白農(nóng)恩，劉李蕾，鄧 巍，姜 林，楊曉燕

（大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院/云南省高校洱海流域保護(hù)與可持續(xù)發(fā)展研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)/中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671003）

【研究意義】葉際是指整個(gè)植物地上部分的外表面，生存在葉際表面的微生物稱葉際微生物［1-3］。葉際作為一個(gè)獨(dú)特的微生境，富含豐富的微生物類群，包括真菌、細(xì)菌、病毒和原生動物等［4-5］。已有研究表明，葉際微生物能夠幫助植物對抗病原微生物、耐受逆境（干旱、紫外線、霜凍等）、促進(jìn)營養(yǎng)吸收，以及調(diào)節(jié)植物代謝平衡等［6］，而葉際微生物除對植物有積極影響外，也會對植物產(chǎn)生許多負(fù)面作用，如病原菌的積累會使植物發(fā)病［7］。因此，了解葉際微生物群落結(jié)構(gòu)及其形成機(jī)制對植物健康管理和微生物資源開發(fā)具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】葉際微生物的研究起步較晚，研究的廣度和深度不如根際微生物，但葉際微生物對于植物的健康生長發(fā)育同等重要。目前根際微生物在植物健康方面的研究已經(jīng)相對成熟，但對葉際微生物的研究仍然停留在探索初期［8-11］。這不僅阻礙了對植物與葉際微生物互作關(guān)系的認(rèn)知，也限制了葉際微生物資源的開發(fā)與應(yīng)用。細(xì)菌是自然環(huán)境中最主要的微生物類群之一，已有研究表明，植物和葉際微生物之間互相影響，雙方處在一個(gè)動態(tài)平衡的過程中。相對于根際部分，葉際部分所占植物個(gè)體的比例較根際大得多，因此對于葉際微生物的研究，既有挑戰(zhàn)也有機(jī)遇。隨著葉際微生物功能（如改變宿主微環(huán)境、防御病害、生物固氮、促進(jìn)植物生長等）的不斷發(fā)掘，葉際細(xì)菌正逐漸被人們所關(guān)注［12-13］。

【本研究切入點(diǎn)】在同一小生境條件下，植物種類差異以及植物與微生物間的相互作用對葉際微生物細(xì)菌群落的影響均較大。植物自身特性對細(xì)菌群落的影響不僅反映了植物與微生物間的相互作用，還能直接反映植物的健康狀況，能夠?yàn)閳@林植物的健康管理提供具體指導(dǎo)。在小生境下對不同植物的葉際微生物多樣性、群落組成差異等進(jìn)行比較，探究葉片微生境差異對葉際細(xì)菌群落組成的影響，是亟需解決的科學(xué)問題。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以云南省大理市大理大學(xué)古城校區(qū)一小生境為研究區(qū)域，選擇我國西南片區(qū)最常見的3 種園林喬木為研究對象，使用Illumina 高通量測序技術(shù)對大理大學(xué)古城校區(qū)50 m 半徑圓內(nèi)統(tǒng)一朝向東邊栽種的3 種園林植物（枇杷樹Eriobotyra japonica、廣玉蘭Magnolia grandif lora和大青樹Ficus altissima）不同大小葉片上的葉際細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。該研究區(qū)域土壤為棕壤，年平均氣溫為14.9 ℃，年日照時(shí)數(shù)2 227.5 h，無霜期227 d，年平均降水量1 051.1 mm，屬高原地方性氣候，四季溫差不大，干濕季分明，校園內(nèi)環(huán)境條件基本一致，能夠滿足本研究對小生境的需求。3 種園林植物中，大青樹屬于落葉闊葉植物，而廣玉蘭和枇杷樹屬于常綠闊葉植物。大青樹葉片雙面光滑富含蠟質(zhì)，幼嫩部分稍被毛。廣玉蘭葉面蠟質(zhì)最多，葉片背面有短絨毛。枇杷樹葉面有褶皺，還有一層蠟質(zhì)，且雙面被毛。這3 種植物自身顯著的特性將塑造不同的葉際微生境，為本研究提供了很好的分析基礎(chǔ)。而本研究使用的高通量測序技術(shù)能夠高靈敏度、高效、準(zhǔn)確、無偏向性、全面分析葉際細(xì)菌的多樣性［14-16］，是目前微生物生態(tài)學(xué)研究首選的技術(shù)之一［17-18］。綜上，本研究所選擇的研究對象、研究區(qū)域和試驗(yàn)技術(shù)均為小生境下3 種園林植物葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性解析提供了保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 2021 年3 月6 日，以大理大學(xué)古城校區(qū)（25° 40' 19'' N、100° 9' 17'' E）為研究區(qū)域，選擇以研究區(qū)域內(nèi)最大的1棵大青樹為中心，在其50 m 半徑圓內(nèi)朝向東邊再選擇1 棵廣玉蘭和1 棵枇杷樹，按葉片長度大?。ㄐ。?～10 cm；中：10～15 cm，大：約15 cm）進(jìn)行樹葉樣品采集。使用無菌剪刀和鑷子分別采集3 種植物不同大小葉片各3 份，共采集27 份樣品，即大青樹3 片大葉子dl1、dl2、dl3，3 片中葉子dm1、dm2、dm3 和3 片小葉子ds1、ds2、ds3；廣玉蘭3 片大葉子gl1、gl2、gl3，3 片中葉子gm1、gm2、gm3 和3 片小葉子gs1、gs2、gs3；枇杷樹3 片大葉子pl1、pl2、pl3，3 片中葉子pm1、pm2、pm3 和3 片小葉子ps1、ps2、ps3。將葉片置于一次性自封袋中，貼上標(biāo)簽后立即送至實(shí)驗(yàn)室對樣品進(jìn)行處理。

