肺結(jié)節(jié)病生物標(biāo)志物與治療藥物的篩選與分析

郭新勸，張?jiān)茟c

洛陽(yáng)新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 洛陽(yáng) 471023

結(jié)節(jié)病是一種原因不明的系統(tǒng)性肉芽腫性疾病，可以累及全身各個(gè)器官，以肺結(jié)節(jié)病最為常見(jiàn)［1］。典型的肺結(jié)節(jié)病表現(xiàn)為縱膈及雙肺門(mén)淋巴結(jié)腫大，伴或不伴肺內(nèi)陰影，常累及眼部和皮膚，也可有肝臟、心臟、脾臟、骨骼等病變［2］。結(jié)節(jié)病的診斷需要整合多學(xué)科綜合判斷，在非干酪樣壞死性上皮樣細(xì)胞肉芽腫的病理基礎(chǔ)上，結(jié)合患者的臨床、影像學(xué)表現(xiàn)，排除其他病因后可確診為結(jié)節(jié)病［3］。大多數(shù)患者預(yù)后良好，部分呈自限性病程，約25%的患者表現(xiàn)為慢性、進(jìn)展性病程，最終導(dǎo)致肺纖維化、肝硬化、失明等。盡管對(duì)結(jié)節(jié)病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，結(jié)節(jié)病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的特異性標(biāo)志物及分子調(diào)控有待深入探討。

基于基因芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已被廣泛用于人類(lèi)疾病生物標(biāo)志物的篩選。隨著基因芯片和二代測(cè)序的應(yīng)用，產(chǎn)生了大量的生物數(shù)據(jù)，其中大部分已經(jīng)上傳至公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，如腫瘤基因組圖譜TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)、基因表達(dá)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)［4-5］。對(duì)于這些數(shù)據(jù)的整合和再分析將為研究提供有價(jià)值的線(xiàn)索。本研究從GEO中下載肺結(jié)節(jié)病相關(guān)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選結(jié)節(jié)病患者與正常對(duì)照之間的差異基因并進(jìn)行功能分析，以期篩選出肺結(jié)節(jié)病相關(guān)的生物標(biāo)志物，同時(shí)預(yù)測(cè)具有潛在治療結(jié)節(jié)病的藥物，為闡明肺結(jié)節(jié)病發(fā)生的分子機(jī)制和開(kāi)發(fā)靶向治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE34608 數(shù)據(jù)集，從該數(shù)據(jù)集中選擇36 個(gè)血液樣本，包括18 例肺結(jié)節(jié)病患者樣本和18例健康對(duì)照樣本［6］。肺結(jié)節(jié)病患者診斷明確，艾滋病、糖尿病、自身免疫性疾病等存在免疫抑制的患者排除在外。提取患者和對(duì)照外周血的RNA 樣品，采用GPL6480 芯片平臺(tái)，即Agilent-014850人類(lèi)基因組4x44K G4112F芯片。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)基因篩選 將結(jié)節(jié)病患者樣本和健康對(duì)照樣本的表達(dá)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入在線(xiàn)工具GEO2R 進(jìn)行差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選［7］。采用t 檢 驗(yàn) 計(jì) 算P 值，Benjamini-Hochberg 方 法 對(duì)P 值 進(jìn) 行 校正。DEGs 篩選標(biāo)準(zhǔn)為組間差異倍數(shù)≥2 倍，調(diào)整后，P＜0.05。

1.2.2 富集分析 基因本體（Gene ontology，GO）是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類(lèi)體系，京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能等信息，以期探索生物系統(tǒng)的高級(jí)功能。本研究基于DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行DEGs 功能模式富集分析［8］，包括分子功能富集、生物過(guò)程富集和信號(hào)通路富集，顯著富集條目的閾值設(shè)為P＜0.05。

1.2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 將篩選出的DEGs 上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白—蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，以綜合得分＞0.7 作為顯著性閾值，然后使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，采用默認(rèn)參數(shù)計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中核心基因的度值。

1.2.4 潛在藥物預(yù)測(cè) DGIdb 整合了Chembl、DrugBank、PharmGKB等數(shù)據(jù)庫(kù)以及PubMed已發(fā)表文獻(xiàn)等信息［9］。將PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心基因輸入DGIdb 數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選與此基因集相互作用的藥物。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果

以健康對(duì)照樣本為對(duì)照組，肺結(jié)節(jié)病患者樣本為實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，從基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)中共篩選出2 837個(gè)DGEs，其中上調(diào)基因1 662 個(gè)，下調(diào)基因1 175 個(gè)，部分差異基因，見(jiàn)表1。

表1 差異基因篩選結(jié)果

2.2 GO功能富集分析

DGEs 顯著富集的分子功能主要集中在蛋白質(zhì)結(jié)合、信號(hào)傳導(dǎo)活性、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）結(jié)合、蛋白激酶活性等。顯著富集的生物過(guò)程主要涉及NF-κB 信號(hào)、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞黏附、免疫反應(yīng)、蛋白磷酸化、內(nèi)吞、mRNA 加工等，富集水平最顯著的前20個(gè)條目列于表2。

