青海湖高寒濕地土壤細(xì)菌群落對(duì)氮添加的響應(yīng)

朱錦福，黃瑞靈, ，董志強(qiáng)，毛曉寧，周華坤

1.青海師范大學(xué)，青海 西寧 810008；2.開(kāi)封市祥符區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 開(kāi)封 475199；3.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所/青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008

濕地作為一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，兼具水體和陸地兩者的特征，在維持生態(tài)平衡、保持生物多樣性、氣候調(diào)節(jié)和水源涵養(yǎng)等方面具有不可替代的作用（李甜甜等，2016）。土壤微生物作為濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分（Zhang et al.，2012），扮演著調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的角色（Faulwetter et al.，2009；陳泓碩等，2020），是生物地球化學(xué)循環(huán)的“引擎”尤其在調(diào)節(jié)土壤肥力、植物生長(zhǎng)和氣候變化等方面起著關(guān)鍵作用（邵穎等，2017；葛怡情等，2019）。

土壤微生物中對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定發(fā)揮著特殊作用（林春英等，2021）。濕地生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物多樣性，決定著土壤環(huán)境質(zhì)量和生態(tài)特征，能更靈敏和全面地反映濕地土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化（吳松芹等，2017；陳偉等，2019；楊陽(yáng)等，2022），其區(qū)系組成及多樣性受土壤環(huán)境、植被類型、土壤水分等因素的影響。諸多研究表明，氮沉降影響土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖與活動(dòng)能力，從而改變了土壤細(xì)菌多樣性，進(jìn)而其群落組成和結(jié)構(gòu)隨之發(fā)生改變（閆鐘清等，2017；韓其飛等，2021；徐潤(rùn)宏等，2021；張世虎等，2022）。

氮素的添加會(huì)導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)增加，這將為土壤微生物提供生長(zhǎng)和發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致土壤中微生物群落豐富度的改變，最終會(huì)使土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和物種豐富度發(fā)生變化，此結(jié)果已被研究所證實(shí)（張海芳等，2018）。大氣中的氮沉降也是影響土壤微生物群落多樣性的因素之一（Kuypers et al.，2018）。氮沉降會(huì)改變植物的生長(zhǎng)環(huán)境和有機(jī)碳的輸入量和分解速率（劉永萬(wàn)等，2020；李梓萌等，2021；楊陽(yáng)等，2021）。氮沉降對(duì)土壤微生物的影響還存在一些不確定因素，對(duì)土壤微生物產(chǎn)生積極作用還是產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)還存在爭(zhēng)論。Zeng et al.（2016）認(rèn)為氮沉降對(duì)土壤細(xì)菌多樣性和群落組成也有明顯的控制作用。楊山等（2015）則認(rèn)為隨著氮添加梯度的增加，土壤細(xì)菌豐度和多樣性指數(shù)沒(méi)有發(fā)生明顯改變。也有研究表明，氮添加量與土壤微生物豐富度和多樣性相關(guān)，微生物多樣性對(duì)氮添加存在閾值限制性（李成一等，2020）。

