劉佳美，路婷婷，姚 婷，要榮宇，李發(fā)弟,2，樂祥鵬，李萬宏

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心 /草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020；2. 甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 民勤 733300）

睪丸是公羊精子發(fā)生的場所，其發(fā)育質(zhì)量直接關(guān)系到公羊的繁殖能力。Zamiri 等[1]研究表明公羊睪丸周長與精子濃度呈正相關(guān)關(guān)系。Yarney 等[2]發(fā)現(xiàn)13 月齡睪丸直徑較大的公羊每日精子產(chǎn)量較高，17 月齡睪丸直徑較大的公羊產(chǎn)生更多的精子，且精子活力更高。在牛的研究中也有類似結(jié)果，Palasz等[3]發(fā)現(xiàn)公牛陰囊圍度與精子畸形率負(fù)相關(guān)。陰囊圍較大的公牛所配的母牛受胎率也較高[4]?；诓G丸大小與精子發(fā)生和精液質(zhì)量呈正相關(guān)關(guān)系，生產(chǎn)上，往往將睪丸大小作為選擇種公羊繁殖力的重要指標(biāo)之一。在對(duì)睪丸的測量方法中，陰囊圍度測定簡單、遺傳力高，是初步評(píng)估性成熟后種公畜繁殖力的最佳指標(biāo)[5]。因此，根據(jù)陰囊圍度大小，選育具有高繁殖力的優(yōu)良種公羊，提高精子產(chǎn)量和質(zhì)量，從而提高受精率并增加優(yōu)良種公羊的后代的數(shù)量，也是養(yǎng)羊生產(chǎn)提高經(jīng)濟(jì)效益的主要途徑之一。

睪丸大小主要由睪丸支持細(xì)胞數(shù)目所決定，同時(shí)支持細(xì)胞數(shù)目還決定了精子產(chǎn)量。睪丸發(fā)育和精子發(fā)生受到下丘腦-垂體-性腺軸系的激素調(diào)控，垂體分泌的促性腺激素分別與睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞上受體結(jié)合后，通過調(diào)節(jié)類固醇激素合成和釋放進(jìn)而影響睪丸內(nèi)細(xì)胞增殖、精子發(fā)生等生物學(xué)事件。以往關(guān)于睪丸大小和精子發(fā)生的研究主要集中在公羊配種期階段，而初情期到性成熟階段是湖羊出生后睪丸快速發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，其睪丸內(nèi)環(huán)境對(duì)睪丸發(fā)育和成年后繁殖能力至關(guān)重要。孫武[6]研究發(fā)現(xiàn)湖羊精子發(fā)生與睪丸大小密切相關(guān)，與小睪丸組相比，大睪丸組生殖細(xì)胞的體積和細(xì)胞核明顯較大，且生殖細(xì)胞間的胞質(zhì)橋明顯增大，GO 富集分析結(jié)果顯示促黃體素受體LHR(luteinizing hormone receptor)被顯著富集到精子發(fā)生條目。因此，為了探究不同繁殖力公羊睪丸內(nèi)類固醇激素合成差異，本研究選擇斷奶后在相同飼養(yǎng)條件下生長至165 日齡的湖羊公羔，根據(jù)陰囊圍大小，選擇大圍度組(高繁殖力)和小圍度組(低繁殖力)公羊個(gè)體，采用ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量qPCR 及H.E 染色等方法，研究其外周血液睪酮、雌二醇水平、睪丸內(nèi)促性腺激素受體、類固醇激素合成相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)、睪丸組織形態(tài)學(xué)以及附睪精子數(shù)的差異，為根據(jù)陰囊圍度大小選擇繁殖力高的公羔提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Trizol 購于TransGen Biotech，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量qPCR 試劑盒購于Takara，綿羊睪酮和雌二醇ELISA 檢測試劑盒購于CUSABIO，BCA 蛋白濃度測定試劑盒和PMSF 購于碧云天生物技術(shù)有限公 司，Tris-HCl (pH 7.4)、Tris-HCl (pH 8.8)、Tris-HCl(pH 6.8)、SDS 購于Solarbio，TPER 組織蛋白抽提劑和超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購于Thermo Scientific，5 × 上樣緩沖液購于Biosharp，0.45 μm PVDF 膜購于Millipore，兔多抗ACTB 購于proteintech，兔多抗FSHR、兔多抗HSD3B1 以及羊抗兔IgG (HRP)購于Abcam，三色蛋白預(yù)染marker 購于上海翊圣生物科技有限公司，Tween 20 和脫脂奶粉購于Biofroxx。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

