基于16S rRNA 高通量測序技術(shù)探究補(bǔ)中益氣加減方對胃癌荷瘤小鼠腸道菌群的影響

陳亞玲 陳 旭 張瑞娟 孫慶敏

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029）

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在胃腸道癌癥中均位居第二[1]。近年來對胃癌發(fā)病機(jī)制已有較深入的研究，但仍未完全明確。腸道微生態(tài)被稱為“被遺忘的功能器官”[2]，研究證實(shí)其與多種疾病相關(guān)，如炎癥性腸病和胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤。相關(guān)研究表明，胃腸道菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可抑制胃癌發(fā)展，如促進(jìn)腸道穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫環(huán)境、促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答[3-5]，又可促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[6]。

中藥服用方式主要為口服，進(jìn)入胃腸道后必與腸道微生物接觸。補(bǔ)中益氣加減方是全國名中醫(yī)劉沈林教授結(jié)合胃癌的主要病機(jī)“脾氣虛損，癥瘕積聚”，由經(jīng)典名方“補(bǔ)中益氣湯”化裁所得。臨床實(shí)踐證實(shí)，本方能明顯延長晚期胃癌患者的生存期，但其是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群來發(fā)揮抗腫瘤作用目前尚未有報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣加減方可以降低外周血中程序性死亡受體1（PD-1）的表達(dá)，減少PD-1和PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的浸潤[7]，提示該方可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中PD-1，從而抑制胃癌進(jìn)展。另有研究表明，腸道微生物可通過干擾PD-1信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，現(xiàn)有臨床證據(jù)也提示PD-1抗體的治療效果部分依賴于患者腸道微生態(tài)[8]。本研究制作胃癌荷瘤小鼠模型，觀察補(bǔ)中益氣加減方對模型小鼠瘤質(zhì)量的影響，并運(yùn)用16S rRNA高通量測序技術(shù)，分析補(bǔ)中益氣加減方和PD-1抗體對胃癌荷瘤小鼠腸道菌群組成的影響，探討兩種藥物是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成發(fā)揮抗腫瘤作用，為治療胃癌藥物的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動物 MKN-28人胃癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中，隔日更換一次新鮮培養(yǎng)基，所有用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞傳代不超過7次。SPF級小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0069。小鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)動物研究中心動物房，動物房室溫為20～24 ℃，飼料、飲水和鼠籠均嚴(yán)格消毒。本實(shí)驗(yàn)通過南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查，倫理編號：IACUC-1703033。

1.2 藥品與試劑 補(bǔ)中益氣加減方由黃芪、黨參、當(dāng)歸、甘草、升麻、柴胡、白術(shù)、陳皮、三棱、莪術(shù)按30∶15∶10∶5∶6∶6∶10∶10∶15∶15的 比 例 配 伍 組 成，藥物飲片均由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供。將藥材用1500 mL的雙蒸水浸泡30 min，先武火煮至沸騰，再文火煮30 min，倒出藥液；加1000 mL水重復(fù)上述步驟。混合2次煎煮所得的藥液，倒入鍋中濃縮至中藥濃度為1 g/mL。將濃縮的中藥2000×g離心15 min，3次，上清藥液置于4 ℃冰箱備 用。鼠 源PD-1抗 體（Bio X cell，美國，貨 號：BE0146），RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco，美國），新生牛血清（Gibco，美國），DNA提取試劑盒（Thermo公司），AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）。

1.3 主 要 儀 器 1300A2型 生 物 安 全 柜，HERAcell 1501型CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；-80 ℃超低溫冰箱（Thermo公司）；超純水機(jī)（millipore公司）；高速離心機(jī)（Thermo公司）；電子天平（Mettler公司）；HiSeq2500 PE250型測序系統(tǒng)（Illumina公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模 無菌條件下，將MKN-28人胃癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞消化重懸為3×107/mL。取24只小鼠，每只小鼠腋下皮下注射0.2 mL混勻的腫瘤細(xì)胞懸液，約為6×106個細(xì)胞。每日相同時間觀察小鼠的腫瘤生長情況，待瘤塊長到5 mm3時為造模成功，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組與給藥 造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)中益氣加減方組（中藥組）和PD-1抗體組（陽性藥物組），每組8只。另取8只正常小鼠作為正常組。中藥組按每日25 g/kg體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)24 d；陽性藥物組按每次10 mg/kg體質(zhì)量，每3日1次腹腔注射給藥，共注射8次；正常組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)24 d。給藥開始后的24 d為給藥期。