青海湖位于青藏高原東北部，在維持青藏高原以及中國(guó)西北部生態(tài)安全平衡等方面具有重要作用（Ma et al.，2016）。青藏高原獨(dú)特的地理環(huán)境，對(duì)于外界環(huán)境變化很敏感，諸多學(xué)者圍繞青海湖濕地生態(tài)環(huán)境演變、生物多樣性評(píng)價(jià)、生態(tài)功能等方面開(kāi)展了大量研究（張明等，2017；張中華等，2018；王天慈等，2020），對(duì)青海湖濕地的生態(tài)價(jià)值方面有了更深入的了解（楊陽(yáng)等，2021），但氮沉降對(duì)濕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生何種影響，我們的了解仍然有限。因此，通過(guò)研究青海湖高寒濕地土壤細(xì)菌群落對(duì)氮添加的響應(yīng)，探討氣候變化背景下青海高寒濕地的保育策略，繼而為高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)和修復(fù)提供數(shù)據(jù)支撐。通過(guò)分析土壤細(xì)菌群落對(duì)氮濃度梯度的響應(yīng)特征、土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，為青藏高原高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)樣地位于青海湖湖東 36°41′—36°42′N，100°45′—100°47′E，海拔 3200 m，屬典型的高原大陸性氣候，光照充足，雨量較少，降水主要集中于6—9月，年平均降水量370 mm、年蒸發(fā)量1454.4 mm（劉文玲等，2017）。土壤類型主要為水成性陰育性土壤，以沼澤土和草甸土為主（王記明等，2014），優(yōu)勢(shì)植物類型有華扁穗草（Blysmussinocompressus）、禾葉嵩草（Kobresiagraminifolia）、藏嵩草（Kobresiatibetica）、小嵩草（Kobresiahumilis）和苔草（Carexspp.）等（楊英等，2016）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)青藏高原大氣氮沉降動(dòng)態(tài)變化特征的數(shù)據(jù)（張靜等，2019），年平均氮沉降量 8 kg·hm-2·a-1，在青海湖東岸設(shè)置12個(gè)2 m×1 m樣地，樣地間隔25 m，防止相互干擾。設(shè)置4個(gè)氮梯度處理，施氮水平分別為 0、2、5、10 g·m-2，分別用 N0、N2、N5、N10表示。樣方采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)置 3次重復(fù)。氮肥形態(tài)為 NH4NO3，于 2019年5—9月，每月月初按照處理水平進(jìn)行氮添加處理，將NH4NO3溶解于1000 mL水中，人工均勻噴施于濕地土壤表面，對(duì)照則噴施等量的水。2020年 10月初用直徑10 cm螺旋取土鉆按五點(diǎn)采樣法采集表層土壤（0—15 cm）和深層土壤（15—30 cm）土壤樣品，去除細(xì)根和石塊，放入無(wú)菌自封袋中，一部分保存在-80 ℃冰箱，用于提取土壤DNA和高通量測(cè)序，分析土壤微生物群落功能多樣性，另一部分土樣放在室內(nèi)自然風(fēng)干，磨碎后過(guò)100目篩，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

1.3 樣品測(cè)定

樣品DNA的提取、擴(kuò)增和高通量測(cè)序等工作均由北京百邁客生物科技有限公司（https://international.biocloud.net/zh/dashboard）完成。采用MN NucleoSpin 96 Soi試劑盒進(jìn)行DNA提取，具體提取方式參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)細(xì)菌16S rRNA 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和 806R：5′GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3′；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，接著95 ℃變性30 s，50 ℃變性30 s，72 ℃變性60 s，進(jìn)行20+10 cycles；循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行72 ℃延伸5 min，4 ℃最終延伸∞。目標(biāo)區(qū)域PCR產(chǎn)物根據(jù)電泳定量（ImageJ 軟件）結(jié)果，按照質(zhì)量比1∶1進(jìn)行混樣，混樣后，采用OMEGA DNA純化柱進(jìn)行過(guò)柱純化，1.8%的瓊脂糖凝膠，120 V 40 min電泳后，切目的片段，并回收，采用Illumina HiSeq 2500測(cè)序儀完成序列分析。

土壤酸堿度用土壤酸堿度計(jì)測(cè)量；土壤含水量采用烘干法測(cè)定；土壤全碳、全氮采用意大利 NC Technologies公司Costech ESC 4024元素分析儀測(cè)定；土壤有機(jī)碳采用總有機(jī)碳分析儀（Elementa，Germany）測(cè)定；土壤氨態(tài)氮、硝態(tài)氮的測(cè)定采用全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀（CleverChem）測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息分析技術(shù)和生物云計(jì)算技術(shù)（https://international.biocloud.net/zh/dashboard），對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接（FLASH，version 1.2.11），將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾（Trimmomatic，version 0.33），并去除嵌合體（UCHIME，version 8.1），到高質(zhì)量的Tags序列。在相似性 97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類（USEARCH，version 10.0），以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾OTU。對(duì)樣品進(jìn)行97.0%的相似度水平下進(jìn)行物種聚類分析，獲得 OTU數(shù)，進(jìn)行Alpha、Beta多樣性分析和RDA分析，判斷氮添加對(duì)土壤不同深度細(xì)菌多樣性的影響。此外，用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)不同氮添加下土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌門(mén)水平多樣性之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式列出。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮添加土壤基本理化性質(zhì)

