麻醉用藥七氟烷對發(fā)育神經(jīng)毒性機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

李海龍

撫順市第二醫(yī)院(遼寧 撫順 113000)

七氟醚是一種芳香、無刺激的無色透明液體，化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，與鈉石灰反應(yīng)生成五種物質(zhì)，易于被小兒患者接受。優(yōu)點有：麻醉誘導(dǎo)快、維持麻醉平穩(wěn)、易于調(diào)節(jié)麻醉深度、蘇醒快、保護心肌等[1]。因此，近年來七氟醚被眾多麻醉學(xué)者所鐘愛，稱其為吸入麻醉藥物的里程碑，七氟醚的麻醉誘導(dǎo)以及麻醉維持在小兒麻醉領(lǐng)域更是具有多種顯著優(yōu)勢。但有研究表明，七氟醚對發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定毒性作用，可引起神經(jīng)發(fā)育障礙[2]。兒童早期接觸七氟醚可增加青春期學(xué)習(xí)障礙的發(fā)生率[3]。關(guān)于七氟烷麻醉藥引起的發(fā)育神經(jīng)毒性的機制目前雖有學(xué)者基于不同模型進行研究，但還不是十分清楚透徹。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析及計算機技術(shù)，通過“藥物-靶標-基因-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析，探索藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)[4]。通過疾病-基因-靶點-藥物相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以將單個靶點或多個靶點在整個生物網(wǎng)絡(luò)進行定位，加速藥物靶點的發(fā)現(xiàn)，進而分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，使研究者可以全面地了解疾病病理基礎(chǔ)與藥物治療作用。

為進一步闡明七氟烷麻醉藥引起的發(fā)育神經(jīng)毒性的機制，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，運用Drugbank、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索七氟烷及發(fā)育神經(jīng)毒性的相關(guān)靶點,構(gòu)建“藥物-靶點-基因-疾病”模型及互作網(wǎng)絡(luò)，并對其交集靶點進行生物信息學(xué)分析，闡明其可能的作用機制，為后續(xù)實驗及臨床提供研究基礎(chǔ)及思路。

1 研究方法

1.1 獲取七氟烷的藥物靶點

使用DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)檢索七氟烷(sevoflurane)并提取相關(guān)的靶點基因。

1.2 檢索發(fā)育神經(jīng)毒性靶點基因

使用Gene Cards(The Human Gene Database,https：//www.geneca-rds.org/)，檢索“development Neurotoxic”，通過“export to excel”輸出Excel表格，并查找出七氟烷與發(fā)育神經(jīng)毒性的靶點基因交集，繪制韋恩圖。

1.3 氟烷-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將七氟烷靶點相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape_v3.7.1軟件，繪制七氟烷靶點網(wǎng)絡(luò)；使用STRING平臺(STRING version:10.5https：//string-db.org/)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI network)。打開STRING頁面，選擇“Multiple proteins”，將上面1.2得到在靶點基因復(fù)制到“List Of Names”中，“Organism”中選擇“Homo sapiens”，其余參數(shù)保持默認狀態(tài)，以此可構(gòu)建這些潛在靶點之間的蛋白作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO分析和KEGG通路富集分析

使用R語言軟件對七氟烷與發(fā)育神經(jīng)毒性的共同作靶點進行ID轉(zhuǎn)換；在R語言中調(diào)用bioconductor程序包進行數(shù)據(jù)的處理；運行R語言分別得到GO和KEGG富集分析的條形圖、氣泡圖、通路圖；使用Perl將轉(zhuǎn)換的ID變成原始基因靶點。

1.5 相關(guān)軟件

R語言Rx64 3.5.3及VennDiagram包、count.R包，clusterProfiler包、org.Hs.eg.db包、symbol2id包，UltraEdit，Java1.8.0_201-b09，“Perl”addSymbol.pl腳本，Cytoscape_v3.7.1。

2 結(jié)果分析

2.1 七氟烷藥物相關(guān)靶點

經(jīng)過檢索DrugBank數(shù)據(jù)庫，提取到七氟烷22個相關(guān)靶點，如表1所示。

表1 七氟烷藥物相關(guān)靶點

2.2 發(fā)育神經(jīng)毒性相關(guān)靶點

在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“development Neurotoxic”為檢索詞查找發(fā)育神經(jīng)毒性靶點信息，共得到靶點1157個。將七氟烷靶點與發(fā)育神經(jīng)毒性靶點信息進行比對并取交集，共得到靶點11個，即為七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性的潛在作用靶點。如圖1所示。

圖1 七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性的潛在作用靶點

2.3 七氟烷-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)

將映射后的交集靶基因與七氟烷，采用Cytoscape-v3.7.1軟件可視化分析，得到“七氟烷-靶點-發(fā)育神經(jīng)毒性”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2所示。此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點13個，其中11個節(jié)代表靶點，1個節(jié)點代表七氟烷，1個節(jié)點代表發(fā)育神經(jīng)毒性，共有邊21條。粉色V形節(jié)點代表七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性的候選靶點，紅色六角形節(jié)點代表發(fā)育神經(jīng)毒性，藍色矩形代表七氟烷。邊代表七氟烷與靶點的關(guān)系及發(fā)育神經(jīng)毒性與靶點的關(guān)系。由圖可知，七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性多靶標的特點。將交集得到的靶點運用STRING數(shù)據(jù)庫獲得蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)，選取置信度得分>0.7的數(shù)據(jù)，構(gòu)建七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖3所示。

