程薇薇，劉建利，史 敏，畢芳芳，張 露，何仕龍，高欣怡

(1.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710125；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

寒熱藥性是中藥的基本屬性，是中醫(yī)臨床辨證用藥的基礎(chǔ)[1]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草經(jīng)集注》等歷代醫(yī)書(shū)對(duì)寒熱藥性都有記載，說(shuō)明中藥寒熱藥性的重要地位[2]。中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含的化學(xué)成分，故中藥發(fā)揮寒熱藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)也應(yīng)該是所含的化學(xué)成分。其可能是具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)和共同藥理作用的一類或多類化合物共同組成的物質(zhì)群體[3]。中藥川芎來(lái)源于植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)的干燥根莖，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效；性溫，味辛；化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、生物堿、多糖等[4]。川芎嗪，即四甲基吡嗪，是從川芎干燥根莖中提取的吡嗪類生物堿，是川芎的主要有效成分[5]。本文選擇川芎嗪(2,3,5,6-四甲基吡嗪)及其類似化學(xué)成分(2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪)對(duì)其寒熱屬性進(jìn)行評(píng)價(jià)。這4種化合物具有相同的含氮雜環(huán)母體結(jié)構(gòu)，只是取代基團(tuán)甲基的位置和數(shù)量有所區(qū)別。本文通過(guò)考察該4種化合物的寒熱屬性，研究中藥川芎的熱性物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)探索甲基吡嗪類化學(xué)成分結(jié)構(gòu)與寒熱屬性之間的構(gòu)-性關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的傳代細(xì)胞，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

μQuant酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)、CO2培養(yǎng)箱(sanyo公司)、細(xì)胞96孔培養(yǎng)板、普通倒置光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3 藥品與試劑

2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪；HyClone改良型RPMI-1640培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)；四季青無(wú)支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT，西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，純度大于99.5%，西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；PBS(磷酸緩沖液)；胰蛋白酶(西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 受試藥品溶液的制備

分別取 50 mg 的2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪，溶于 50 mL DMSO中，使質(zhì)量濃度為 10 mg/mL。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞，于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液(pH 7.0～7.5)中，在恒溫培養(yǎng)箱中 37 ℃、5%CO2及飽和濕度傳代培養(yǎng)。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，接種于96孔板，每孔 200 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng) 24 h。細(xì)胞貼壁后，換新鮮培養(yǎng)液(200 μL)。實(shí)驗(yàn)組加入不同體積的藥品溶液(10 mg/mL)，使終濃度分別為0.25、0.125、0.025、0.01(μmol/mL)。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照組和調(diào)零孔，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行孔。96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后，換新鮮培養(yǎng)液，逐孔加入新鮮配置的MTT溶液(5 g/L)20 μL 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。吸棄上清液，每孔加入 150 μL DMSO，震蕩 10 min(60次/min)后，用酶聯(lián)免疫標(biāo)定儀測(cè)定 490 nm 處光吸收值(A值)。按公式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率。

(1)

抑制率為正值表示對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有抑制作用，負(fù)值表示對(duì)細(xì)胞有促增殖作用[16]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

MTT法測(cè)得4種甲基吡嗪類化合物的4個(gè)濃度梯度處理組及對(duì)照組的吸光度值及細(xì)胞抑制率結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種甲基吡嗪類化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞體外增殖的影響

由表1可知，4種甲基吡嗪類化合物在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)MCF-7生長(zhǎng)增殖均具有促進(jìn)作用。其中，2,3-二甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪在所選濃度全程范圍內(nèi)均表現(xiàn)為促進(jìn)作用；2,3,5-三甲基吡嗪在0.01～0.125 μmol/mL 范圍內(nèi)為促進(jìn)作用，2,5-二甲基吡嗪在最低濃度時(shí)為促進(jìn)作用。

4 討論

筆者課題組已建立并驗(yàn)證的判斷方法為:如果在所選濃度范圍內(nèi)藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有促進(jìn)作用或低濃度促進(jìn)、高濃度抑制,則判定為熱性。如果在所選濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)為抑制，有可能是寒性，也有可能為熱性的高濃度表現(xiàn)；此時(shí)可將濃度范圍繼續(xù)向低濃度方向延伸，如果還表現(xiàn)為抑制則為寒性，如果表現(xiàn)為促進(jìn)則確定為熱性[6]。據(jù)此可判定，4種甲基吡嗪類化合物的寒熱屬性均為熱性。

本研究表明，首先，川芎嗪(2,3,5,6-四甲基吡嗪)作為中藥川芎的重要標(biāo)志性化學(xué)成分，是川芎發(fā)揮溫?zé)崴幮缘奈镔|(zhì)基礎(chǔ)之一。其次，4種甲基吡嗪化合物具有相同的含氮雜環(huán)母體結(jié)構(gòu)，只是取代基團(tuán)甲基的位置和數(shù)量有所區(qū)別，而它們的寒熱屬性都表現(xiàn)為熱性。因此，化合物的寒熱屬性與其結(jié)構(gòu)之間存在特定的聯(lián)系，即母體結(jié)構(gòu)、取代基團(tuán)均類似的同一類化合物其寒熱屬性相同；但對(duì)于母體結(jié)構(gòu)類似而取代基團(tuán)不同的化合物，其寒熱屬性與取代基團(tuán)之間的聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。最后，本文研究的4種甲基吡嗪類化合物的寒熱屬性均為熱性，提示中藥所含的同一類化學(xué)成分寒熱屬性是一致的，但中藥是由多種化學(xué)成分共同組成的復(fù)雜體系，其寒熱屬性應(yīng)該是多種化學(xué)成分寒熱效應(yīng)的綜合體現(xiàn)?？傊?，本文的研究結(jié)果可為中藥寒熱藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)探尋及其與所含化學(xué)成分之間的構(gòu)-性關(guān)系研究提供參考。