表2 GO功能富集分析

2.3 通路富集分析

DGEs 顯著富集于NF-κB 信號(hào)，內(nèi)吞，TNF 信號(hào)，

MAPK 信號(hào)，趨化因子信號(hào)，Toll 樣受體信號(hào)，細(xì)胞凋亡等，其中富集水平最顯著的前10條通路，見(jiàn)表3。

表3 通路富集分析

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將篩選出的DEGs 上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含1 729個(gè)節(jié)點(diǎn)和13 332條邊，PPI富集P值小于1×10-16，平均局部聚類(lèi)系數(shù)為0.279，采用Cytoscape可視化如圖1A 所示。根據(jù)巨型網(wǎng)絡(luò)中的連通度，對(duì)DEGs擁有的PPI 對(duì)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，鑒定出5 個(gè)核心節(jié)點(diǎn)基因，包括TLR4、JUN、CASP3、PTEN和CXCL8。

圖1 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

2.5 藥物篩選結(jié)果

利用DGIdb 數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)篩選針對(duì)TLR4、 JUN、CASP3、PTEN 和CXCL8 核心基因的藥物共計(jì)257 種，包括紫杉醇、秋水仙素、西妥昔單抗、甲巰咪唑等。以“Interaction Score”大于1 為閾值共篩選出潛在藥物29 種，見(jiàn)表4，這些藥物可能與肺結(jié)節(jié)病存在關(guān)聯(lián)。

表4 靶基因篩選的潛在治療結(jié)節(jié)病的藥物

3 討論

結(jié)節(jié)病尚無(wú)客觀(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要根據(jù)臨床表現(xiàn)、受累部位病理結(jié)果以及影像學(xué)特征，排除其他原因后可確診為結(jié)節(jié)?。?］。目前，肺結(jié)節(jié)病尚無(wú)特異性的血清診斷標(biāo)志物。本研究從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中下載肺結(jié)節(jié)病表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選其相關(guān)的生物標(biāo)志物，并對(duì)其功能進(jìn)行挖掘分析。本研究發(fā)現(xiàn)2 837 個(gè)基因在肺結(jié)節(jié)病患者和正常對(duì)照之間差異表達(dá)，富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要參與信號(hào)傳導(dǎo)活性、TNF 結(jié)合、NF-κB 信號(hào)、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞黏附、免疫反應(yīng)、蛋白磷酸化等生物過(guò)程，主要涉及內(nèi)吞，NF-κB信號(hào)，TNF 信號(hào)，MAPK 信號(hào)，趨化因子信號(hào)，Toll 樣受體信號(hào)，細(xì)胞凋亡等通路。

免疫病理機(jī)制在結(jié)節(jié)病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，活動(dòng)性結(jié)節(jié)病的典型特征是受累組織主要表達(dá)干擾素-γ（interferon γ，IFN-γ），同時(shí)也高表達(dá)白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL-2）和TNF-α等細(xì)胞因子［10］。TNF-α是形成和維持結(jié)節(jié)病肉芽腫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，靶向TNF-α可以作為結(jié)節(jié)病治療策略之一。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)節(jié)病患者肺組織和血細(xì)胞中TLR2 表達(dá)升高，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中TNF-α表達(dá)增加，并且高表達(dá)的TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞表達(dá)TLR2，表明異常的先天免疫活動(dòng)可能在肺結(jié)節(jié)病發(fā)病中起主要作用，先天和適應(yīng)性反應(yīng)協(xié)同增強(qiáng)肉芽腫反應(yīng)［11-12］。炎性因子IL-6參與介導(dǎo)多種炎癥和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，IL-6 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βl（transforming growth factor beta l，TGF-β1）是保護(hù)性Treg細(xì)胞和致病性Th17 細(xì)胞增殖分化的調(diào)控因子［13］。當(dāng)無(wú)炎性受損時(shí)，IL-6 處于低表達(dá)水平，TGF-β1 誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞增殖，利于免疫耐受。肺結(jié)節(jié)病患者血清中IL-6 和TGF-β1 水平均明顯升高，二者協(xié)同誘導(dǎo)Th17 發(fā)育，使Treg 分化受限，并驅(qū)動(dòng)Treg 向Th17 轉(zhuǎn)化，提示促炎性Th17 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞之間的平衡對(duì)于尋找診斷標(biāo)志物和針對(duì)性藥物具有參考意義［14］。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析挖掘出的核心基因包括TLR4、JUN、CASP3、PTEN 和CXCL8，參與病原微生物感染、脂多糖反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期與凋亡調(diào)控等。肺結(jié)節(jié)病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中dectin-1、TLR2和TLR4的基線(xiàn)表達(dá)水平較高，真菌細(xì)胞壁物質(zhì)和/或脂多糖刺激后，dectin-1、TLR2 和TLR4 的表達(dá)減少，增加了外周血單個(gè)核細(xì)胞的敏感性，導(dǎo)致過(guò)度的炎性細(xì)胞因子反應(yīng)，促進(jìn)肺結(jié)節(jié)病的發(fā)生或進(jìn)展［15］。針對(duì)核心基因篩選出的藥物包括紫杉醇、秋水仙素、西妥昔單抗、甲巰咪唑等，可作為潛在治療藥物。糖皮質(zhì)激素目前仍然是結(jié)節(jié)病治療的一線(xiàn)選擇，當(dāng)糖皮質(zhì)激素治療失敗或難以耐受毒副作用時(shí)，可以選用細(xì)胞毒藥物以及抗TNF-α藥物［16］。

綜上所述，本研究對(duì)肺結(jié)節(jié)病相關(guān)的候選基因進(jìn)行了篩選，其功能主要涉及TNF和NF-κB信號(hào)通路，擴(kuò)展了對(duì)其分子發(fā)生機(jī)制的理解，鑒定出的核心基因可能作為肺結(jié)節(jié)病的診斷標(biāo)志物，也可能作為研發(fā)新型治療藥物的分子靶標(biāo)。