由表1可知，土壤pH值在7.3—7.57之間，研究區(qū)濕地土壤環(huán)境呈弱堿性，N10添加后，雖pH值提高，但各處理間差異不顯著（P>0.05），氮沉降對(duì)土壤pH沒(méi)有顯著影響。不同處理間土壤水分存在差異，隨施氮量的增加土壤水分逐漸增加，且表層土壤水分顯著高于深層土壤水分（P<0.05）。總碳含量隨施氮量增加而增加，總體上表層土壤高于深層土壤，N5處理下表層和深層含量高于其他處理，但各處理間差異不顯著；在深層土壤中，N2處理下總碳含量最低為 9.73，與其他處理差異顯著（P<0.05）。在表層土壤中有機(jī)碳含量隨施氮量增加而增加，除N2外，其余處理均高于對(duì)照，在N10處理下含量最高，顯著高于其他處理（P<0.05）；深層土壤有機(jī)碳含量與N0對(duì)比均有所降低，各處理間差異不顯著，表層土壤有機(jī)碳較深層土壤對(duì)外源性擾動(dòng)響應(yīng)更加敏感。氮素是植物生長(zhǎng)的重要元素之一。不同土壤層全氮的含量均不相同。表層土壤全氮含量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，深層土壤全氮含量呈先上升后下降趨勢(shì)，且N5、N10與N0、N2差異均顯著。土壤層氨態(tài)氮含量，N2處理顯著低于對(duì)照和其它處理，在表層土壤中氨態(tài)氮含量表現(xiàn)為減少，在深層土壤中表現(xiàn)為增多。土壤硝態(tài)氮含量均表現(xiàn)為表層高于深層，N2和N5處理均高于對(duì)照，深層土壤之間差異均不顯著。

表1 不同氮添加處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 Effects of different nitrogen addition treatments on soil physical and chemical properties

2.2 土壤樣本測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果經(jīng)低質(zhì)量序列過(guò)濾后，表層土壤中，氮添加變化下平均有效序列分別為72926、75666、75691和76087；深層土壤中，平均有效序列分別為76835、76945、77097和76618（結(jié)果見(jiàn)表2）。根據(jù)97%的相似度水平，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，表層土壤樣品共獲得1714個(gè)OTU，深層土壤共獲得1704個(gè)OTU。利用測(cè)序獲得序列構(gòu)建稀釋性曲線（見(jiàn)圖 1），表層土壤和深層稀釋性曲線均趨于平緩，表層土壤細(xì)菌覆蓋率為99.61%，深層土壤細(xì)菌覆蓋率為99.71%，當(dāng)前測(cè)序樣本量足以反映土壤不同深度細(xì)菌群落的實(shí)際情況，測(cè)序結(jié)果合理。

圖1 土壤稀釋性曲線Figure 1 Dilution curve of soil

2.3 不同氮濃度處理下土壤細(xì)菌數(shù)量

細(xì)菌是土壤微生物中數(shù)量最多的一個(gè)類群。由表 2可見(jiàn)，表層土壤中細(xì)菌數(shù)量在 6.68×106—108.81×106cfu·g-1之間，變化趨勢(shì)呈“N”形，在 N2處理下達(dá)到最低值，在N5處理下達(dá)到最高值，且N5和N10處理下顯著高于N0和N2處理。深層土壤中細(xì)菌的數(shù)量在 3.13×106—104.65×106cfu·g-1之間，變化趨勢(shì)與表層土壤一致，均在N2處理下達(dá)到最低值，在N5處理下達(dá)到最高值，且N5和N10處理下細(xì)菌數(shù)量顯著增加，氮添加提高了高寒濕地土壤細(xì)菌數(shù)量。

