鰱魚感染嗜水氣單胞菌FAH5后免疫因子的變化研究

余文杰，謝建華

(漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，福建漳州 363000)

鰱魚屬于鯉形目的鯉科，體側(cè)扁平，腹部大。鰱魚肉質(zhì)柔軟細(xì)膩，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和氨基酸，對(duì)人體營養(yǎng)價(jià)值較高，特別適合小孩、孕婦食用。鰱魚作為濾食性淡水生物，食用浮游生物和硅藻及其衍生物、動(dòng)植物碎屑等。目前福建省漳州地區(qū)和漳浦地區(qū)形成了較大規(guī)模的養(yǎng)殖基地和養(yǎng)殖場。但是養(yǎng)殖場為了獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益，采用高密度養(yǎng)殖和高蛋白餌料投食，使得鰱魚的水生環(huán)境惡化，引起鰱魚傳染性疾病經(jīng)常暴發(fā)，養(yǎng)殖場為了防治這些傳染性疾病耗費(fèi)了大量的人力物力和財(cái)力。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，這些傳染病的源頭主要是嗜水氣單胞菌FAH5的感染。嗜水氣單胞菌是隸屬于氣單胞菌科和氣單胞菌屬的革蘭陰性菌，存在于水體環(huán)境中。嗜水氣單胞菌會(huì)使得水生生物產(chǎn)生氣單胞菌敗血癥和溶血病。嗜水氣單胞菌體內(nèi)存在的溶血素和氣溶素會(huì)引發(fā)寄主細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)容物分散出來，最終導(dǎo)致其死亡。鰱魚血液鐵元素可以和蛋白質(zhì)合成載鐵血紅蛋白，主要功能是輸送氧氣和二氧化碳。同樣鰱魚體內(nèi)鐵元素參與免疫系統(tǒng)發(fā)揮積極有效作用，可以增加巨噬細(xì)胞的殺菌作用。但是鐵元素也是病原體的生長元素，使得病原體生長迅速。所以，水產(chǎn)動(dòng)物鰱魚可以通過調(diào)節(jié)鐵元素相關(guān)基因的表達(dá)過程來控制血液鐵濃度和載鐵蛋白濃度，從而抑制和拮抗外來病原體的生長。鐵調(diào)素蛋白可以由20基因表達(dá)得到，在鰱魚肝細(xì)胞產(chǎn)生，具有很強(qiáng)的抑菌活性。鐵調(diào)素蛋白的含量高低與鰱魚體內(nèi)的鐵元素濃度有密切關(guān)系。白細(xì)胞介素-1由-1基因編碼，可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，有助于激活蛋白酪氨酸激酶和應(yīng)激因子信號(hào)通路，可以增加鐵調(diào)素基因表達(dá)，促進(jìn)鐵調(diào)素成熟和發(fā)揮生物學(xué)功能，達(dá)到機(jī)體免疫的基本目的。該研究通過檢測健康鰱魚感染嗜水氣單胞菌FAH5后，分析鰱魚機(jī)體血液鐵濃度、血液載鐵蛋白濃度和肝臟鐵濃度的變化，以及鰱魚肝臟中20、-1、1和1基因表達(dá)變化情況，從而探討溶血性嗜水氣單胞菌FAH5感染鰱魚對(duì)免疫因子的變化情況，獲得水生生物鰱魚鐵元素相關(guān)基因和鐵元素濃度在感染嗜水氣單胞菌FAH5過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

健康鰱魚從福建省淡水水產(chǎn)研究所鰱魚養(yǎng)殖基地購買得到，健康鰱魚幼體外表光亮、整潔、活動(dòng)靈活、反應(yīng)靈敏。獲得的幼魚重量是(80±10)g，長度是(18±2)cm。按照試驗(yàn)?zāi)康膶⒔】钓桇~隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)定3個(gè)平行，每個(gè)平行有50尾鰱魚，總共300尾。

將前期分離得到的感染活性嗜水氣單胞菌FAH5采用瓊脂富集培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，使用0.65%無菌生理鹽水將培養(yǎng)菌稀釋成5.0×10CFU/mL，然后使用一次性注射針吸取0.1 mL菌體腹腔注射試驗(yàn)組鰱魚。對(duì)照組鰱魚腹腔注射0.1 mL 0.65%無菌生理鹽水。試驗(yàn)處理后12、24、36、48、60、72、84、96和108 h作為試驗(yàn)點(diǎn)，收集每個(gè)平行中的3尾鰱魚。收集得到鰱魚尾部靜脈血0.5～0.6 mL，血液中加肝素鈉防止凝集，并保存在4 ℃冰箱備用。抽血完成后鰱魚超凈工作臺(tái)中解剖，得到肝臟保存在-80 ℃冰箱中備用。

血液鐵濃度和載鐵蛋白濃度的測定是采用供應(yīng)商的血液鐵濃度和載鐵蛋白濃度檢測試劑盒(上海瑞楚生物科技有限公司)進(jìn)行。該試驗(yàn)使用紫外分光光度計(jì)(UV-1800，上海清華科學(xué)儀器有限公司)對(duì)樣本進(jìn)行重復(fù)測定3次，取其平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

