羌 璽，王立軍，牛建峰，宮相忠，王廣策,

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003；2.中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海洋大科學(xué)研究中心，中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，山東青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí) 驗(yàn)室，海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266237；4.南通中科海洋科學(xué)與技術(shù)研究發(fā)展中心，江蘇南通 226334）

藻膽蛋白是一種天然的帶有熒光的水溶性色素蛋白，來源于藻類，大多集中在藻膽體內(nèi)，多分布在藻類中的類囊體膜上。藻膽蛋白主要分為藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅藍(lán)蛋白四類，含有藻紅色素、藻藍(lán)色素、藻尿色素以及藻紫色素[1]。藻膽蛋白在不同種類的海藻中的含量也不同。目前藻膽蛋白價(jià)格較高，藻膽蛋白純度＞0.7 為食品級(jí)，純度＞3 為藥品級(jí)，純度＞4 為試劑級(jí)，試劑級(jí)的藻膽蛋白價(jià)格尤為昂貴。藻膽蛋白提取純化工藝較為復(fù)雜，常見凍融破碎、鹽析[2]、層析[3]，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來出現(xiàn)了多種新型提取純化方法，簡(jiǎn)化了提取方式，提高了藻膽蛋白的純度。藻膽蛋白具有獨(dú)特光學(xué)特性和生物活性，可作為天然色素染料[4]、抗氧化劑[5]、熒光探針[6]、光敏劑[7]等廣泛使用。海藻是一種生活在海洋中的孢子植物，其分布廣、品種多、產(chǎn)量大且含有豐富的多糖、蛋白、脂質(zhì)等活性物質(zhì)。隨著我國(guó)海藻養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大以及人們對(duì)海藻研究的日益深入，提高海藻的附加產(chǎn)值成為當(dāng)前主要的研究課題。本文基于海藻藻膽蛋白的最新研究進(jìn)展，對(duì)其來源、結(jié)構(gòu)組成、提取純化工藝、應(yīng)用開發(fā)等研究進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，為藻膽蛋白的開發(fā)利用及海藻資源高值化利用提供借鑒。

1 藻膽蛋白來源

藻膽蛋白主要存在于紅藻、藍(lán)藻、隱藻以及少量甲藻之中，如紫菜（Porphyra）[8]、龍須菜（Asparagus schoberioides）[9]、多管藻（Polysiphonia urceolata）[10]等海藻和螺旋藻（Spirulina platensis）[11]、葛仙米（Nostoc Sphaeroides）[12]、紫球藻（Porphyridium）[13]、微囊藻（Microcystis）等淡水藻類中，其中海藻資源豐富，是藻膽蛋白的重要來源。

藻膽蛋白在不同種屬藻類中的含量也不相同，常見藻類中的藻膽蛋白大約占干重的2%[14]。藻膽蛋白的含量還受到藻類生長(zhǎng)階段的影響，如在壇紫菜初始階段，藻膽蛋白的含量約為壇紫菜干重的4.2%，隨著藻類的生長(zhǎng)，藻膽蛋白含量逐漸提高，達(dá)到成熟期后，藻膽蛋白含量達(dá)到頂峰，隨后含量快速減少至干重的0.97%?？赡苁枪夂献饔脮r(shí)，光需要通過藻膽蛋白進(jìn)入光系統(tǒng)，因此在成熟期時(shí)光合作用最強(qiáng)，繼而藻膽蛋白含量較多，到了末期，紫菜細(xì)胞迅速老化，氮源減少，光合作用受限，導(dǎo)致藻膽蛋白數(shù)目快速下降。此外，不同地域海藻中藻膽蛋白含量也有不同，北部海域的壇紫菜藻膽蛋白含量為干重的4.2%，與南部海域壇紫菜藻膽蛋白占干重的3.84%相比，北部海域含量較高[15]。所以提取藻膽蛋白時(shí)應(yīng)選用緯度較高區(qū)域成熟期的海藻，以便提高藻膽蛋白的提取含量。另外，藻類生長(zhǎng)過程中的水體溫度、光照強(qiáng)度、pH、CO2含量、碳氮比等因素都會(huì)對(duì)藻類的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響[16-17]，導(dǎo)致藻膽蛋白含量產(chǎn)生波動(dòng)。藻膽蛋白含量在不同狀態(tài)的海藻中亦有區(qū)別，將干制條斑紫菜與烤制的條斑紫菜中的藻膽蛋白含量進(jìn)行了對(duì)比，陳科偉等[18]得出結(jié)論，干制紫菜中的藻膽蛋白含量為16.2～30.7 g/kg，而烤制紫菜中的藻膽蛋白含量則只有干制紫菜的五分之一；將新鮮海藻與噴霧干燥處理的海藻在同一條件下提取藻膽蛋白，余九九等[19]得出新鮮海藻提取到的藻膽蛋白含量為10.99%，比曬干或加工干燥的海藻中含量高出2.1%。因此尋找適宜狀態(tài)下的提取原料就尤其重要。