2.3 小鼠體質(zhì)量檢測 各組小鼠均從給藥第1天開始測量體質(zhì)量，每6天測量1次。

2.4 小鼠瘤質(zhì)量檢測 給藥期結(jié)束后脫頸椎處死小鼠，用手術(shù)剪剪開小鼠腫瘤周圍皮膚，用鑷子小心分離腫瘤附近組織，將剝離出來的腫瘤放在墊有錫箔紙的冰上。待所有腫瘤都取下后，稱重，記錄數(shù)據(jù)，按組別擺放、拍照。

2.5 糞便樣本收集 給藥期結(jié)束后將小鼠脫頸椎處死，用經(jīng)酒精消毒的鑷子取盲腸部位內(nèi)容物置于滅菌的EP管中，每只小鼠收集3～4顆，-80 ℃保存?zhèn)溆?，用?6S rRNA高通量測序分析。

2.6 16S rRNA高通量測序技術(shù)檢測小鼠腸道菌群

2.6.1 DNA提取與測序 利用DNA提取試劑盒提取糞便中的總DNA，檢測DNA的純度和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

2.6.2 PCR擴(kuò)增 對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為338F（5’-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3’）。每個樣本重復(fù)3次，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，純化，Tris-HCl洗脫，最后用2%瓊脂糖電泳檢測。

2.6.3 熒光定量 利用QuantiFluor?-ST（Promega，USA）進(jìn)行熒光定量檢測，并按樣本的測序量要求，對其進(jìn)行對應(yīng)比例的混合。

2.6.4 構(gòu)建文庫 使用Illumina MiSeq PE300測序儀將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建為PE文庫，根據(jù)overlap關(guān)系對Miseq測序得到的PE reads序列進(jìn)行拼接，并對其進(jìn)行質(zhì)控和過濾，得到優(yōu)化序列，最終獲取操作分類單元（OTUs）。

2.6.5 生物信息學(xué)分析 對OTUs進(jìn)行聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTUs進(jìn)行α多樣性分析和β多樣性分析。α多樣性指數(shù)分析物種的種類和豐富度，β多樣性指數(shù)分析物種的組間差異和組內(nèi)差異。通過物種組成分析可發(fā)現(xiàn)小鼠腸道微生物區(qū)系在門水平和屬水平上的物種差異性。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（xˉ±s）表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊則采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett's檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠體質(zhì)量和瘤質(zhì)量比較 如圖1-A所示，給藥期間各組小鼠體質(zhì)量波動不明顯，給藥第24天，模型組與各給藥組小鼠體質(zhì)量與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明藥物在體內(nèi)幾乎沒有明顯毒性作用。如圖1-B、圖1-C所示，與模型組比較，中藥組和陽性藥物組瘤質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），中藥組與陽性藥物組組間瘤質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明中藥和PD-1 抗體對胃癌荷瘤小鼠腫瘤的生長均有明顯的抑制作用。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化（A）、給藥結(jié)束后瘤質(zhì)量比較（B）和剝離后腫瘤形態(tài)比較（C）

3.2 各組小鼠腸道菌群多樣性比較 如圖2-A所示，小鼠腸道菌群的數(shù)量隨著樣本數(shù)量的增加而趨于某一恒定值，表明測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度足以反映樣本中群落豐度水平。如圖2-B所 示，16S rRNA基 因V3-V4可變區(qū)的理論長度為400～440之間，將所有測得的序列進(jìn)行統(tǒng)計，大部分序列的長度為400～420和420～440，即處于理 論長度范圍內(nèi)，表明測序質(zhì)量良好。如圖2-C所示，利用OTUs分布Venn圖分析組間菌群OTUs數(shù)量（OTUs數(shù)量又可代表群落豐度）和其種類交叉情況。各組特異性/總的OTUs數(shù)目分別為：正常組1309/8508、模型組6236/12 995、中藥組1110/7953、陽性藥物組462/5919，各組共檢測OTUs 17 905個，其中共有OTUs 3143個，為總OTUs數(shù)的17.55%。與正常組比較，模型組的OTUs數(shù)量升高；與模型組比較，中藥組和陽性藥物組的OTUs數(shù)量降低，接近于正常組。這一結(jié)果表明中藥和PD-1抗體可能降低了腸道菌群的整體水平和多樣性。

