楊 慧， 郭世澤， 伍 崢， 孫志偉， 唐天睿， 楊學(xué)虎

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院， 云南 昆明 650100； 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 熱帶作物學(xué)院， 云南 普洱 665000)

0 引言

【研究意義】紫外線可分為長(zhǎng)波紫外線(UV-A，400～320 nm)、中波紫外線(UV-B，320～280 nm)和短波紫外線(UV-C，280～180 nm)[1]。其中，UV-C被臭氧層吸收，無(wú)法到達(dá)地面；UV-A雖能到達(dá)地面，但無(wú)明顯的生物學(xué)效應(yīng)；UV-B能透過(guò)臭氧層到達(dá)地面，對(duì)植物產(chǎn)生有效輻射，顯著影響其生長(zhǎng)發(fā)育[2]。柑橘(Citrus)是蕓香科(Rutaceae)植物，屬亞熱帶、熱帶常綠果樹，為全球第一大類果品、第三大國(guó)際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品[3]，是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。云南氣候條件多樣，柑橘產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，寬皮柑橘類品種處于主導(dǎo)地位，由于得天獨(dú)厚的氣候優(yōu)勢(shì)，篩選出興津、日南等早熟品種。早熟品種果實(shí)發(fā)育期較短[4-5]，從而導(dǎo)致其品質(zhì)不佳，尤其是外觀品質(zhì)，在果實(shí)著色期缺乏光照，使果實(shí)不能很好地完成轉(zhuǎn)色，嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中尋求改善特早熟柑橘外觀品質(zhì)的采后處理技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，利用紫外線采后處理果實(shí)的研究越來(lái)越多。紫外線輻照是影響植物體內(nèi)葉綠素和類胡蘿卜素合成積累的重要因子，利用適宜的輻照對(duì)柑橘果實(shí)進(jìn)行采后處理可有效改善其外觀品質(zhì)，如增強(qiáng)UV-B輻照可改善檸檬[6]、杧果[7]和桃[8]的外觀品質(zhì)。LIU等[9]研究表明，UV-B輻照可有效保持番茄采后感官品質(zhì)并提高其抗氧化能力；IBDAH等[10]研究表明，離體UV-B輻照處理可以提高蘋果的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和外觀品質(zhì)但其味道未發(fā)生改變?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)UV-B輻照對(duì)特早熟柑橘采后果皮色素的影響研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以云南特早熟柑橘興津?yàn)樵嚥模骄坎煌琔V-B輻照處理對(duì)其果皮色素的影響，以期為云南特早熟柑橘采后外觀品質(zhì)的改善提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 特早熟柑橘品種興津，由華寧縣農(nóng)業(yè)局亞熱帶水果示范園提供。

1.1.2 試劑 植物RNA提取試劑盒，購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒，購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在云南省玉溪市華寧縣華溪鎮(zhèn)柑橘示范基地進(jìn)行，于采收期采摘一批大小、形態(tài)、色澤品質(zhì)均一的柑橘果實(shí)，在5℃、相對(duì)濕度85%貯藏條件下，用波長(zhǎng)308 nm的UV-B燈管進(jìn)行照射，通過(guò)調(diào)節(jié)光源距離設(shè)置輻照強(qiáng)度為100 μW/cm2，分別照射0 h(CK)、24 h和48 h。每隔10 d(0 d、10 d、20 d、30 d)從照射0 h、24 h、48 h處理中隨機(jī)選取3個(gè)果實(shí)樣品，測(cè)定其果皮色差、色素(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素)含量及色素代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.1 果實(shí)色差測(cè)定 用3nh精密色差儀(NR110，三恩時(shí)科技有限公司)測(cè)定果皮色差，測(cè)定位置為果實(shí)赤道2點(diǎn)、頂部1點(diǎn)和底部1點(diǎn)，取平均值；測(cè)定L值(光澤明亮度，值越大代表越明亮)、a值(紅綠指標(biāo)，正值為紅色程度、負(fù)值為綠色程度)和b值(黃藍(lán)指標(biāo)，正值為黃色程度、負(fù)值為藍(lán)色程度)。

