煙籽油堿催化異構(gòu)化制備共軛亞油酸技術(shù)研究

張建會(huì)，李清鈺，肖 勇，杜詠梅，楊興友，江 鴻，侯小東*

(1.中國(guó)煙草總公司四川省公司，四川成都 610041；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266101)

共軛亞油酸(CLA)是含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸在不同位置和立體構(gòu)型上形成的異構(gòu)體的總稱。CLA 異構(gòu)體種類繁多，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有28 種，其中以c9，t11-CLA 和 t10，c12-CLA 的研究較多，生理活性突出。研究表明c9，t11-CLA 和 t10，c12-CLA 具有抗癌、抗炎、抗糖尿病、減肥、增強(qiáng)免疫力等功能，廣泛應(yīng)用于保健品、功能食品及食品添加劑等領(lǐng)域。天然的CLA主要存在于一些反芻動(dòng)物如牛、 羊的乳脂及肉制品中，含量甚微，因此人工合成成為獲取 CLA 的主要途徑。人工合成CLA是將亞油酸或富含亞油酸的原料，通過(guò)異構(gòu)化反應(yīng)制得。而為了得到含量較高的CLA，通常需要植物油亞油酸含量達(dá)到50%以上，目前用于生產(chǎn)植物油主要有紅花籽油、大豆油和葵花籽油等。其中，紅花籽油亞油酸含量80.37%，是生產(chǎn)CLA的主要原料。但紅花籽產(chǎn)量不高(1 800 kg/hm)，且藥用紅花與油用紅花存在競(jìng)爭(zhēng)，用于生產(chǎn)紅花籽油的紅花有限。

煙草種子含油量40%，油中不飽和脂肪酸含量達(dá)到89.38%，亞油酸(LA)含量最高(74.5%～76.9%)，LA含量和紅花籽中相當(dāng)。研究表明，煙草種子產(chǎn)量1 800 kg/hm與紅花籽產(chǎn)量相似，而煙草種子可以在煙葉采摘結(jié)束后留花留種，因此煙草種子作為原料更有優(yōu)勢(shì)。筆者以煙籽油作為原料，以強(qiáng)堿為催化劑，通過(guò)堿異構(gòu)化法制備 CLA，探索不同因素對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響，然后通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，形成煙籽油制備 CLA 的工藝條件，以期為草種子油作為原料制備CLA提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

煙籽油：熱榨自制。脂肪酸組成及含量：棕櫚酸7.42%，硬脂酸2.56%，油酸10.06%，亞油酸79.15%，亞麻酸0.81%。

CLA 標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；丙三醇、乙二醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇、正己烷、無(wú)水乙醇、氫氧化鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水硫酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟化硼(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司。

7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)，cp-sil88毛細(xì)管柱(美國(guó)Agilent公司)，WH220-HT磁力攪拌機(jī)(德國(guó)WIGGENS公司)，電子分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司)，RE100-PRO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京Dragonlab公司)，DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠)，KQ-500DA數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

煙籽油制備CLA方法。2.0 g氫氧化鉀溶于20 mL丙二醇中，N保護(hù)油浴加熱到170 ℃，加入5 g煙籽油，反應(yīng)4 h，冷卻至室溫，加入蒸餾水終止反應(yīng)。樣品轉(zhuǎn)移到分液漏斗，加入HCl調(diào)節(jié)pH為1～3。用正己烷萃取并用飽和NaCl溶液洗滌至中性。萃取液蒸去正己烷，得到含有CLA的混合脂肪酸。

游離脂肪酸甲酯化方法。將含有CLA的混合脂肪酸0.3 g加入5 mL BF-CHOH溶液中，迅速置于80 ℃油浴鍋中反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，得到透明溶液。溶液中加入一定量的飽和NaCl溶液，輕輕振蕩，正己烷萃取2次合并，無(wú)水硫酸鈉過(guò)膜干燥裝瓶，采用GC-MS分析檢測(cè)脂肪酸的組成及相對(duì)含量。

脂肪酸甲酯檢測(cè)方法。分析柱：CP-Sil88(100 m×250.0 μm×0.2 μm)，載氣：氦，流速：24 mL/min，分流比：20∶1，進(jìn)樣量：1 μL，柱升溫程序：120 ℃保持1 min，以20 ℃/min的速率升溫到200 ℃，保持28 min。

所有數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel、SPSS和Designer Expert軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