圖2 小鼠腸道菌群的Specaccum物種累積曲線（A）、優(yōu)質(zhì)序列分布（B）和各組小鼠腸道菌群OTUs分析（C）

α多樣性通過對腸道菌群的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)進(jìn)行分析來評估微生物的多樣性，包括豐富度指數(shù)（Observed_species、Chao1）和多樣性指數(shù)（PD_whole_tree、Shannon）。分析結(jié)果如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠腸道菌群豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、陽性藥物組小鼠腸道菌群豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）。與中藥組比較，陽性藥物組小鼠腸道菌群豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，與模型組比較，中藥組、陽性藥物組的腸道菌群豐富度和多樣性均顯著降低，且趨近于正常組。

表1 各組小鼠腸道菌群的α多樣性指數(shù)分析（xˉ±s）

β多樣性可通過主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）來研究微生物群落間構(gòu)成的差異。如圖3所示，模型組和正常組小鼠的腸道菌群明顯分開，表明這2組小鼠的菌群結(jié)構(gòu)組成存在顯著性差異；中藥組接近正常組，表明其菌群多樣性和結(jié)構(gòu)組成與正常組接近，可能和正常組存在著一定的關(guān)聯(lián)性。

圖3 各組小鼠腸道菌群的β多樣性分析

3.3 各組小鼠腸道菌群組成與結(jié)構(gòu)分析

3.3.1 門水平腸道菌群組成 如圖4-A所示，除去部分未檢測出的菌門，主要由擬桿菌門 （Bacteroidetes）、厚 壁 菌 門（Firmicutes）、變 形菌門（Proteobacteria）等3個菌門組成，其中擬桿菌門和厚壁菌門的豐度在檢測出的菌門中比例達(dá)到90%以上。與正常組比較，模型組小鼠腸道中Bacteroidetes豐度降低，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria豐度升高，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，中藥組和陽性藥物組Bacteroidetes、Proteobacteria豐度升高，F(xiàn)irmicutes豐度降低，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組小鼠Firmicutes/Bacteroidetes值（F/B值）顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組、陽性藥物組小鼠F/B值顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明給藥處理后可回調(diào)小鼠腸道菌群的菌門水平和結(jié)構(gòu)組成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。詳見圖4-B。

圖4 各組小鼠腸道菌群在門水平上的組成（A）、F/B值比較（B）

3.3.2 屬水平腸道菌群組成 小鼠糞便樣品中共檢測到212個菌屬，各組屬水平組成如圖5所示。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠具有顯著性差異的菌屬有37個；與模型組比較，中藥組小鼠具有顯著性差異的菌群靶點(diǎn)有12個，陽性藥物組小鼠具有顯著性差異的菌群靶點(diǎn)有18個。此外如表2所示，我們發(fā)現(xiàn)與模型組比較，中藥和PD-1抗體可共同調(diào)節(jié)Muribaculum、Enterorhabdus、A n a e r o s t i p e s、B a r n e s i e l l a、Clostridium、Lacrimispora、Mediterraneibacter、Lactonifactor、Dorea、Streptococcus10個 菌 群 靶點(diǎn)（P＜0.01，P＜0.05），但 中 藥組和陽性藥物組組間的菌屬差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠腸道菌群具有顯著性差異菌屬的相對豐度值（xˉ±s）

圖5 各組小鼠腸道菌群在屬水平上的組成

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胃癌是由飲食不節(jié)、正氣虛弱、情志內(nèi)傷等多因素導(dǎo)致。中醫(yī)藥治療具有整體觀和辨證論治特色[9]，其強(qiáng)調(diào)的“整體觀”與微生態(tài)理論強(qiáng)調(diào)的“平衡與協(xié)調(diào)”相一致[10]。腸道菌群是由腸道內(nèi)眾多的真菌和細(xì)菌等微生物組成，其組成改變可導(dǎo)致腸道微生態(tài)的變化，腸道平衡被打破與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。中醫(yī)藥可通過多種方式調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)，使其達(dá)到平衡，如抑制病原菌在腸道中定植、促進(jìn)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生[11]等，從而達(dá)到抗腫瘤作用。也有研究表明，中醫(yī)證候表型與腸道菌群相關(guān)[12]，特別是脾虛證[13]。有報道表明以健脾養(yǎng)胃法為主要治則的方藥可通過多靶點(diǎn)多層次的途徑調(diào)節(jié)腸道菌群，發(fā)揮抗腫瘤作用[14]。陳彬等[15]研究證實(shí)健脾解毒方可增加益生菌的數(shù)量，促進(jìn)其定植和活性，抑制瘤體的生長。補(bǔ)中益氣加減方針對胃癌患者的基本病機(jī)“脾氣虛損”而擬，因此其可能也通過調(diào)節(jié)腸道菌群實(shí)現(xiàn)治療胃癌的目的。PD-1的配體PD-L1在幾種癌癥中高度表達(dá)，因此PD-1在癌癥免疫逃避中的作用已得到很好的證實(shí)。許多腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1，抑制PD-1和PD-L1之間的相互作用可以增強(qiáng)體外T細(xì)胞反應(yīng)并介導(dǎo)臨床前抗腫瘤活性。