1.1.2 樣品預(yù)處理 向裝有樣品的自封袋中加入25 mL PBS 緩沖液（pH=8），超聲洗滌1 min，渦旋10 s，再以超聲清洗，渦旋2 次，將洗滌液收集于50 mL 無菌離心管中，重復(fù)此操作1 次。將兩次操作所得洗滌液置于50 mL 無菌離心管中，8 000 r/min離心10 min，獲得沉淀樣品（液氮速凍），以干冰保存送樣至深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司進(jìn)行高通量測序分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增根據(jù)E.Z.N.A.?soil 試劑盒（Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.）說明書提取樣品總DNA，DNA 濃度和純度利用NanoDrop 2000 進(jìn)行檢測，利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量。采用引物對338 F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806 R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型），擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸30 s，27 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL，包括4 μL 5×FastPfu 緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 5 μmol/L 引物、0.4 μL FastPfu 聚合酶；10 ng DNA 模板［19］。

1.2.2 PCR 產(chǎn)物純化和測序 使用2% 瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。使用TruSeqDNA PCR-Free Library Preparation Kit（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用Nova Seq 6000 PE 250 平臺上機(jī)測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Qiitme2 dada2 插件［20］對測序所得序列進(jìn)行質(zhì)控、修剪、去噪、拼接，以及去除嵌合體，得到擴(kuò)增子測序變體表格（Amplicon Sequence Variants，ASV）。將ASV 的代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫（http://greengenes.secondgenome.com，根據(jù)338 F、806 R 引物對將數(shù)據(jù)庫修剪到V3、V4 區(qū)域）進(jìn)行比對，得到物種的分類信息表。采用Qiime2 feature-table 插件［21］剔除所有污染性的線粒體和葉綠體序列，再使用Qiime2 Core-Diversity［22-23］進(jìn)行Alpha 多樣性、Beta 多樣性等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落測序文庫評價(jià)

本研究在供試的枇杷樹、廣玉蘭和大青樹所有葉樣中共獲得1 549 867 條細(xì)菌的高質(zhì)量序列，平均每片葉片檢測到57 402 條序列，各處理樣品文庫覆蓋率均達(dá)到100%。隨機(jī)抽取檢測樣本序列，將抽取的序列數(shù)與其代表的ASV 數(shù)繪制稀釋曲線，隨著序列數(shù)的增加，曲線逐漸趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加檢測樣本沒有產(chǎn)生更多新的ASV（圖1），說明本研究測序深度合適，可以進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落的Alpha 多樣性稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of alpha diversity in phyllosphere bacterial communities of three garden plants

2.2 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落注釋比例分析

通過將ASV 的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋，得到每個(gè)ASV 對應(yīng)的物種分類信息，共注釋到19 門46 綱75 目148 科259 屬141種。3 種園林植物葉際細(xì)菌群落中注釋到各階元的比例如圖2 所示，大青樹注釋到門、綱、目、科、屬、種的比例依次為92.00%、87.84%、76.00%、69.06%、57.32%、25.80%，廣玉蘭注釋到門、綱、目、科、屬、種的比例依次為91.67%、84.21%、83.51%、70.56%、54.07%、22.71%，枇杷樹注釋到門、綱、目、科、屬、種的比例依次為89.47%、89.80%、85.54%、67.97%、60.51%、22.50%。可見，3 種園林植物葉際細(xì)菌群落注釋到各階元的比例均呈逐漸下降趨勢。

