水產品中生物活性肽的研究進展

◎ 張龍翼，張鵬程，陳秋月，彭海川，錢 琴，王林果，賈濺琳，張 崟

（成都大學，四川 成都 610106）

生物活性肽的分子結構介于氨基酸和蛋白質之間，是一種蛋白質片段。一旦從原始蛋白質中釋放出來，就會表現出不同的功能[1]。肽表現出的不同生物活性取決于它們的結構、組成和序列[2]。目前，生物活性肽表現出的抗氧化、抗癌、抗高血壓和抗菌等特性，使其受到了研究者的廣泛關注[3]。2019 BIOPEPUWM生物活性肽（前身為BIOPEP）數據庫顯示，現在已經發(fā)現并報道了至少4 300多種生物活性肽，可以根據它們表現出的不同生物活性對其進行分類，例如可將其分為抗菌肽、抗高血壓肽、免疫調節(jié)肽、抗氧化肽和呈味肽等[4]。

海洋面積約占地球表面積的70%，為人們提供了大量的生物資源，其豐富的魚類資源、甲殼類資源、軟體類動物資源等為人們提供了豐富的生物活性肽來源。水產品是人類重要的食物來源，在食物結構中占據重要的地位，據統(tǒng)計，2019年全國水產品總產量為6 480.36萬t[5]。目前，國內外許多研究人員已從水產品及其副產品中提取出了具有各種功能的生物活性肽，例如WANG等[6]通過蛋白酶從鰱魚中提取出了抗氧化肽；宋茹[7]以黃鯽為原料，利用蛋白酶制備出了抗菌肽。本文簡述了水產品及其副產品中生物活性肽的制備、分離純化、鑒定以及其功能活性，為進一步研究水產品中的生物活性肽提供一定的理論基礎。

1 水產品中生物活性肽的制備

水產品中生物活性肽的制備一般是通過蛋白質降解的方法，其主要包括化學法水解和酶水解。

1.1 化學法水解

化學法水解是一種較為傳統(tǒng)的水解蛋白質的方法，主要有酸水解法和堿水解法。其原理就是通過一定的酸或堿與蛋白質的肽鍵發(fā)生反應，從而制備出一些具有活性的多肽。雖然化學法水解的成本低、操作簡單，但反應條件劇烈，容易造成環(huán)境污染，且會破壞氨基酸而不利于多肽活性的維持[8]。酸水解快速且徹底，會形成大量游離氨基酸和少量小肽，主要用于生產調味品。堿水解時，易與精氨酸、絲氨酸等氨基酸發(fā)生作用，從而導致營養(yǎng)成分流失[9]。

1.2 酶水解法

酶水解法就是利用胰酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶等蛋白水解酶從魚肉蛋白中得到相應的多肽，目前采用的酶解法一般有單酶水解法和兩種及以上蛋白酶的復合酶解法。張崟等[10]對采用酶解技術從畜禽及水產品加工副產物中制備肽進行了綜述。但酶水解法與蛋白酶的選擇、水解時間以及溫度有關，不同的條件會對水解的程度造成不同的影響，從而影響生成肽的類型[11]。表1為不同蛋白酶在水產品中適宜的反應條件，但是目前還沒有已知的產生特定生物活性肽的特定酶[12]。與化學水解法相比，酶解法更加方便快捷、環(huán)保無污染、高效安全，隨著我國對環(huán)保問題的重視，酶解法也必將得到廣泛的應用[13]。

表1 不同蛋白酶在水產品中適宜的反應條件表

2 水產品中生物活性肽的分離純化

水產品中通過蛋白質降解法提取出來的多肽量少且雜質較多。而通過分離純化后，提取出來的多肽具有較高的生物活性與純度。目前水產品中生物活性肽的提取方法主要有超濾、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜和反相高效液相色譜技術[14]。

2.1 超濾技術

超濾技術是納米級薄膜分離技術，以薄膜兩側的壓力差為驅動力，使溶液通過濾膜孔徑時能夠達到分離、提純、濃縮的目的。超濾法操作簡單，目前已廣泛應用于水產品中肽的研究，如陳思謹[15]通過使用超濾技術從紅鼓魚魚鱗酶解液中分離得到了純度達95%的紅鼓魚魚鱗中Ⅰ型膠原蛋白。超濾技術是一種高新技術，具有高效、低能耗、效果穩(wěn)定以及無污染的優(yōu)點，但是這種技術只適用于初步分離肽，而不能分離得到具體的某一種肽[16]。

2.2 凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法也就是分子排阻色譜法。其主要原理是利用凝膠作用將分離物質按照不同的分子大小進行分離，從而達到分離純化的目的。該方法所使用的凝膠是一種惰性載體，不帶電荷，分離效果好。且該方法在分離過程中不需要有機溶劑，所以產物不易變性。但該方法一般需要結合其他分離純化方法一起使用，才能得到更高活性、更高純度的多肽[17]。凝膠層析主要應用于蛋白質相對分子量的測定及其分離純化，也逐漸應用于水產及其副產物的蛋白酶解分離[18]。陳宏[19]將樣品上樣于超純水平衡好的Sephadex G-15凝膠柱（1.5 cm×100 cm），測定出了牡蠣樣品中各組分中多肽的濃度以及各組分對DPP-IV的IC50值。