2.4 不同氮濃度土壤細(xì)菌豐度及多樣性

不同氮添加處理對(duì)土壤細(xì)菌豐度和多樣性指數(shù)的影響存在差異（表2）。ACE和Chao1指數(shù)衡量細(xì)菌豐度即細(xì)菌數(shù)量的多少，Shannon與Simpson指數(shù)均用于衡量物種多樣性，指數(shù)越大，細(xì)菌多樣性越高。在表層土壤，隨著氮添加濃度的增加，土壤細(xì)菌ACE和Chao1指數(shù)均表現(xiàn)為降低趨勢(shì)；而在深層土壤，土壤細(xì)菌ACE和Chao1指數(shù)與其表層的變化不一致，與N0相比，ACE和Chao1指數(shù)均有所上升，且在 N10處理中豐度指數(shù)最高，為1458.71、1496.97。不同氮添加濕地之間Simpson指數(shù)有所變化，與N0對(duì)比，表層土壤呈遞增趨勢(shì)，深層土壤均有所下降，但差異不大。Shannon指數(shù)在表層土壤中表現(xiàn)為逐漸增加，在 N10中最大，為8.81，深層土壤的Shannon指數(shù)較N0降低，氮添加增加了表層土壤細(xì)菌多樣性，降低了深層土壤細(xì)菌多樣性，氮添加對(duì)深層土壤細(xì)菌多樣性具有負(fù)影響。

表2 不同氮添加處理中土壤細(xì)菌豐度及多樣性指數(shù)Table 2 Soil bacterial abundance and diversity index under different nitrogen addition treatments

2.5 不同氮添加下土壤細(xì)菌群落組成分析

基于微生物多樣性分析平臺(tái)，檢測(cè)到濕地土壤細(xì)菌為26門(mén)71綱156目267科428屬452種，絕大多數(shù)為單屬單種。在青海湖高寒濕地土壤細(xì)菌門(mén)分類水平上，占表層土壤細(xì)菌群落主導(dǎo)的細(xì)菌門(mén)有變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、己科河菌門(mén)（Rokubacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）等，占整個(gè)濕地細(xì)菌群落組成的96.7%以上，見(jiàn)圖2a。在表層土壤中，氮添加增加了放線菌門(mén)（Actinobacteria）的豐度，降低了己科河菌門(mén)（Rokubacteria）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）菌門(mén)的豐度，變形菌門(mén)（Proteobacteria）和酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）豐度變化幅度較小，在 42.56%—44.42%和 25.28%—25.26%間波動(dòng)。

深層土壤細(xì)菌群落在門(mén)水平上占主導(dǎo)細(xì)菌門(mén)的有變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、己科河菌門(mén)（Rokubacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae），占整個(gè)細(xì)菌群落組成的97.6%以上，見(jiàn)圖2b。在深層土壤中，氮添加增加了變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）的豐度，降低了己科河菌門(mén)（Rokubacteria）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）的豐度。濕地主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)隨氮添加增加，其含量雖發(fā)生變化，但處于相似生境下，門(mén)水平分類下土壤細(xì)菌群落組成基本一致。另外，在表層土壤細(xì)菌中，放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)對(duì)氮添加響應(yīng)較大，N10顯著增加放線菌菌門(mén)豐度，而N5顯著增加厚壁菌門(mén)豐度。

圖2 門(mén)水平上土壤細(xì)菌群落組成Figure 2 Composition of soil bacterial community at phylum level

2.6 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌豐度及α多樣性指數(shù)相關(guān)分析

從表3可以看出，土壤理化因子與細(xì)菌多樣性指數(shù)的相關(guān)性。表層土壤中，全碳與ACE豐度指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；硝態(tài)氮與Chao1指數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；氨態(tài)氮與Simpson多樣性指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與Shannon多樣性指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。在深層土壤中，土壤酸堿度與Simpson和Shannon多樣性指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；水分、有機(jī)碳和全氮與細(xì)菌ACE和Chao1豐度指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P<0.05），且水分貢獻(xiàn)最大，影響極顯著（P<0.01）；全碳與Simpson多樣性指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；而硝態(tài)氮與 Shannon多樣性指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

表3 土壤細(xì)菌多樣性與土壤理化性質(zhì)Pearson相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis between soil bacterial diversity and soil physical and chemical properties