在丙二醇20 mL，氫氧化鉀2.0 g，煙籽油5 g，反應(yīng)時(shí)間4 h的條件下，研究反應(yīng)溫度130、140、150、160、170、180 ℃對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，在反應(yīng)溫度為130 ℃時(shí)，亞油酸異構(gòu)化為CLA的轉(zhuǎn)化率為4.50%，隨著溫度的升高，轉(zhuǎn)化率也逐漸升高，在反應(yīng)溫度達(dá)到180 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到89.92%。綜合考慮異構(gòu)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和溶劑的沸點(diǎn)(丙二醇在180 ℃臨近沸點(diǎn))，選擇160～180 ℃作為下一步優(yōu)化反應(yīng)條件的溫度。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the conversion rate of CLA

在丙二醇20 mL，氫氧化鉀2.0 g，煙籽油5 g，反應(yīng)溫度170 ℃的條件下，研究反應(yīng)時(shí)間1、2、3、4、5、6 h對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，在反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí)，亞油酸異構(gòu)化為CLA的轉(zhuǎn)化率為5.77%，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率先逐漸增高，在5 h時(shí)轉(zhuǎn)化率最大，達(dá)64.54%；反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)為6 h，轉(zhuǎn)化率反而降低(49.91%)。反應(yīng)時(shí)間選擇4～6 h作為下一步優(yōu)化反應(yīng)條件。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of reaction time on the conversion rate of CLA

在丙二醇20 mL，煙籽油5 g，反應(yīng)時(shí)間4 h，反應(yīng)溫度170 ℃的條件下，研究催化劑用量0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 g對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可見(jiàn)，當(dāng)催化劑用量小于1.0 g時(shí)，亞油酸異構(gòu)化為CLA的轉(zhuǎn)化率為2.10%，隨著催化劑用量的增加，異構(gòu)化率急劇增加，當(dāng)用量達(dá)到3.0 g以后，趨勢(shì)明顯變緩，轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.00%以上。綜合考慮催化劑用量對(duì)異構(gòu)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，選擇2.0～4.0 g氫氧化鉀作為下一步優(yōu)化反應(yīng)條件。

圖3 催化劑用量對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of catalyst dosage on the conversion rate of CLA

響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)。在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、催化劑用量(油用量5 g)3個(gè)因素作為變量。以溫度170 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、催化劑3.0 g為中心點(diǎn)，利用軟件Design-Expert進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。響應(yīng)面的試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面及等高線分析。從圖4可知，反應(yīng)溫度()和反應(yīng)時(shí)間()交互作用顯著。當(dāng)溫度為160～170 ℃，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)溫度升高，CLA轉(zhuǎn)化率明顯增大。從曲線的走勢(shì)來(lái)看，催化劑用量在3.0～4.0 g，反應(yīng)時(shí)間在4～6 h時(shí)，CLA轉(zhuǎn)化率較高，催化劑用量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率沒(méi)有明顯影響；在催化劑用量為2.0～3.0 g，隨著催化劑用量的增加，反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CLA轉(zhuǎn)化率顯著增加，且反應(yīng)溫度(A)和催化劑用量(C)交互作用不顯著。通過(guò)對(duì)模型進(jìn)行分析，得到煙籽油最佳的制備條件是反應(yīng)溫度為171.18 ℃，反應(yīng)時(shí)間為5.22 h，催化劑用量3.43 g，在該條件下CLA轉(zhuǎn)化率預(yù)測(cè)值為93.32%。在該條件下進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到的結(jié)果平均轉(zhuǎn)化率為(92.78±0.74)%，與預(yù)測(cè)值接近。