該試驗(yàn)采用干法消化的技術(shù)測定肝臟鐵元素濃度。鰱魚肝臟解凍后，采用無菌生理鹽水清洗3次，采用濾紙吸干表面水分，并稱重，然后放入坩堝中，使用馬弗爐600 ℃灼燒約5 h，直到樣品呈現(xiàn)白色或灰白色。最后自然冷卻至室溫，灼燒后樣品再加入1∶1的硝酸水溶液5 mL，電爐消化至沸騰，濾紙過濾消化液后移入容量瓶，使用雙蒸水多次沖洗坩堝，濾紙過濾后移入容量瓶，使用雙蒸水定容至50 mL。使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-1200，北京吉田儀器有限公司)對(duì)樣本重復(fù)測定3次，取其平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

通過NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)鰱魚20基因cDNA序列、-1基因cDNA序列、1基因cDNA序列和1基因cDNA序列引物，具體引物序列見表1。而后采用RNAiso plus total RNA提取試劑盒(寶生物工程大連有限公司)獲取鰱魚肝臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量儀(RTQ-960 pro，艾康生物技術(shù)杭州有限公司)對(duì)這4種基因進(jìn)行分析。這4種基因的相對(duì)表達(dá)量使用鰱魚18S rRNA基因表達(dá)量為對(duì)照。QR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)溶液：10倍PCR緩沖液5.0 μL、dNTP混合液3.0 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、cDNA模板2.0 μL、酶0.5 μL，ddHO補(bǔ)足終體積30.0 μL。QR-PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性93 ℃，3 min；90 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。每個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)平行檢測3次。

表1 鰱魚肝臟鐵元素相關(guān)基因QR-PCR引物序列

所有獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，采用檢驗(yàn)分析差異顯著性。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h時(shí)血液鐵濃度的變化情況見圖1。鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h時(shí)，試驗(yàn)組相比較對(duì)照組，血液鐵濃度均出現(xiàn)降低，其中在24和36 h時(shí)達(dá)到顯著差異(<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)圖1 鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h血液鐵濃度的變化Fig.1 Changes of blood iron concentration in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h血液載鐵蛋白濃度的變化情況見圖2。鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h時(shí)，試驗(yàn)組相比較對(duì)照組，血液載鐵蛋白濃度均出現(xiàn)上升，但均未達(dá)到顯著差異(>0.05)。

圖2 鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h血液載鐵蛋白濃度的變化Fig.2 Changes of blood ferritin concentration in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟鐵濃度的變化情況見圖3。鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h時(shí)，試驗(yàn)組相比較對(duì)照組，肝臟鐵濃度均出現(xiàn)上升，但均未達(dá)到顯著差異(>0.05)。

圖3 鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟鐵濃度的變化Fig.3 Changes of liver iron concentration in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟20基因表達(dá)的變化情況見圖4。鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h時(shí)，試驗(yàn)組相比較對(duì)照組，肝臟20基因表達(dá)量均出現(xiàn)增加，在12和24 h時(shí)達(dá)到顯著差異(<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)圖4 鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟hepc20基因表達(dá)的變化Fig.4 Changes of liver hepc20 gene expression in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟-1基因表達(dá)的變化情況見圖5。鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h時(shí)，試驗(yàn)組相比較對(duì)照組，肝臟-1基因表達(dá)量均出現(xiàn)增加，在24和36 h時(shí)達(dá)到顯著差異(<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)圖5 鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟il-1基因表達(dá)的變化Fig.5 Changes of liver il-1 gene expression in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟1基因表達(dá)的變化情況見圖6。鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h時(shí)，試驗(yàn)組相比較對(duì)照組，肝臟1基因表達(dá)量均出現(xiàn)增加，在12和24 h時(shí)達(dá)到顯著差異(<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)圖6 鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟jak1基因表達(dá)的變化Fig.6 Changes of liver jak1 gene expression in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟1基因表達(dá)的變化情況見圖7。鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h時(shí)，試驗(yàn)組相比較對(duì)照組，肝臟1基因表達(dá)量均出現(xiàn)增加，在12和24 h時(shí)達(dá)到顯著差異(<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)圖7 鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后12～108 h肝臟stat1基因表達(dá)的變化Fig.7 Changes of liver stat1 gene expression in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