2.7 土壤理化性質(zhì)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的RDA分析

基于門(mén)水平下土壤細(xì)菌群落分布與理化性質(zhì)的RDA分析（見(jiàn)圖3），從圖3a可以看出，有機(jī)碳、硝態(tài)氮、全氮、氨態(tài)氮射線較長(zhǎng)，表明其對(duì)在表層土壤中細(xì)菌群落分布影響較大，反之則較小。同時(shí)還可以看出，N0土壤中硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、己科河菌門(mén)（Rokubacteria）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）分布主要受硝態(tài)氮、全氮和水分的影響，且有正相關(guān)；N2土壤中擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）分布主要受pH影響，其它影響因子貢獻(xiàn)不大；N5土壤中酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）分布主要受pH和氨態(tài)氮影響，其中氨態(tài)氮貢獻(xiàn)最大且有正相關(guān)；N10土壤中放線菌門(mén)（Actinobacteria）分布主要受有機(jī)碳影響，且有正相關(guān)。圖3b可以看出，在深層土壤，N0細(xì)菌中綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）和己科河菌門(mén)（Rokubacteria）基本不受土壤理化性質(zhì)的影響；N2土壤中細(xì)菌的達(dá)達(dá)菌門(mén)（Dadabacteria）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）分布主要受全碳和硝態(tài)氮的影響，且呈正相關(guān)；N5土壤中變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）分布受全碳、水分、有機(jī)碳、全氮以及pH影響，其中全氮對(duì)幾個(gè)菌門(mén)分布影響最大；N10的變形菌門(mén)（Proteobacteria）分布受全碳因素影響，呈正相關(guān)，而綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）則與全碳因素呈負(fù)相關(guān)。在深層土壤中，環(huán)境因子主要對(duì)達(dá)達(dá)菌門(mén)（Dadabacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）分布產(chǎn)生影響，且呈正相關(guān)；而綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）則與全碳因素呈負(fù)相關(guān)，硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）和己科河菌門(mén)（Rokubacteria）對(duì)土壤理化性質(zhì)的變化反應(yīng)遲鈍。

圖3 土壤細(xì)菌與理化因子的RDA分析Figure 3 RDA analysis of bacteria and physicochemical properties

3 討論

3.1 氮添加對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)不同氮添加處理下的青海湖濕地土壤基本理化性質(zhì)存在差異顯著。表層土壤和深層土壤pH雖有波動(dòng)性變化，但各處理間差異并不顯著（P>0.05）；表層土壤水分隨著N添加而增加，在N10處達(dá)到最大值，深層土壤水分在N5處達(dá)到最大值，當(dāng)水分條件良好時(shí)，氮的添加會(huì)對(duì)土壤微生物量有著正向促進(jìn)作用。高氮的輸入導(dǎo)致深層水分下降，這是因?yàn)楦叩奶砑訉?dǎo)致土壤有效氮含量增加，有效氮被植物吸收后，促進(jìn)了植物的根系生長(zhǎng)和自身發(fā)育。表層土壤隨著氮濃度的不斷增加，有機(jī)碳的含量也在增加，在N10處達(dá)到最大；深層土壤有機(jī)碳的含量最大值在 N5。外加氮素滿足了土壤微生物對(duì)氮素的需求，從而促進(jìn)了凋落物的分解。氮沉降增加使土壤中可溶性酚類物質(zhì)逐漸積累，從而增加了土壤有機(jī)碳的含量，但由于深層土壤微生物活性低，使表層土壤有機(jī)碳含量較深層土壤高。也有研究發(fā)現(xiàn)，氮的添加會(huì)通過(guò)降低礦化速率，抑制穩(wěn)定性碳的分解，減少土壤碳輸出來(lái)增加有機(jī)碳的積累（劉銀銀等，2013）。氮素是構(gòu)成一切生命體的重要營(yíng)養(yǎng)元素，全氮在一定程度上能反映土壤氮素的供應(yīng)狀況。本研究中，表層土壤全氮含量呈遞減趨勢(shì)，深層土壤中的全氮含量較對(duì)照均有提高，且在N5達(dá)到顯著水平，二者所表現(xiàn)出來(lái)的響應(yīng)完全不同。這可能是氮沉降輸入到濕地中的氮大部分保留在表層土壤，當(dāng)濕地生態(tài)系統(tǒng)達(dá)到“飽和”時(shí)，進(jìn)一步的氮輸入將導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)負(fù)氮，過(guò)剩的NH4+可能發(fā)生硝化作用，進(jìn)而造成氮的淋溶損失，使得氮素含量下降。這與前人的研究不盡相同（葉彥輝等，2017），原因可能是本研究開(kāi)展氮沉降時(shí)間較短。

