孟令雪，郭旭，孫新迪，沈洋，張偉偉，2，楊清竹，2，邵淑麗，2

（齊齊哈爾大學 1.生命科學與農(nóng)林學院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

肺癌是最常見的癌癥類型之一.2020 年，全球約有1 930 萬例新癌癥病例，1 000 萬例癌癥死亡病例.肺癌的新發(fā)病例排第二位（11.4%），約有180 萬人因肺癌死亡（18%），其是癌癥死亡的主要因素[1].在肺癌治療中，化學療法被認為是所有階段的重要治療手段[2]，但不可避免癌細胞出現(xiàn)耐藥性，進而導致化療失敗.多藥耐藥（MDR）常見的機制是癌細胞中ATP 結合盒（ABC）外排轉(zhuǎn)運蛋白的過表達.多藥耐藥相關蛋白1（MRP1）是第一個被發(fā)現(xiàn)的ABCC 亞家族轉(zhuǎn)運蛋白，也被稱為ABCC1[3]，它是一個在人體組織中廣泛表達的谷胱甘肽轉(zhuǎn)運泵，通過將GSH 和化療藥物一同泵出細胞外發(fā)揮了保護細胞的作用[4-5].已有研究證實，MRP1的過表達會導致肺癌[6]、上皮性卵巢癌[7]、乳腺癌[8]、原發(fā)性神經(jīng)母細胞瘤[9]等腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，進而影響患者的化療效果.因此，干擾MRP1的表達是逆轉(zhuǎn)癌細胞耐藥性的關鍵環(huán)節(jié).

成簇的規(guī)則間隔短回文重復序列（CRISPR）-Cas（CRISPR 相關蛋白）是一種原核適應性免疫系統(tǒng)，只存在于細菌及古生菌中，在真核生物及病毒中未發(fā)現(xiàn).目前使用最廣泛的是可用于編輯人類基因組的釀膿鏈球菌Ⅱ型CRISPR/Cas9[10].CRISPRi 工具采用滅活的Cas9（dCas9），其上的2 個核酸酶域發(fā)生突變，會與DNA 結合，但不具有DNA 切割活性.因此，該方法可以抑制基因轉(zhuǎn)錄，導致基因沉默[11].目前，應用CRISPRi 技術逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥的研究已經(jīng)逐漸深入[12].

本研究利用CRISPRi 技術構建MRP1干擾表達載體，沉默A549/DDP 細胞內(nèi)MRP1基因的表達，檢測其對川楝素敏感性的變化，為肺癌耐藥性逆轉(zhuǎn)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌A549 細胞株，人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP 細胞（北京腫瘤生物中心）；川楝素（南通飛宇生物科技有限公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基干粉（Gibico 公司）；胎牛血清（以色列Biological Iudustries）；質(zhì)粒pSPgRNA（Genscript 公司（Scotch Plams USA），由實驗室前期保存）；E.coliDH5α，質(zhì)?？焖傩×刻崛≡噭┖?，UNIQ-10 柱式總RNA 提取試劑盒，M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒，全蛋白提取試劑盒，DNA Marker（1Kb），蛋白Marker，吖啶橙，EDTA（上海生工生物工程股份有限公司）；Power SYBR?Green PCR Master Mix 試劑盒（Bioteke Corporation）；MRP1，β-actin一抗，羊二抗（美國LI-COR 公司）.

1.2 實驗方法

1.2.1 CRISPRi 技術構建MRP1干擾表達載體 根據(jù)靶點預測網(wǎng)站（http://zifit.partners.org///www.ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx）對MRP1基因啟動子區(qū)進行靶位點預測，結合轉(zhuǎn)錄因子預測軟件（http:genomatix.de/en/index.html）預測的MRP1啟動子上節(jié)能結合的轉(zhuǎn)錄因子確定3 個CRISPRi 干擾位點（見表1），每個片段的5′加BbsⅠ酶切位點序列送sangon 合成.

表1 靶向MRP1 啟動子的3 個CRISPRi 干擾位點

1.2.2 細胞培養(yǎng) 在37 ℃，5% CO2與飽和濕度環(huán)境下的細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺癌A549 和A549/DDP 細胞，根據(jù)細胞生長狀態(tài)進行傳代及后續(xù)處理，并收集細胞樣品用于實驗.