1.2.2 果皮色素測(cè)定 用丙酮︰乙醇︰水=4︰4︰1混合液提取葉綠素和類胡蘿卜素，用分光光度計(jì)〔A580,翱藝儀器(上海)有限公司〕在662 nm、645 nm、470 nm測(cè)定葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的吸光值，利用公式計(jì)算其含量[11]。

葉綠素a=12.72A662-2.59A645

葉綠素b=22.88A645-4.67A662

類胡蘿卜素=(1 000A470-3.27Ca-104Cb)/229

式中，A代表吸光值，Ca代表葉綠素a含量，Cb代表葉綠素b含量。

1.2.3 基因表達(dá)量測(cè)定 RNA的提取使用植物RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄使用cDNA合成試劑盒。RNA提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度，用2 μL的RNA模板和20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行cDNA合成，于—20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)使用熒光定量PCR儀(QuantStudio5，Applied Biosystems)、熒光定量試劑盒測(cè)定。β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基金，引物為F(CCAAGCAGCATGAAGATCAA)和R(ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG)，基因引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，總體系20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火(延伸)30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線階段使用儀器默認(rèn)設(shè)置，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。測(cè)定結(jié)束后利用2-ΔΔCT法分析相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和DPS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后果皮的色差

由圖1可知，不同輻照處理果皮色差隨貯藏時(shí)間變化。L值：輻照0 h和24 h貯藏0～10 d時(shí)均呈降低趨勢(shì)，分別下降0.40和0.94；貯藏10 d后，L值升高，分別增加1.09和1.21，0 h與24 h的L值差異不顯著。輻照48 h隨貯藏時(shí)間增加L值顯著升高，增加2.30；48 h的L值顯著高于0 h和24 h。a值：輻照0 h、24 h和48 h貯藏0～10 d時(shí)均顯著升高，分別增加15.77、12.63和13.22；貯藏10 d后各處理a值變化不明顯，保持在較為平穩(wěn)階段。b值：0 h和24 h貯藏0～10 d時(shí)略有降低，分別降低0.18和0.44；貯藏10～30 d時(shí)分別增加2.64和0.52，差異均不顯著。輻照48 h的b值隨貯藏時(shí)間增加而升高，貯藏30 d時(shí)顯著增加5.27，且顯著高于0 h和24 h。綜合看，輻照0 h、24 h、48 h貯藏0～30 d，L值、a值、b值總體上隨貯藏時(shí)間增加而升高，其中，輻照48 h的L值、b值顯著高于0 h和24 h。

注：不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，下同。

2.2 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后果皮的色素

從圖2看出，葉綠素a：輻照0 h和48 h貯藏0～20 d時(shí)呈升高趨勢(shì)，分別增加0.86和0.33；貯藏20 d后呈降低趨勢(shì)，分別降低2.64和1.23。輻照24 h貯藏10 d時(shí)含量最高，為3.59，隨著貯藏時(shí)間增加呈降低趨勢(shì)，貯藏30 d時(shí)降至1.37。輻照24 h和48 h的葉綠素a含量與0 h呈顯著性差異，輻照24 h的葉綠素a含量與48 h差異不顯著。葉綠素b：輻照0 h貯藏0～20 d時(shí)無(wú)顯著差異，貯藏30 d后顯著降低。輻照24 h隨貯藏時(shí)間增加葉綠素b含量呈先升后降趨勢(shì)。輻照48 h貯藏0～10 d時(shí)葉綠素b含量呈降低趨勢(shì)，貯藏10～30 d時(shí)呈先升后降趨勢(shì)，且差異均不顯著。類胡蘿卜素：輻照0 h、24 h和48 h均隨貯藏時(shí)間增加類胡蘿卜素含量呈先升后降趨勢(shì)，均在20 d時(shí)達(dá)最大，分別為0.90、1.12和1.00；與0 d、10 d時(shí)差異顯著。綜上，輻照0 h、24 h、48 h的葉綠素a、葉綠素b含量隨貯藏時(shí)間增加呈降低趨勢(shì)，以輻照24 h和48 h處理最佳；輻照0 h、24 h和48 h的類胡蘿卜素含量隨貯藏時(shí)間增加均呈先升后降趨勢(shì)，在20 d時(shí)達(dá)最大。