3 討論

鰱魚體內(nèi)的鐵元素可以合成機(jī)體多種活性酶，發(fā)揮免疫學(xué)功能，增加巨噬細(xì)胞的殺菌能力。同時(shí)會(huì)生成鐵合血紅蛋白，功能是輸送氧氣和二氧化碳。與此同時(shí)，鐵元素作為病原體生長必需元素，可以增加其生長速度和生長數(shù)量。病原體和鰱魚水生生物存在相互競爭關(guān)系，使得鰱魚鐵元素相關(guān)基因產(chǎn)生積極調(diào)節(jié)，可以減少體內(nèi)血液鐵濃度，增加血液載鐵蛋白濃度，進(jìn)而可以減少病原體的生長速度和生長數(shù)量，降低病原體的危害程度。該研究開展了鰱魚血液鐵濃度和血液載鐵蛋白濃度的比較試驗(yàn)，鰱魚在受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后，鰱魚血液鐵濃度開始減少，24、36 h時(shí)達(dá)到顯著差異；鰱魚肝臟鐵濃度出現(xiàn)上升，但是均未達(dá)到顯著差異。說明鰱魚受到病原體感染后，通過自身免疫調(diào)節(jié)，降低機(jī)體鐵元素循環(huán)，進(jìn)而抑制病原體的生長。鰱魚受到病原體感染后，血液載鐵蛋白濃度出現(xiàn)上升，但均未達(dá)到顯著差異。血液鐵濃度和載鐵蛋白濃度的比值會(huì)出現(xiàn)明顯下降，從而減少嗜水氣單胞菌FAH5生長所需的鐵元素，自然就會(huì)降低病原體的生長速度和生長數(shù)量。

鰱魚體內(nèi)存在鐵元素代謝相關(guān)基因，鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后，機(jī)體內(nèi)肝臟組織的20、-1、1和1基因表達(dá)量出現(xiàn)明顯上升，證實(shí)相關(guān)基因有助于提升鰱魚機(jī)體免疫反應(yīng)，達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的目的，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的鐵元素濃度。20鐵調(diào)素基因的表達(dá)產(chǎn)物抑制腸道鐵元素的吸收，抑制肝臟鐵元素的釋放，增加血液載鐵蛋白濃度，進(jìn)而降低血液鐵濃度。眾多研究也證實(shí)了這個(gè)現(xiàn)象，鯽魚受到嗜水氣單胞菌感染后，肝臟、脾臟、鰓體組織器官的20基因的表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)明顯上升；草魚受到鏈球菌感染后，肝臟組織20基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA水平會(huì)出現(xiàn)明顯上升；鰻魚受到鰻利斯頓氏菌感染后，肝臟組織20基因表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)明顯上升。該研究結(jié)果與前人基本一致，20基因在受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后，表達(dá)量出現(xiàn)上升，12、24 h時(shí)具有顯著差異。鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后，免疫細(xì)胞也會(huì)通過調(diào)控-1基因表達(dá)量，合成和分泌白細(xì)胞介素-1，感染程度與其濃度關(guān)系緊密。白細(xì)胞介素-1通過免疫反應(yīng)過程調(diào)控20基因的表達(dá)量，也會(huì)調(diào)節(jié)鰱魚鐵元素濃度。-1白細(xì)胞介素結(jié)合免疫因子受體后可以調(diào)控1基因，從而可以調(diào)控1基因，最后調(diào)節(jié)20基因的表達(dá)量。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后，肝臟組織-1基因表達(dá)量出現(xiàn)上升，24、36 h時(shí)達(dá)到顯著差異(<0.05)。肝臟組織1基因的表達(dá)量出現(xiàn)上升，12、24 h時(shí)達(dá)到顯著差異(<0.05)。肝臟組織1基因的表達(dá)量出現(xiàn)上升，12、24 h時(shí)達(dá)到顯著差異(<0.05)。這些研究結(jié)果證實(shí)，鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后，其機(jī)體會(huì)快速產(chǎn)生免疫反應(yīng)，-1基因的表達(dá)影響到1和1基因的表達(dá)，然后影響到20基因的表達(dá)量，從而調(diào)節(jié)水生生物鐵元素濃度，使得病原體生長速度和生長數(shù)量降低，降低其危害程度。

4 結(jié)論

健康鰱魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染不同時(shí)間后，鰱魚血液鐵濃度出現(xiàn)不同程度的降低，其中24和36 h時(shí)與對(duì)照組比較，達(dá)到顯著差異；血液載鐵蛋白濃度與對(duì)照組比較，出現(xiàn)不同程度上升，但均未達(dá)到顯著差異；肝臟鐵濃度與對(duì)照組比較，出現(xiàn)不同程度上升，但均未達(dá)到顯著差異。肝臟中20鐵調(diào)素基因的表達(dá)量均出現(xiàn)增加，在12和24 h時(shí)與對(duì)照組比較達(dá)到顯著差異；肝臟中-1白細(xì)胞介素基因的表達(dá)量均出現(xiàn)增加，在24和36 h時(shí)與對(duì)照組比較達(dá)到顯著差異；肝臟中酪氨酸激酶1基因的表達(dá)量均出現(xiàn)增加，在12和24 h時(shí)與對(duì)照組比較達(dá)到顯著差異；肝臟中1應(yīng)激因子基因的表達(dá)量均出現(xiàn)增加，在12和24 h時(shí)與對(duì)照組比較達(dá)到顯著差異。因此，鰱魚機(jī)體通過調(diào)節(jié)鐵調(diào)素基因20、白細(xì)胞介素基因-1、酪氨酸激酶基因1、應(yīng)激因子基因1等免疫基因的表達(dá)的變化，降低機(jī)體游離鐵濃度和增加儲(chǔ)存鐵濃度來應(yīng)對(duì)嗜水氣單胞菌FAH5的感染。