1.2.3 qRT-PCR 檢測MRP1mRNA 的表達 收集各組細胞，使用Trizol 法提取總RNA，用TOYOBO 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，用TAKARA 熒光定量試劑盒進行qRT-PCR，反應體系為：5 μL 染料、2.5 μL 水、上下游引物共1 μL，cDNA 1.5 μL.選用GAPDH為內(nèi)參，上游引物序列為：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下游引物序列為：5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′.MRP1上游引物序列為：5′-GGGGTCCTCATTATCTTCTGG-3′，下游引物序列為：5′-TGGTCTCAGGGTAGGGGTTAG-3′.所得結果以2-△△Ct方法計算mRNA 相對表達量.

1.2.4 Western blot 檢測MRP1 蛋白表達 將細胞接種到6 孔板中，待細胞生長到對數(shù)期，將干擾載體轉(zhuǎn)染進細胞中培養(yǎng)48 h，RIPA 裂解液提取總蛋白，SDS-PAGE 電泳后將蛋白樣電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶封閉1.5 h，MRP1 一抗（均按1∶500 進行稀釋）4 ℃孵育過夜，PBST 洗膜3 次，兔二抗（1∶1 000稀釋）室溫避光孵育1 h，PBST 洗膜3 次，用Odyssey IR 成像儀避光掃描蛋白條帶，數(shù)據(jù)使用ImageJ 進行分析處理.

1.2.5 MTT 法檢測細胞藥物敏感性 收集A549/DDP、轉(zhuǎn)染無關對照組及sgRNA-MRP1-2 組48 h 后的細胞，用完全培養(yǎng)液將收集到的細胞制成單細胞懸液并計數(shù)，按照每孔5×105個的密度接種到96 孔板中，分別加入濃度為0，20，40，60，80，100 nmol/L 的川楝素作用24 h，在每孔中加入20 μL 5 mg/mL 的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入180 μL DMSO，輕輕晃動后，靜置15 min.在單波長570 nm 處測定光吸收值，計算各藥物濃度下的細胞存活率，確定IC50值.細胞存活率（%）=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%.

1.2.6 激光共聚焦檢測人肺癌A549/DDP 細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞，傳代至裝有蓋玻片的6 孔板中，細胞數(shù)達到一定量時，采用PEI 轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Scrambled 及sgRNA-MRP1-2 重組載體48 h 后，加入終濃度為60 nmol/L 的川楝素繼續(xù)培養(yǎng)48 h.再用1 mL 預冷PBS 洗滌細胞，用1 mL 甲醇固定30 min，滴加200 μL吖啶橙，使吖啶橙覆蓋所有細胞，用鑷子將玻片取出，倒扣在處理干凈的載玻片上，用藍色光激發(fā)，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照.

1.2.7 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，用SPSS 25 軟件分析，采用Graphpad Prism 5軟件作圖.使用student t 檢驗進行組間比較.

2 結果與分析

2.1 CRISPRi 技術構建MRP1 干擾載體

根據(jù)MRP1基因啟動子序列，設計合成3 對CRISPRi 片段，定向克隆到pSPgRNA 載體上，重組載體測序結果見圖1.由圖1 可見，重組干擾載體序列與預期完全一致，3 種靶向MRP1干擾表達載體構建成功.

圖1 MRP1 基因重組質(zhì)粒測序圖譜

2.2 qRT-PCR 和Western Blot 檢測干擾載體對MRP1 基因表達的影響

轉(zhuǎn)染干擾載體后，細胞中MRP1基因的表達見圖2～3.與A549/DDP 細胞相比，各重組載體轉(zhuǎn)染組細胞中MRP1基因的mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）.其中轉(zhuǎn)染sgRNA-MRP1-2 重組質(zhì)粒的細胞沉默效果最顯著，MRP1mRNA 和蛋白的表達水平分別降低了59.3%，42.4%（P<0.05）.

