增效作用。

表4 添加GSTs酶抑制劑后對日本看麥娘各種群的劑量反應(yīng)曲線參數(shù)比較

表5 添加P450s酶抑制劑后對日本看麥娘各種群的劑量反應(yīng)曲線參數(shù)比較

2.4 抗精噁唑禾草靈種群對其他除草劑的抗性

由表6可知，抗性種群AH-40對炔草酯、甲基二磺隆表現(xiàn)為高抗，抗性指數(shù)為14.67、19.91，對其他供試藥劑均表現(xiàn)為中抗，對唑啉草酯、啶磺草胺、異丙隆敏感，抗性指數(shù)在0.59～2.09之間。AH-41對高效氟吡甲禾靈、炔草酯、甲基二磺隆表現(xiàn)高抗，抗性指數(shù)分別為 16.40、18.93、28.84，而對其余藥劑中抗。JS-19對高效氟吡甲禾靈、炔草酯、甲基二磺隆高抗，抗性指數(shù)分別為 50.32、19.37、 28.42，對唑啉草酯、啶磺草胺、異丙隆敏感。JS-20對炔草酯、烯禾啶、甲基二磺隆表現(xiàn)為高抗，而對啶磺草胺、異丙隆較為敏感。綜上所述，4個(gè)抗性種群均對炔草酯、AH-41和JS-19對高效氟吡甲禾靈、JS-20對烯禾定均有高水平抗性，其他抗性種群對各藥劑的抗性水平均在中等抗性水平范疇。此外，4個(gè)供試抗性種群均對甲基二磺隆高抗，但均對唑啉草酯、啶磺草胺、氟唑磺隆、異丙隆較為敏感，可作為江淮地區(qū)防除抗性日本看麥娘的替代藥劑。

表6 抗性種群對8種除草劑的抗性

3 討 論

日本看麥娘是江淮地區(qū)冬小麥田的惡性雜草之一，黃紅娟等[23]、高興祥等[24]通過調(diào)查長江中下游與黃淮海地區(qū)小麥田雜草群落發(fā)現(xiàn)，日本看麥娘在優(yōu)勢度比較中均排在前列，嚴(yán)重影響著該地區(qū)小麥的高質(zhì)量生產(chǎn)。本研究通過測定采自江淮地區(qū)的日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性水平發(fā)現(xiàn)，供試種群均對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了不同程度的抗性，產(chǎn)生高水平抗性的種群數(shù)量占種群總數(shù)的50%，抗性指數(shù)最高達(dá)18.54，這與趙 寧等[9]的研究結(jié)果略有不同，可能與采集地點(diǎn)有關(guān)系。造成日本看麥娘對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗藥性的原因與當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展水平、用藥習(xí)慣、單一藥劑的使用年限和耕作制度等因素均有關(guān)系。

相較于靶標(biāo)抗性，雜草非靶標(biāo)抗性的不確定因素較多，而代謝抗性能力增強(qiáng)目前被認(rèn)為是植物由體內(nèi)的P450s、GSTs等酶協(xié)同作用，將除草劑代謝為低毒物質(zhì)等引起的。葛魯安等[25]研究證明，雜草的代謝能力與P450s、GSTs酶活性有關(guān)，使其產(chǎn)生非靶標(biāo)抗性。本研究結(jié)果表明，供試種群AH-40、JS-19在施用GSTs酶抑制劑后，對精噁唑禾草靈的GR50均有很大程度下降，表明GSTs酶抑制劑對該種群具有增效作用；施用P450s酶抑制劑后，AH-40種群對精噁唑禾草靈的的GR50有所下降，增效倍數(shù)為1.64～2.03倍。

綜合試驗(yàn)結(jié)果，表明酶抑制劑對精噁唑禾草靈有增效作用，但精噁唑禾草靈在日本看麥娘體內(nèi)的具體增效機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

雜草體內(nèi)物質(zhì)代謝是十分復(fù)雜的過程，需要多種酶和器官同時(shí)參與，導(dǎo)致其對除草劑產(chǎn)生不同程度的抗性[26]。徐洪樂等[8]研究發(fā)現(xiàn)，抗精噁唑禾草靈的日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈、炔草酯等藥劑均已產(chǎn)生抗性；而相關(guān)試驗(yàn)研究表明，日本看麥娘易對作用機(jī)制相同的除草劑產(chǎn)生抗性，產(chǎn)生原因與化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單及對不良環(huán)境的適應(yīng)等因素有關(guān)[7,27]。本研究通過測定抗性日本看麥娘的抗性發(fā)現(xiàn)，4個(gè)抗性種群均對炔草酯和甲基二磺隆、AH-41和JS-19對高效氟吡甲禾靈、JS-20對烯禾啶產(chǎn)生了高水平抗性，但對唑啉草酯、啶磺草胺、氟唑磺隆和異丙隆較為敏感，其可作為江淮地區(qū)防除抗性日本看麥娘的替代藥劑。