2.3 離子交換色譜法

離子交換色譜法是指利用固定相中的帶電基團與蛋白質、多肽分子帶電基團不同，在一定酸堿條件下，不同帶電基團與固定相和流動相的結合力不同，使得固定相上帶電物質與流動相中的離子發(fā)生交換[20]。目前離子交換色譜在水產品及其副產品中運用也較廣泛，例如BARBARA等[21]用離子交換色譜法分析鱈魚片中添加的磷酸鹽，結果發(fā)現IMP和ADP分別影響三偏磷酸鹽和二磷酸鹽的定量。

2.4 反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜是目前水產品分離純化多肽較常用的方法，是將極性流動相與非極性固定相組成一種液相色譜體系。主要原理是利用流動相極性的變化，非極性的固定相與非極性的多肽分子的結合效果減弱，使得溶質分子脫離純化[22]。例如，HU等[23]在Zorbax SB-C18柱上使用反相高效液相色譜進一步純化凝膠過濾色譜分離后抗氧化活性最高的成分，得到對DPPH自由基清除活性最高的B3成分（P＜0.05）。

3 水產品中生物活性肽的鑒定

通常采用質譜技術、電泳技術以及多種儀器聯(lián)用等技術來鑒定水產品及其副產物中分離純化后的生物活性肽。質譜法（Mass Spectrometry，MS）是通過質譜儀將多肽分解為不同質荷比的離子，再利用電場和磁場將不同質荷比的離子分開。質譜分析具有分離效果好、靈敏度高、準確度高的優(yōu)點，一般能與其他儀器聯(lián)用，如電噴霧電離質譜、液相色譜-串聯(lián)質譜和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜等。

電泳技術是根據多肽和蛋白質的相對分子質量以及等電點的不同進行鑒定的方法。電泳法操作簡單，可以快速得到多肽的大概信息，但只能了解到多肽的相對分子質量以及等電點，不能得到多肽的具體序列，因此無法應用在新生物活性肽的鑒定方面。

4 水產品中生物活性肽的功能活性

4.1 抗氧化性

在日常生活中，人的機體內會不可避免的產生自由基，這些自由基會與體內的一些生物大分子發(fā)生反應而產生氧化物。有研究表明，癌癥、衰老、糖尿病等與過量自由基的產生有關[24]?？寡趸氖且环N能夠減緩或者抑制自由基發(fā)生氧化反應的物質，尹天旸[25]從草魚酶解液中制備出了抗氧化肽（WEPH），濃度為1 mg·mL-1時，對DPPH自由基的清除率能夠達到73.52%，表現出良好的抗氧化活性。

4.2 抗菌性

抗菌肽具有抗細菌、真菌、病毒等作用，能夠促進傷口愈合，增強免疫功能。水產品及其副產物可以為人們提供豐富的生物活性肽資源，從中可以得到多種抗菌肽。王焙等[26]通過酸性蛋白酶從鰹魚暗色肉酶解液中制備了抗菌肽，并發(fā)現其對大腸桿菌具有較好的抑菌效果，抑菌率為（79.56±1.56）%?？咕囊蚓哂袠O高的抗菌活性，目前已被廣泛應用在生物醫(yī)藥以及食品領域。

4.3 降高血壓

降血壓肽的作用原理是通過抑制血管緊張素轉換酶的活性，使血管緊張素Ⅰ不能轉變?yōu)檠芫o張素Ⅱ，從而達到降血壓的目的。降血壓肽安全無副作用，目前已被廣泛應用于高血壓治療上。LIN等[27]通過復合蛋白酶水解軍曹魚皮，所得水解產物（PX-5）對ACE的IC50為0.221 mg·mL-1，其中顯示出降高血壓活性的4種肽的氨基酸序列分別為Trp-Ala-Ala、Ala-Trp-Trp、Ile-Trp-Trp和Trp-Leu。

4.4 其他功能活性

生物活性肽除了具有抗氧化性、抗菌性和降血壓的功能外，還具有其他的功能活性。例如，HARNEDY等[28]從大西洋鮭魚副產物的蛋白質水解物中提取出了具有抗糖尿病作用的肽；HOU等[29]從南極磷蝦蛋白水解物中提取出了一種可以促進人體鈣吸收的鈣螯合肽（Val-Leu-Gly-Tyr-Ile-Gln-Ile-Arg）。

5 結語

水產品包含淡水和海洋中的魚類、甲殼類、軟體類及其加工的產品，資源豐富，因此水產品中的生物活性肽具有豐富的來源和多樣性。本文簡述了水產品中生物活性肽的制備、分離純化、鑒定方法以及其功能活性，發(fā)現目前對于水產品中生物活性肽的研究還存在以下幾方面不足。①對于目前所研究出來的生物活性肽大多數只是在小鼠上進行生物活性實驗和體外實驗，但還缺乏一定的臨床應用。②大多數研究都還只是理論研究，缺乏實際應用。③研究領域不平衡，大多數研究集中在對水產品中抗氧化肽的研究，對其他方面的研究較少，如對抗疲勞肽的研究。此外，研究的水產品種類不夠豐富，還有許多水產種類還需要相關學者去研究。隨著研究的深入，相信這些問題在未來會得到解決。