圖2 各組細胞MRP1 mRNA 和蛋白表達情況

2.3 轉(zhuǎn)染后細胞對藥物敏感性變化的影響

順鉑對各組細胞的IC50值（見表2）顯示，與A549/DDP 細胞相比，轉(zhuǎn)染sgRNA-MRP1-2 組的IC50顯著降低（P<0.001），無關對照組與A549/DDP 組無顯著差異，表明沉默MRP1基因后細胞對川楝素的敏感性增強.

表2 各組IC50值

2.4 激光共聚焦顯微鏡下細胞形態(tài)

激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)（見圖4）.由圖4 可見，未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染無關序列組，細胞均輪廓清晰，且鏡下細胞數(shù)量較多，未出現(xiàn)明顯凋亡特征.轉(zhuǎn)染sgRNA-MRP1-2 組細胞部分發(fā)生破碎、邊緣化，視野下細胞總數(shù)大量減少.

圖4 TSN 處理48 h 后顯微鏡下細胞形態(tài)變化

3 結論與討論

成功構建3 種靶向MRP1干擾表達載體并沉默A549/DDP 細胞中MRP1的基因表達，在60 nmol/L 的川楝素作用下，細胞凋亡程度增加，提高了細胞對川楝素的敏感性.

腫瘤的發(fā)生率和死亡率逐年上升，大多數(shù)肺癌患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期.除了早期手術之外，化療是腫瘤治療的重要手段，化療效果不理想的主要原因之一是腫瘤細胞的多藥耐藥，腫瘤細胞的多藥耐藥的產(chǎn)生是一個非常復雜且相關因素較多的過程.導致肺癌多藥耐藥的因素中，P 糖蛋白（P-gp）和MRP 蛋白家族如MRP1的高表達是導致肺癌細胞產(chǎn)生多藥耐藥的重要原因之一.這些外排泵蛋白會將藥物泵出細胞外，降低了細胞內(nèi)的藥物濃度，從而使細胞產(chǎn)生耐藥性.如利用RNAi 技術沉默MRP1基因，逆轉(zhuǎn)了肝細胞癌的多藥耐藥[13].因此，調(diào)節(jié)MRP1基因的表達有可能成為逆轉(zhuǎn)癌癥耐藥并提高化療成功率的有效策略之一[14-15].

CRISPRi 技術基于一個無核酸酶活性的dCas9 蛋白，其失去切割DNA 的活性，但仍保留結合DNA 的能力.當dCas9 被引導到某個基因的轉(zhuǎn)錄起始位點TSS（transcription start site）時，dCas9 能夠物理性地阻礙RNA 聚合酶的通過，由此導致基因沉默，因此相較于RNAi 技術，CRISPRi 技術能抑制指定基因的轉(zhuǎn)錄起始，其擁有比RNAi 更高的干擾效率和更低的脫靶風險，在基因干擾能力上要優(yōu)于傳統(tǒng)RNAi 技術.

川楝素是從楝樹根皮提取到的一種四環(huán)三萜類化合物[16].川楝素抗腫瘤的研究最早是由G R Pettit從楝科植物中提取的化合物對小鼠P388淋巴細胞白血病細胞系增殖的抑制作用[17].最近的研究發(fā)現(xiàn)，川楝素具有廣譜抗腫瘤效果，能抑制多種腫瘤細胞的增殖，如肺癌A549細胞、白血病HL-60細胞和肝癌Hep3B細胞等[18-20].但其作為一種藥物制劑，在作用的同時也會受到細胞耐藥性的影響.本實驗是在沉默MRP1基因的基礎上，再加入60 nmol/L的川楝素作用于細胞，檢測沉默MRP1對人肺癌A549/DDP細胞的藥物敏感性和細胞形態(tài)的影響.結果與對照組相比，轉(zhuǎn)染后加藥組的藥物敏感性顯著增加，激光共聚焦顯微鏡下觀察到細胞由梭形變?yōu)闄E圓形等凋亡現(xiàn)象，說明干擾MRP1基因的表達，可逆轉(zhuǎn)人肺癌耐藥株A549/DDP細胞的耐藥性，有效提升腫瘤細胞的藥物敏感性.本研究結果可為川楝素在腫瘤臨床治療中研發(fā)應用提供實驗依據(jù).