圖2 “七氟烷-靶點-發(fā)育神經(jīng)毒性”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性靶點PPI

2.4 GO富集分析

對11個交集靶基因，采用R語言symbol2id包，定義log2FC為1，在“org.Hs.eg.db”數(shù)據(jù)庫中搜索，將gene name轉(zhuǎn)化為geneID，得到輸入文件，如表2所示。

表2 七氟烷發(fā)育神經(jīng)毒性作用靶點ID轉(zhuǎn)化

采用R語言bioconductor包、clusterProfiler包及id2symbol.pl腳本，在GO數(shù)據(jù)庫中檢索，fisher精確檢驗，pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.05。

GO功能(細胞組分、分子功能、生物學(xué)過程)富集分析，共獲得具有顯著意義的條目共35條，根據(jù)校正的P值排序，取排名前20的路徑，如圖4所示。富集越多顯著顏色越偏紅色，富集越少顏色越偏藍色；橫坐標表示富集數(shù)目，縱坐標表示涉及到的功能。結(jié)果表明，靶標基因主要涉及的分子生物學(xué)功能為GABA-A receptor activity(GABA-A受體活性)、transmitter-gated ion channel activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential(參與傳遞離子通道活性的突觸后膜電位的調(diào)節(jié))、neurotransmitter receptor activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential(神經(jīng)遞質(zhì)受體活動參與突觸后膜電位的調(diào)節(jié))、GABA receptor activity(GABA 受體活性)、transmitter-gated ion channel activity(傳送門控離子通道活性)、inhibitory extracellular ligand-gated ion channel activity(抑制細胞外配體門控離子通道活性)、ligand-gated anion channel activity(配體門控陰離子通道活性)、benzodiazepine receptor activity(苯二氮受體活性)、neurotransmitter receptor activity(神經(jīng)遞質(zhì)受體的活性)等。

圖4 靶標基因GO富集分析top20

2.5 KEGG富集分析

采用R語言bioconductor包、clusterProfiler包及id2symbol.pl腳本，在KEGG數(shù)據(jù)庫中檢索，fisher精確檢驗，pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.05。KEGG通路富集分析，共富集具有顯著意義7條信號通路，根據(jù)校正的P值排序，如圖5所示。七氟烷對發(fā)育神經(jīng)毒性的與Nicotine addiction(尼古丁成癮)、Retrograde endocannabinoid signaling(逆行內(nèi)源性大麻素信號傳導(dǎo))、GABAergic synapse(GABA能突觸)、Morphine addiction(嗎啡成癮)、Neuroactive ligand-receptor interaction(神經(jīng)活性配體受體相互作用)、Taste transduction(味覺傳導(dǎo))、Serotonergic synapse(5-羥色胺能突觸)有關(guān)。

圖5 靶標基因KEGG富集分析

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)由Andrew L Hopkins在2007年首次提出[5]，它是在系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、分子藥理學(xué)、多向藥理學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，運用網(wǎng)絡(luò)分析手段，從整體水平出發(fā)，構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”等分析網(wǎng)絡(luò)，探索藥物、靶點、機體相互作用關(guān)系，具有系統(tǒng)性、整體性。

近年來，越來越多的數(shù)據(jù)表明七氟烷麻醉可能對神經(jīng)具有潛在的毒性從而會引發(fā)各種臨床并發(fā)癥，其中較為常見的有術(shù)后認知功能障礙、神經(jīng)發(fā)育損傷等。本研究對七氟烷與發(fā)育神經(jīng)毒性進行分析，在信號通路富集結(jié)果中Retrograde endocannabinoid signaling通路是最值得我們關(guān)注的。有研究表明，七氟烷可能通過激活PI3K/Akt信號通路增加Cx43蛋白表達，并誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡，增加幼鼠認知功能損傷[6]。進一步通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)GSK3β,p44/p42-MAPK以及MAPK2磷酸化水平和異氟烷及七氟烷介導(dǎo)的神經(jīng)毒性有關(guān)，之后有學(xué)者也通過分子生物學(xué)實驗進行了驗證[7]。通過KEGG的Retrograde endocannabinoid signaling信號通路圖(圖5)，我們可以看出在通路中，MAPK信號通路起核心調(diào)控作用，七氟烷麻醉時對發(fā)育神經(jīng)的影響，可能是通過激活MAPK信號通路，進而影響其上下游通路，如PI3K/Akt信號通路。通過KEGG富集結(jié)果可知，在Retrograde endocannabinoid signaling中，富集的重要的靶基因有GABRA1、GRIA1、GABRA2、GABRA3、GABRA4、GABRA5、GABRA6、GABRB2、GABRB3、GABRE。關(guān)于這些靶點及信號通路在今后的研究中還需要進一步通過動物模型實驗和細胞生物學(xué)實驗進行驗證，本研究可為科研實驗提供了新思路。