參照莫負(fù)濤[7]方法，選擇137 只體況良好的斷奶湖羊公羔在民勤中天羊業(yè)有限公司飼喂相同日糧，在相同環(huán)境下飼養(yǎng)至165 日齡。用軟尺測量所有羊只陰囊圍度大小，根據(jù)睪丸發(fā)育狀況[6]和陰囊圍大小，選取兩側(cè)睪丸發(fā)育一致的個(gè)體18 只，分為小圍度組S [(18.53 ± 0.42) cm]和大圍度組L [(27.29 ±1.13 cm]，每組9 只。頸靜脈采集血液后進(jìn)行屠宰，分離睪丸鞘膜和精索后，利用天平分別測定睪丸和附睪重量，利用排水法測定睪丸體積。采集左側(cè)睪丸組織，一份保存于液氮，另一份多聚甲醛固定。

陰囊圍度為兩側(cè)睪丸并行時(shí)，陰囊最大處的水平周徑。

睪丸體積利用排水法測定，即將睪丸放入盛滿生理鹽水的燒杯中，溢出水的體積計(jì)為睪丸體積。

睪丸系數(shù) = 睪丸重量/體重 × 100%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 睪酮和雌二醇濃度測定

將外周血液在4 ℃條件下1 000 r·min?1離心30 min分離血清。按照說明書，利用綿羊睪酮、雌二醇ELISA 檢測試劑盒測定血清中睪酮和雌二醇。

1.3.2 附睪精子數(shù)測定

采集左側(cè)附睪尾部，稱取重量后剪碎，加入50 mL生理鹽水后放在37 ℃水浴鍋孵育30 min，然后利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)精子數(shù)量，精子密度用附睪組織重量進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.3.3 睪丸組織H.E 染色

取睪丸組織(1 cm3)在10 %多聚甲醛中固定，脫水、透明、石蠟包埋后制作成厚度為4 μm 的切片。經(jīng)H.E 染色后，用Scopeimage 9.0 軟件在100 倍拍照并測量，每個(gè)睪丸隨機(jī)選擇6～10 個(gè)生精小管利用十字交叉法測量其直徑。

1.3.4 睪丸組織RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

利用Trizol 法提取睪丸組織總RNA，經(jīng)電泳和NanoDrop 2000 檢測總RNA 的質(zhì)量后，取總RNA 2 μL，依次加入5 μL RNase free H2O，1 μL gDNA eraser和2 μL 5 × gDNA Eraser Buffer，42 ℃ 10 min 去 除

DNA 殘留，冰水冷卻后加入1 μL RNase free H2O，4 μL Primer Mix，4 μL 5 × PrimerScript Buffer 和1 μL RT Enzyme Mix，混勻后經(jīng)42 ℃ 25 min 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，85 ℃ 5 s 滅活后稀釋20 倍備用[8]。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR

利用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR 方法檢測促性腺激素受體基因FSHR、LHR以及類固醇激素代謝相關(guān)基因STAR、HSD3B1、CYP19A1、CYP11A1和ABP表達(dá)量。引物由上海生工合成(表1)。PCR 反應(yīng)體系為：10 μL 2 × SYBR Ex Taq，4 μL ddH2O，1 μL 引物和5 μL cDNA?；靹蚝?5 ℃ 4 min；然后95 ℃ 15 s，60 ℃35 s，40 個(gè)循環(huán)。通過熔解曲線判斷引物特異性。以ACTB作為內(nèi)參基因，利用2?ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR 引物Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.6 Western Blot (WB)