圖2 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落在各個(gè)階元的注釋比例Fig.2 Annotation ratios of phyllosphere bacterial communities of three garden plants in each order

2.3 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落組成

2.3.1 在門水平上的組成和群落結(jié)構(gòu)分析 在大青樹、廣玉蘭和枇杷樹的葉際共注釋到25 個(gè)門的細(xì)菌群落（19 個(gè)已知門和6 個(gè)未知門），其中，變形菌門（Proteobacteria）細(xì)菌在3 種園林植物葉際中占絕對優(yōu)勢，占比均達(dá)70%以上，其次分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）；軟壁菌門（Tenericutes）只在大青樹和枇杷樹中注釋到，硝化螺旋菌門（Nitrospirae）只在大青樹和廣玉蘭中注釋到（圖3）。

圖3 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落的門水平組成Fig.3 Phylum level composition of phyllosphere bacterial communities of three garden plants

2.3.2 在屬水平上的組成和群落結(jié)構(gòu)分析 在大青樹、廣玉蘭和枇杷樹的葉際共注釋到259 個(gè)屬的細(xì)菌群落（圖4），排名前5 的優(yōu)勢菌屬均為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、螺狀菌屬（Spirosoma）、薄層菌屬（Hymenobacter）和無色桿菌屬（Achromobacter）。其中，鞘氨醇單胞菌屬在廣玉蘭、大青樹和枇杷樹的占比相差不大，分別為31.00%、23.00%、22.00%。其余屬在3 種植物中所占比例存在較大差異，甲基桿菌屬在大青樹、廣玉蘭和枇杷樹的占比分別為50.00%、18.00%、10.00%；螺狀菌屬在枇杷樹、廣玉蘭和大青樹中的占比分別為25%、16%、12%；薄層菌屬在枇杷樹中占比最高（47%），在大青樹和廣玉蘭中分別占比7%和6%；無色桿菌屬在枇杷樹中含量最高（41%），在大青樹中占比0.8%，在廣玉蘭中含量最高（2%）。

圖4 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落的屬水平組成Fig.4 Genus level composition of phyllosphere bacterial communities of three garden plants

由圖5 可知，無色桿菌屬為枇杷樹的第一優(yōu)勢菌屬，薄層菌屬為大青樹的第一優(yōu)勢菌屬，甲基桿菌屬為廣玉蘭的第一優(yōu)勢菌屬，每種植物的第一優(yōu)勢菌屬與其在另外兩種植物的占比均明顯不同。

圖5 27 個(gè)葉片樣品葉際細(xì)菌群落的屬水平組成Fig.5 Genus level composition of phyllosphere bacterial communities of 27 leaf samples

2.4 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落多樣性分析

2.4.1 Alp ha 多樣性分析 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落Alpha 多樣性分析結(jié)果見表1。整體上，枇杷樹葉際細(xì)菌群落多樣性水平高于大青樹和廣玉蘭；廣玉蘭的Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均最??；枇杷樹的Chao1 指數(shù)遠(yuǎn)大于大青樹，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)略小于大青樹。

表1 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落的Alpha 多樣性Table 1 Alpha diversity of phyllosphere bacte rial communities of three garden plants

2.4.2 ASV 統(tǒng)計(jì)和分類學(xué)分析 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落共有的ASV 序列有454 個(gè)，大青樹、廣玉蘭和枇杷樹樣品中特有的ASV 序列分別為808、1 462、1 623，其中廣玉蘭和枇杷樹特有的ASV 數(shù)目遠(yuǎn)大于大青樹（圖6）。

圖6 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落的ASV 韋恩圖Fig.6 ASV Venn diagrams of phyllosphere bacterial communities of three garden plants

2.4.3 B eta 多樣性分析 基于Beta 多樣性分析的3 種園林植物葉際細(xì)菌群落的NMDS 分析結(jié)果（圖7）顯示，大青樹、廣玉蘭和枇杷樹的葉片細(xì)菌群落明顯分成3 個(gè)區(qū)域，其同一植物葉片的細(xì)菌群落聚集在一起，不同植物種類的葉片細(xì)菌群落分布于不同象限。

圖7 3 種園林植物葉際細(xì)菌群落的NMDS 分析結(jié)果Fig.7 NMDS analysis results of phy llosphere bacterial communities of three garden plants