3.2 氮添加對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

濕地土壤中的微生物在“能量平衡”特別是碳氮平衡中扮演重要角色，在元素循環(huán)、特別是N、C元素循環(huán)、能量流動(dòng)等過(guò)程中有著重要作用（裴希超等，2009）。其生物量約占土壤總有機(jī)碳的1%—5%，盡管其庫(kù)容小，但周轉(zhuǎn)速度快，是土壤有機(jī)質(zhì)中最活躍的部分（聶秀青等，2021）。微生物中的固氮菌和根瘤菌都是可以把氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氮或者銨鹽，從而把氮素輸入到生態(tài)系統(tǒng)的循環(huán)中。氮添加可以迅速改變土壤基底營(yíng)養(yǎng)狀況，引起土壤理化指標(biāo)發(fā)生變化，對(duì)土壤微生物產(chǎn)生影響（郭萍萍，2015），繼而改變微生物群落組成和多樣性（陳謙等，2010）。濕地是碳氮循環(huán)得重要發(fā)生場(chǎng)所，相關(guān)研究表明濕地土壤細(xì)菌群落組成在門(mén)分類水平上主要有變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、己科河菌門(mén)（Rokubacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）（Hollister et al.，2010；Xu et al.，2019）。其中，豐度超過(guò)10%的菌門(mén)有變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria），放線菌門(mén)（Actinobacteria）、己科河菌門(mén)（Rokubacteria），為高寒濕地土壤細(xì)菌主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這與本文研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明雖然取樣地點(diǎn)不同，對(duì)于生活在相似生境的細(xì)菌群落組成比較接近。但是，氮添加改變了土壤細(xì)菌菌門(mén)豐度和多樣性。在表層土壤中，氮添加增加了變形菌門(mén)（Proteobacteria）物種分布，但對(duì)氮添加響應(yīng)不顯著，增幅不明顯；放線菌門(mén)（Actinobacteria）和綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）隨氮添加增加呈遞增趨勢(shì)，放線菌門(mén)（Actinobacteria）在N10增幅最高，為79.62%、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）在 N5增幅最高，為 30.61%；己科河菌門(mén)（Rokubacteria）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）隨氮添加增加呈遞減趨勢(shì)，均在 N10降幅最為明顯，分別降低了 33.40%和 62.24%；酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）隨氮添加增加呈先下降后上升趨勢(shì)，增幅較小；厚壁菌門(mén)（Firmicutes）常參與有機(jī)質(zhì)的分解和微生物固氮過(guò)程，其分布情況則與酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）相反，隨氮添加增加呈先上升后下降趨勢(shì)，N5增幅最高，是N0的11.16倍，對(duì)氮添加響應(yīng)極顯著。在深層土壤中，氮添加對(duì)酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）分布影響不大；己科河菌門(mén)（Rokubacteria）和綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）隨氮添加增加呈下降趨勢(shì)，均在N2、N5降幅較大，己科河菌門(mén)（Rokubacteria）分布分別降低了 60.98%和62.21%、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）分布分別降低了35.69%和29.68；變形菌門(mén)（Proteobacteria）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）隨氮添加增加呈先上升后下降趨勢(shì)，均在N2增幅最高分布最廣，增幅分別為23.26%和12.24%；放線菌門(mén)（Actinobacteria）隨氮添加增加呈遞增趨勢(shì)，且在N5增幅最高，為24.56%；硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）則與放線菌門(mén)（Actinobacteria）相反，氮添加降低了硝化螺旋菌門(mén)分布情況。由此可以看出，氮添加提高了放線菌門(mén)（Actinobacteria）分布，卻降低了己科河菌門(mén)（Rokubacteria）分布，這一研究結(jié)果與Fierer et al.（2007）不一致，可能與高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)的脆弱性和敏感性相關(guān)。土壤細(xì)菌門(mén)水平Simpson和Shannon多樣性隨氮添加增加而升高，在N5、N10濃度處理下細(xì)菌多樣性均有所增加，Simpson最大值出現(xiàn)在N10表層土壤中、為0.9935，Shannon最大值出現(xiàn)在N5表層土壤中，為8.75，Simpson和Shannon指數(shù)越大，說(shuō)明樣品的細(xì)菌多樣性越高。由此可以看出，氮添加影響濕地土壤細(xì)菌的多樣性，在門(mén)水平上表層土壤中細(xì)菌多樣性高于深層土壤。在本研究中，添加不同濃度的氮素，改變土壤微生物細(xì)菌群落的 OTU豐富度以及土壤細(xì)菌群落組成，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是因?yàn)榈乜梢蕴岣咚傩У睦塾?jì)，改變土壤理化性狀，引起土壤中微生物的生境發(fā)生改變，也改變了土壤地上和地下部分的微生境，從而導(dǎo)致土壤微生物多樣性增加。