腸道菌群組成的變化可能改變腸道微生態(tài)，對患者的代謝和免疫功能造成影響，從而導(dǎo)致胃腸道疾病和自身免疫疾病[16]。朱燕燕等[17]運(yùn)用PCRDGGE基因指紋圖譜技術(shù)檢測出了在胃癌患者和健康正常個體之間，腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)存在顯著性差異。也有研究表明胃中的微生物參與致癌物的產(chǎn)生[18]，細(xì)菌過度生長是潛在的促癌因子[19]。本研究中Venn圖、β多樣性分析結(jié)果表明，造模使腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，但其在給藥后逐漸恢復(fù)，接近正常組，表明補(bǔ)中益氣加減方和PD-1抗體可能通過改善小鼠腸道菌群的豐度和β多樣性發(fā)揮抗腫瘤作用。腸道菌群組成與結(jié)構(gòu)分析表明，補(bǔ)中益氣加減方和PD-1抗體可回調(diào)3個菌門和10個菌屬。在門水平上，造模后Bacteroidetes豐度降低，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria豐度升高，給藥處理后回調(diào)。目前研究提示與胃癌相關(guān)的細(xì)菌，主要包括Streptococcus和Clostridium等[20-21]。Streptococcus感染與胃癌相關(guān)[22]，在胃癌中具有潛在的致癌作用[23]。Clostridium在胃癌組織中含量增加，并在胃癌患者胃微環(huán)境中定植[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，Clostridium定植使Treg細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子TGF-β含量增加，還可明顯促進(jìn)Foxp3表達(dá)細(xì)胞的分化[25]。帶有Clostridium簇XIVa相關(guān)鞭毛蛋白特異性TCR的Foxp3+Treg細(xì)胞可以誘導(dǎo)腸道中的IgA+B細(xì)胞減少黏膜對微生物區(qū)系抗原的攝取，并阻止T細(xì)胞的激活[26]。Clostridium還可直接或間接將信號傳遞給條件樹突狀細(xì)胞，驅(qū)動Treg細(xì)胞或效應(yīng)性T細(xì)胞的形成，影響Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能[27]。Barnesiella可改變腫瘤的微環(huán)境，減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，刺激同源的抗腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）反應(yīng)[28]。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)中益氣加減方和PD-1抗體能夠改善胃癌荷瘤小鼠腸道菌群α、β多樣性，并對10種差異菌屬具有顯著回調(diào)能力，使腸道微環(huán)境由紊亂恢復(fù)平衡，表明其通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮治療作用。

綜上，與模型組比較，補(bǔ)中益氣加減方和PD-1抗體單獨(dú)給藥均可明顯抑制胃癌荷瘤小鼠瘤質(zhì)量，可有效改善胃癌荷瘤小鼠腸道菌群多樣性的變化，回調(diào)Streptococcus、Clostridium和Barnesiella等10個 相 關(guān) 菌屬，維護(hù)腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究檢測指標(biāo)補(bǔ)中益氣加減方和PD-1抗體組間差異不大，說明中藥的效果和PD-1抗體類似，表明補(bǔ)中益氣加減方抑瘤作用的潛在機(jī)制和PD-1抗體存在部分共同點(diǎn)，可能是通過它們共同調(diào)控的10個菌屬發(fā)揮作用，但詳細(xì)的機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。鑒于腸道菌群在腫瘤治療中的重要性，本課題組未來將聚焦于此次發(fā)現(xiàn)的10個差異菌屬在消化道疾病或消化道腫瘤中可能具有的功能，并對這些菌屬進(jìn)行鑒定，從而研究是否能分離出可預(yù)防消化道疾病或腫瘤的益生菌。