3 討論

3.1 3 種園林植物的葉際細(xì)菌群落組成和多樣性存在差異

為了探究小生境條件下由園林植物自身特性造成的葉際細(xì)菌群落差異，本研究去除了空間距離、地理位置、季節(jié)、光照等環(huán)境因素對葉際微生物群落構(gòu)建和多樣性產(chǎn)生的影響［24］，選擇以大理大學(xué)古城校區(qū)內(nèi)50 m 范圍內(nèi)朝向東邊的枇杷樹、廣玉蘭和大青樹3 種園林植物的葉片為研究對象，聚焦不同植物種類的葉際細(xì)菌群落組成和多樣性差異。結(jié)果表明，3 種園林植物的葉際存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的細(xì)菌群落，細(xì)菌多樣性從高到低依次為枇杷樹、廣玉蘭和大青樹。3 種園林植物的葉際細(xì)菌群落有共有的門、屬，也有共有的優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬，但軟壁菌門只在大青樹和枇杷樹中注釋到，硝化螺旋菌門只在大青樹和廣玉蘭中注釋到，而廣玉蘭和枇杷樹特有的門和屬最多。NMDS 分析結(jié)果表明，不同植物種類的葉際細(xì)菌群落存在差異，但同一植物不同大小葉片間的細(xì)菌群落相似，且同一植物、不同大小葉片間的第一優(yōu)勢菌屬也一樣。表明3 種植物葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，同一植物不同大小葉片間的細(xì)菌群落相似，即同一植物的葉際微生境相似。

3.2 植物自身特性會塑造獨(dú)特的葉際細(xì)菌群落

已有研究發(fā)現(xiàn)，植物葉片蠟質(zhì)層厚度的差異會影響其對微生物的吸附能力，蠟質(zhì)層越厚則葉片吸附的微生物越少，反之，蠟質(zhì)層越薄的葉片能吸附更多的微生物［25］。不同種類的植物葉片被毛情況不相同，被毛的多少間接影響微生物與植物的接觸面積及其棲息環(huán)境，從而影響葉際微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)。本研究選取的3 種園林植物中，枇杷樹葉面不僅有褶皺，還有蠟質(zhì)層，且雙面被毛；廣玉蘭葉片蠟質(zhì)最多，但葉片背面有短絨毛；大青樹葉片雙面光滑富含蠟質(zhì)，幼嫩部分稍被毛。結(jié)果顯示，枇杷樹的Chao1指數(shù)最高，大青樹次之，廣玉蘭最低；枇杷樹和大青樹葉際細(xì)菌的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)無明顯差異，但均高于廣玉蘭，說明蠟質(zhì)層和被毛的有無和多少確實(shí)會影響葉際細(xì)菌群落。此外，大青樹屬于落葉闊葉植物，而廣玉蘭和枇杷樹屬于常綠闊葉植物，落葉植物的細(xì)菌群落構(gòu)建時(shí)間短，與植物的相互作用相較于不落葉的植物也更短，因此，廣玉蘭和枇杷樹的葉際細(xì)菌相對于大青樹更多樣復(fù)雜，表明植物自身特性主導(dǎo)了葉際細(xì)菌群落構(gòu)建過程及結(jié)果，即植物自身特性會塑造獨(dú)特的葉際細(xì)菌群落。

此外，通過高通量測序技術(shù)檢測到的3 種園林植物葉際細(xì)菌在種水平上的注釋度僅占20%左右，還存在大量未知細(xì)菌，這提示我們在未來的研究中需要繼續(xù)加大純培養(yǎng)力度和宏基因測序深度，從個(gè)體到群體對葉際細(xì)菌開展持續(xù)研究挖掘葉際細(xì)菌資源。

4 結(jié)論

在小生境范圍內(nèi)，大理大學(xué)古城校區(qū)3 種主要園林植物（枇杷樹、廣玉蘭和大青樹）的葉際均具有較高的細(xì)菌多樣性，不同植物的葉際細(xì)菌群落組成和多樣性存在較大差異，而同一植物不同大小葉片間的細(xì)菌群落則相似，植物自身特性是造成這種結(jié)果的首要原因，表明植物自身特性主導(dǎo)了葉際細(xì)菌群落構(gòu)建的過程和結(jié)果，即植物自身特性會塑造獨(dú)特的葉際細(xì)菌群落。3 種園林植物葉際都具有菌株資源挖掘潛力。植物葉際細(xì)菌群落的構(gòu)建過程及結(jié)果與植物的生長習(xí)性高度相關(guān)，在開展后續(xù)相關(guān)研究時(shí)需要注意植物種類的選擇。