3 結(jié)論與討論

堿催化異構(gòu)法制備CLA是把含亞油酸的原料溶解于有機(jī)溶劑中，在惰性氣體(常用氮?dú)?保護(hù)、加熱及催化劑(強(qiáng)堿)存在下使亞油酸發(fā)生共軛化反應(yīng)，產(chǎn)生CLA。反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率取決于原料、溶劑、催化劑(強(qiáng)堿)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等因素。方法簡(jiǎn)單，易于操作，是目前最常用的制備CLA的方法之一。該研究是以氫氧化鉀為催化劑，丙二醇作為溶劑，堿催化異構(gòu)化法制備煙籽油CLA。該研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度在130～180 ℃，CLA轉(zhuǎn)化率隨著反應(yīng)溫度升高而呈增大趨勢(shì)，這與陳麗敏等在研究核桃亞油酸制備CLA的結(jié)果相似。大量研究證明，堿異構(gòu)化反應(yīng)需要達(dá)到一定溫度才有較高的轉(zhuǎn)化率，但如果溫度過(guò)高，油中的亞油酸易發(fā)生反應(yīng)生成副產(chǎn)物，從而影響CLA的轉(zhuǎn)化率。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，不同植物油最佳反應(yīng)溫度相差很大。反應(yīng)時(shí)間也是該研究中的重要條件，該研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時(shí)間4～5 h時(shí)，CLA轉(zhuǎn)化率最高，超過(guò)5 h轉(zhuǎn)化率反而降低。一般認(rèn)為，異構(gòu)化反應(yīng)體系達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，體系內(nèi)易發(fā)生聚合反應(yīng)和分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)而產(chǎn)生副產(chǎn)物，CLA轉(zhuǎn)化率降低。催化劑用量是該研究中最重要的反應(yīng)條件之一，該研究選用了氫氧化鉀作為反應(yīng)催化劑，研究發(fā)現(xiàn)在丙二醇20 mL，煙籽油5 g 時(shí)，氫氧化鉀用量3.0 g時(shí)，CLA轉(zhuǎn)化率最高，繼續(xù)增加堿的用量達(dá)到4.0 g時(shí)，轉(zhuǎn)化率基本不變。這是由于煙籽油中亞油酸在氫氧化鉀作用下碳原子失氫，生成碳負(fù)離子，帶有碳負(fù)離子分子相互碰撞，從而異構(gòu)化生成CLA，隨著氫氧化鉀用量的增加，生成的碳負(fù)離子基本不變，反應(yīng)達(dá)到平衡。該研究涉及的3個(gè)反應(yīng)條件對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率均有顯著影響，為了取得最優(yōu)條件組合和轉(zhuǎn)化率的最優(yōu)值，需要選擇合理的試驗(yàn)方法。

表3 堿催化煙籽油異構(gòu)化CLA回歸方程方差分析

圖4 催化煙籽油異構(gòu)化響應(yīng)面及等高線分析Fig.4 Response surface and contour analysis of catalytic isomerization of tobacco seed oil

響應(yīng)面法是一種試驗(yàn)擬合方法，通過(guò)對(duì)具有代表性的局部各點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，回歸擬合全局范圍內(nèi)因素與結(jié)果間的函數(shù)關(guān)系，取得各因素最優(yōu)水平值，目前已廣泛應(yīng)用于CLA制備工藝中。張紅玉等用紅花籽油(亞油酸含量為77%)為原料，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化反應(yīng)，CLA轉(zhuǎn)化率為96.54%。潘群文等用海篷子籽油為原料(亞油酸73.52%)制備CLA，并對(duì)其組分進(jìn)行了分析，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化反應(yīng)，CLA轉(zhuǎn)化率可達(dá)到94.60%，產(chǎn)物中CLA含量達(dá)到68.00%。鄭云武等以橡膠籽油為原料(亞油酸含量38.04%)，CLA轉(zhuǎn)化率為83.04%，CLA的含量為31.59%。筆者選擇了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和催化劑用量3個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示在丙二醇20 mL的反應(yīng)體系下，反應(yīng)溫度為171.18 ℃，反應(yīng)時(shí)間為5.22 h，催化劑用量3.43 g，CLA轉(zhuǎn)化率最高，預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)化率為93.32%。在該條件下進(jìn)行3次試驗(yàn)，平均轉(zhuǎn)化率為(92.78±0.74)%。該研究結(jié)果表明，煙籽油亞油酸含量高，反應(yīng)后CLA轉(zhuǎn)化率高，與其他植物油相比有成分和原料優(yōu)勢(shì)，可以作為制備CLA的原料。

目前關(guān)于煙籽油開(kāi)發(fā)利用的研究很少，不同品種資源種子產(chǎn)量還不明確，下一步將繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究，篩選出種子產(chǎn)量、出油率、亞油酸含量高的品種，為煙籽油制備CLA提供更好的原料。此外，強(qiáng)堿類催化劑易對(duì)環(huán)境造成污染，需要開(kāi)發(fā)出新的催化劑，近年也出現(xiàn)了一些非強(qiáng)堿類催化劑，但催化效率較強(qiáng)堿低得多，因此制備出對(duì)環(huán)境友好的高效率催化劑是異構(gòu)化法制備CLA的下一步研究?jī)?nèi)容。