在液氮中充分研磨睪丸組織樣品，按照重量體積比為1 ∶ 20 將組織粉末加入到混有PMSF 的TPER 組織蛋白抽提劑(TPER ∶ PMSF=100 ∶ 1)，渦旋振蕩1 min，在4 ℃和 ? 20 ℃反復(fù)凍融兩次，取上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。取稀釋至2 μg·μL?1的蛋白樣品20 μL，加入5 μL 5 × 上樣緩沖液，95 ℃變性5 min。恒壓80 V 電泳約30 min，在濃縮膠中壓成一條直線，再120 V 電泳1 h 30 min。采用負(fù)極-濾紙-膠-膜-濾紙-正極的三明治結(jié)構(gòu)，恒流0.2 A 轉(zhuǎn)膜2 h。之后用5%脫脂奶粉常溫?fù)u床封閉2 h。一抗采用兔抗ACTB、FSHR、HSD3B1，分別按照1 ∶ 4 000、1 ∶ 800 和1 ∶ 1 200 稀釋，4 ℃孵育過夜。用1 ∶ 8 000 稀釋的二抗常溫?fù)u床孵育1 h。將添加了顯影液的PVDF 膜放置在BIO-RAD 凝膠成像儀中進(jìn)行掃描。采用ImageJ 進(jìn)行圖像分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Levene 檢驗(yàn)方差齊性，兩組間差異比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 表示差異顯著，P＜ 0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同陰囊圍度湖羊的睪丸發(fā)育狀況及組織形態(tài)學(xué)觀察

本研究測量的137 只湖羊陰囊圍度分布中(圖1)，最小值為15.8 cm，最大為32.8 cm。選擇用于后續(xù)研究的18 只羊睪丸參數(shù)表明(表2)，L 組湖羊陰囊圍度、睪丸重量、睪丸體積、睪丸系數(shù)、附睪重量和附睪尾部精子數(shù)量均極顯著高于S 組湖羊(P＜ 0.01)。L 組睪丸組織曲細(xì)精管生精上皮有多層不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞，管腔內(nèi)可見精子(圖2)，L 組睪丸組織曲細(xì)精管直徑極顯著高于S 組(P＜ 0.01)。

圖2 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察(100 × )Figure 2 Histomorphological observation of the testis of Hu sheep with different scrotal circumference (100 × )

表2 不同陰囊圍度湖羊的睪丸發(fā)育狀況Table 2 Testicular development of Hu sheep with different scrotal circumference

圖1 試驗(yàn)羊陰囊圍度直方圖Figure 1 Histogram of scrotal circumference

2.2 不同陰囊圍度湖羊外周血液睪酮和雌二醇濃度

與S 組相比，L 組湖羊外周血液中睪酮和雌二醇濃度均顯著升高(P＜ 0.05) (表3)。

表3 不同陰囊圍度湖羊外周血液睪酮和雌二醇濃度Table 3 Plasma concentration of testosterone and estradiol in Hu sheep with different scrotal circumference

2.3 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織中類固醇激素代謝相關(guān)基因及蛋白表達(dá)

與S 組相比，L 組HSD3B1、CYP19A1、ABP表達(dá)極顯著上調(diào)(P＜ 0.01)，STAR、FSHR、LHR表達(dá)顯著上調(diào)(P＜ 0.05)，CYP11A1基因表達(dá)上調(diào)，差異不顯著(P= 0.086) (圖3)。WB 結(jié)果顯示，與S 組相比較，L 組HSD3B1 表達(dá)顯著上調(diào)(P＜ 0.05) (圖4、圖5)。

圖3 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織中類固醇激素代謝相關(guān)基因表達(dá)Figure 3 Expression of steroidogenesis-related genes in testis of Hu sheep with different scrotal circumference

圖4 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織中相關(guān)蛋白WB 分析Figure 4 WB analysis of steroidogenesis-related proteins in testis of Hu sheep with different scrotal circumference

圖5 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織中相關(guān)蛋白表達(dá)分析Figure 5 WB analysis of steroidogenesis-related proteins in testis of Hu sheep with different scrotal circumference