3.3 氮添加背景下微生物量與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

氮添加引起土壤微生物數(shù)量的改變已是不爭(zhēng)的事實(shí)。隨著氮濃度的增加，土壤微生物數(shù)量也在增加，濕地土壤微生物數(shù)量受土壤營(yíng)養(yǎng)限制較大，本試驗(yàn)的施氮量可能還沒(méi)有達(dá)到土壤的氮限制水平，從而促進(jìn)了土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)，并在較高水平的N5和N10處理下達(dá)到顯著水平。也有研究認(rèn)為氮沉降給土壤微生物生物量帶來(lái)的是消極影響（王慶貴等，2021），本研究與此結(jié)果不相同，表明我們還需從沉降強(qiáng)度、生境類型等方面開(kāi)展持續(xù)、深入的研究，才能使我們更好地了解氮沉降對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中微生物的影響。氮添加對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，在門(mén)水平上，N的添加顯著降低了己科河菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)的相對(duì)豐度，顯著增加了厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，而酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度變化不明顯。酸桿菌門(mén)豐度變化不大，主要受土壤pH值影響，酸桿菌門(mén)適應(yīng)低pH條件，本研究結(jié)果中土壤呈弱堿性。據(jù)報(bào)道，厚壁菌門(mén)受土壤C、N的影響（Karimi et al.，2018），本研究中，N添加導(dǎo)致全N和全C含量升高，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著提高，說(shuō)明N添加對(duì)厚壁菌門(mén)活性有顯著促進(jìn)作用。硝化螺旋菌門(mén)的相對(duì)豐度非常低，N添加下其菌門(mén)降低，表明硝化活性下降，N添加對(duì)硝化螺旋菌門(mén)有抑制作用。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異主要受土壤理化因子對(duì)土壤細(xì)菌多樣性有顯著影響。氮添加可以通過(guò)改變土壤理化因子直接影響土壤細(xì)菌豐度及多樣性，N添加對(duì)深層土壤的 ACE和Chao1指數(shù)的影響為正效應(yīng)，對(duì)Simpson和Shannon的影響為負(fù)效應(yīng)，說(shuō)明N沉降增加了土壤細(xì)菌群落的相對(duì)豐度，而降低了土壤細(xì)菌多樣性。本研究中，有機(jī)碳和全氮對(duì)深層土壤細(xì)菌的相對(duì)豐度影響極顯著，氨態(tài)氮對(duì)表層土壤的多樣性影響極顯著。施加氮肥，提高土壤的含氮量，提高了地上植物的生產(chǎn)力，從而使植物凋落物含量增加，最終導(dǎo)致土壤有機(jī)碳的累計(jì)，有機(jī)碳含量高的土壤可以提高有效碳源，為土壤微生物提供生長(zhǎng)發(fā)育所需要的能量來(lái)源，促使土壤中的微生物保持較高的活性。

4 結(jié)論

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究青海湖高寒濕地土壤細(xì)菌群落豐度和結(jié)構(gòu)，揭示了環(huán)境因子與濕地土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的內(nèi)在聯(lián)系。氮添加后，高寒濕地表層土壤全碳、有機(jī)碳含量明顯增加，而土壤pH的變化對(duì)N素添加響應(yīng)不明顯。氮添加影響土壤細(xì)菌豐度及多樣性，有機(jī)碳和全氮對(duì)深層土壤細(xì)菌的相對(duì)豐度影響極顯著，氨態(tài)氮對(duì)表層土壤的多樣性影響極顯著。本研究結(jié)果不僅使我們?cè)黾恿藢?duì)青海湖高寒濕地土壤微生物群落組成及其主要影響因素的了解，從而更好地進(jìn)行濕地生態(tài)系統(tǒng)管理，也為研究全球氣候變化下微生物介導(dǎo)的元素循環(huán)提供了理論參考。