圖2 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后果皮的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量

2.3 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后色素代謝基因的相對(duì)表達(dá)量

由圖3可知，不同UV-B輻照處理柑橘果皮中色素代謝基因的相對(duì)表達(dá)量存在差異。其中，葉綠素降解途徑的關(guān)鍵基因PaO和RCCR均呈升高趨勢(shì)，其相對(duì)表達(dá)量均依次為48 h>24 h>0 h。類胡蘿卜素合成途徑的關(guān)鍵基因PSY的相對(duì)表達(dá)量為48 h處理高于0 h和24 h處理。表明，采后UV-B輻照處理可促進(jìn)特早熟柑橘貯藏期脫綠(葉綠素降解)，輻照48 h有利于貯藏期果皮類胡蘿卜素的累積，對(duì)提高色澤品質(zhì)具有重要作用。

圖3 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后色素代謝基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

柑橘果皮顏色主要由果皮所含的葉綠素、類胡蘿卜素的種類和含量決定。其中，類胡蘿卜素是1種數(shù)量龐大的化合物家族，且類胡蘿卜素所賦予果實(shí)的顏色較綠色更受消費(fèi)者青睞[12]。UV-B輻照處理后破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，而類胡蘿卜素作為一種植物光合作用的保護(hù)劑，可隨葉綠素降低而升高，從而對(duì)葉綠素起保護(hù)作用[13]。研究結(jié)果表明，UV-B輻照0 h、24 h和48 h貯藏0～30 d時(shí)特早熟柑橘果皮色差的L值、a值和b值總體隨貯藏時(shí)間增加而升高，其中，輻照48 h的L值、b值顯著高于0 h和24 h；果皮色素的葉綠素a和葉綠素b含量隨著貯藏時(shí)間增加而降低，但降幅均較0 h高；類胡蘿卜素含量隨貯藏時(shí)間增加而增加，且在貯藏20 d時(shí)達(dá)最大，與張文會(huì)等[14-15]的研究結(jié)果一致。根據(jù)果皮色素代謝基因的相對(duì)表達(dá)量，推斷UV-B輻照處理對(duì)貯藏期柑橘果皮葉綠素的降解具有促進(jìn)作用，輻照48 h可有效促進(jìn)貯藏期果皮中類胡蘿卜素的積累，輻照0 h和24 h的基因PSY的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，推測(cè)輻照24 h未達(dá)到促進(jìn)果皮類胡蘿卜素積累的輻照劑量。綜合看，UV-B輻照對(duì)柑橘果實(shí)的色澤具有明顯促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

特早熟柑橘采后UV-B輻照劑量不同對(duì)果皮色澤的影響不同，輻照顯著提高果皮的明亮度和黃色度，降低葉綠素含量而提高類胡蘿卜素含量；提高PaO、RCCR和PSY基因的相對(duì)表達(dá)量，促進(jìn)特早熟柑橘貯藏期脫綠(葉綠素降解)，輻照48 h有利于果皮貯藏期類胡蘿卜素的累積，對(duì)提高貯藏期的色澤品質(zhì)具有重要作用。綜上，在果實(shí)貯藏期間適度增加UV-B輻照可有效改善特早熟柑橘果實(shí)的表皮色澤，以UV-B輻照48 h貯藏20 d最佳。