3 討論

睪酮是由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的類固醇激素，高濃度的睪酮能夠促進(jìn)睪丸發(fā)育[9]。間質(zhì)細(xì)胞的增殖分化和睪酮的合成均受到垂體分泌的LH 的調(diào)控[10]。岳根華和張泉福[11]發(fā)現(xiàn)湖羊公羔出生后早期血漿LH 濃度與睪丸重量、直徑正相關(guān)，且血漿LH 濃度高于晚熟品種考力代羊，說明湖羊出生后睪丸發(fā)育啟動(dòng)時(shí)間早、性成熟早與其生后早期較高血漿LH 水平有關(guān)。LH 與間質(zhì)細(xì)胞上的LHR 結(jié)合后激活cAMP-PKA 途徑和SF-1 途徑[12]，促進(jìn)睪酮合成關(guān)鍵酶STAR 基因的表達(dá)[13]。膽固醇作為合成睪酮的原料，被STAR 轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜，在芳香化酶CYP11A1 的催化作用下生成孕烯醇酮，然后在光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處經(jīng)HSD3B1 催化轉(zhuǎn)化為孕酮，之后依次經(jīng)過CYP17A1 和HSD17B3 的催化作用最終生成睪酮。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，LHR敲除小鼠血清睪酮含量顯著低于野生型小鼠，睪丸曲細(xì)精管較窄，間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和大小顯著減少，而且精子發(fā)生在圓形精子細(xì)胞階段受阻[14]。與野生型相比，LHR基因敲除小鼠睪丸中 STAR、CYP11A1 和HSD17B3 的蛋白表達(dá)在3 周齡后均顯著降低[15]。在本研究中，L 組參與調(diào)控睪酮合成的相關(guān)基因HSD3B1在mRNA 水平極顯著上調(diào)，LHR、STAR的表達(dá)顯著上調(diào)，CYP11A1的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，HSD3B1 蛋白水平也顯著上調(diào)，促進(jìn)類固醇激素合成，進(jìn)而導(dǎo)致湖羊外周血液中睪酮水平顯著升高。有研究表明，在初情期前LH 和睪酮濃度更高、睪丸更大的公羊，更有利于精子的發(fā)生[16]。在Palasz 等[3]的研究中，1 周歲肉牛的睪酮峰值水平與陰囊圍度正相關(guān)。本研究中L 組間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮能力較強(qiáng)，引起外周血液睪酮濃度升高。同時(shí)合成的睪酮進(jìn)入曲細(xì)精管管腔和支持細(xì)胞分泌的ABP 結(jié)合，在曲細(xì)精管管腔內(nèi)形成局部高濃度睪酮的富集，刺激曲細(xì)精管發(fā)育和精子發(fā)生。本研究中L 組睪丸曲細(xì)精管直徑增加，生精上皮有多層不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞，管腔內(nèi)的成熟精子增多，附睪尾部精子數(shù)也明顯增加，均說明睪酮促進(jìn)了睪丸的發(fā)育，有利于維持精子的正常發(fā)生和成熟。

睪丸發(fā)育過程中，支持細(xì)胞的數(shù)量對(duì)睪丸的大小起著決定性作用，支持細(xì)胞在初情期時(shí)迅速增殖，在性成熟后停止增殖[17]。FSH 能夠與支持細(xì)胞表面的FSHR 結(jié)合，刺激支持細(xì)胞增殖[18]。支持細(xì)胞成熟后激活精子發(fā)生，導(dǎo)致生精上皮中精子形成[19]。FSHR 基因敲除的小鼠，初情期后睪丸體積變小[20]。本研究中，L 組睪丸中FSHR在mRNA 水平的表達(dá)顯著高于S 組，這與前期研究相一致。另外，間質(zhì)細(xì)胞合成的睪酮還可以在支持細(xì)胞中經(jīng)芳香化酶CYP19A1 的催化作用轉(zhuǎn)化成雌二醇[21]，促進(jìn)支持細(xì)胞增殖和維持精子發(fā)生[22-23]，有利于精子的存活[24]。睪丸組織中有大量的雌激素受體表達(dá)[25]。FSH 可通過支持細(xì)胞表面FSHR 的作用，顯著提高未成年小鼠的芳香化酶活性，引起10 日齡的小鼠雌二醇分泌提高[26]。體外研究表明，雌二醇能抑制新生期小鼠睪丸支持細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)支持細(xì)胞的增殖[27]。在本研究中，L 組湖羊睪丸中雌二醇合成關(guān)鍵酶基因CYP19A1表達(dá)極顯著上調(diào)，外周血液中雌二醇含量也隨之顯著升高，進(jìn)一步促進(jìn)曲細(xì)精管發(fā)育和精子發(fā)生，這與附睪中精子數(shù)增加相一致。

4 結(jié)論

綜上所述，陰囊圍度大的165 日齡湖羊公羔控制類固醇激素合成相關(guān)蛋白以及基因表達(dá)水平顯著高于陰囊圍度小的湖羊公羔，進(jìn)而導(dǎo)致陰囊圍度大的湖羊公羔的睪酮和雌二醇分泌增強(qiáng)，其更具有較好的生精環(huán)境并有利于睪丸發(fā)育和精子發(fā)生。