藻膽蛋白不僅可以從天然海藻中提取，還可以通過基因工程體內(nèi)合成或體外重組技術(shù)獲得[20]。Kim 等[21]以EMS 作為誘導(dǎo)劑，對(duì)微藻進(jìn)行突變誘導(dǎo)處理，并對(duì)突變體內(nèi)的藻膽蛋白進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)突變體內(nèi)的藻紅蛋白含量提高至原來的4.4 倍，藻藍(lán)蛋白含量提高至4.8 倍，為提高海藻中藻膽蛋白的含量提供了新方法?；蚬こ碳夹g(shù)可以把從海藻中獲得產(chǎn)藻膽蛋白的目標(biāo)基因在異源載體中表達(dá)，從而獲得具有生物學(xué)活性的藻膽蛋白[20,22]。衣俊杰等[23]以節(jié)旋藻為原料，克隆藻藍(lán)蛋白α亞基的5 個(gè)基因并附在不同載體上，重組成兩個(gè)體系Ⅰ（pACYCDu-etcpcA 及pET-hox1-pcyA）和Ⅱ（pACYCDu-et-cpcAcpcE-cpcF 及pET-hox1-pcyA），并在大腸桿菌中表達(dá)，得到的藻藍(lán)蛋白通過SDS-PAGE 和熒光分析，表明其不僅有生物活性，而且重組體系Ⅰ藻藍(lán)蛋白表達(dá)量高于重組體系Ⅱ?；蚬こ碳夹g(shù)提高了藻膽蛋白的得率，增強(qiáng)了熒光特性，且操作簡(jiǎn)單，無需傳統(tǒng)提取的繁瑣工藝，為藻膽蛋白的來源提供了新思路。

2 藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

藻膽蛋白是海藻光合作用的重要組成部分，常以藻膽體形式存在，而在隱藻中則是以異二聚體或單體形式存在。藻膽體依附在類囊體膜表面或內(nèi)腔中，呈現(xiàn)半圓形、橢球形、柱狀或雙圓筒狀[24-25]。藻膽體中分布著四種不同的藻膽素，分別是藻紅素、藻藍(lán)素、藻膽紫素和藻尿膽素。如圖1 所示，藻膽素是一類線性開鏈的四吡咯環(huán)化合物，根據(jù)藻膽蛋白硫醚鍵共價(jià)連接脫輔基載體蛋白的半胱氨酸殘基上藻膽素的不同，藻膽蛋白分成藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，PC）、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）和藻紅藍(lán)蛋白（phycoerythrocyanin，PEC）[26]。如圖2 所示，藻紅蛋白排列在整個(gè)藻膽體的最外側(cè)，形成的六個(gè)分叉結(jié)構(gòu)能增大表面積，吸收更多光，隨后將光能傳給下一級(jí)藻藍(lán)蛋白，再由藻藍(lán)蛋白傳遞給藻膽體中心的別藻藍(lán)蛋白，最后由別藻藍(lán)蛋白傳遞給光反應(yīng)中心。藻膽蛋白內(nèi)存在著兩種或三種亞基，藻膽蛋白通常以兩種（α、β）亞基組合而成的三聚體（αβ）3或者六聚體（αβ）6形式存在，如圖2a所示是藻紅蛋白的α亞基的結(jié)構(gòu)形式。藻紅蛋白除了α、β亞基之外還含有γ亞基，常以六聚體（αβ）6γ的形式存在[27]。α亞基的分子量大致為13～20 kDa，β亞基比α亞基要大，約是14～24 kDa，藻紅蛋白中的γ亞基30～34 kDa，這樣能使藻紅蛋白在藻膽體外側(cè)更加穩(wěn)定[28]。

圖1 藻膽素結(jié)構(gòu)圖[36]Fig.1 Structure of phycobilins[36]

圖2 藻膽體和部分藻膽蛋白結(jié)構(gòu)圖[37-38]Fig.2 Structure diagram of phycobilisome and part of phycobiliproteins[37-38]

藻膽蛋白是一種水溶性酸性蛋白，等電點(diǎn)較低。海生多管藻中藻紅蛋白等電點(diǎn)4.5，藻藍(lán)蛋白等電點(diǎn)5.6[29]；紅毛菜中別藻藍(lán)蛋白等電點(diǎn)4.42。由于藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白帶有不同的色素基團(tuán)，導(dǎo)致它們的光吸收峰不同，一般藻紅蛋白吸收峰在490～570 nm，藻藍(lán)蛋白吸收峰在610～625 nm，個(gè)別一些在553 nm 處產(chǎn)生吸收峰，別藻藍(lán)蛋白構(gòu)造與藻藍(lán)蛋白類似，兩者吸收峰接近，別藻藍(lán)蛋白吸收峰大致在650～660 nm[30-31]。藻膽蛋白穩(wěn)定性較差，環(huán)境溫度、溶液pH、光照強(qiáng)度、離子強(qiáng)度等環(huán)境因素，都會(huì)對(duì)藻膽蛋白的穩(wěn)定性和熒光特性產(chǎn)生影響[32]，一般藻膽蛋白環(huán)境溫度不超過65 ℃，高溫會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致變性失活。另外，高濃度的金屬離子、有機(jī)溶劑也會(huì)使藻膽蛋白氫鍵、次級(jí)鍵被破壞，從而失活沉淀?？梢酝ㄟ^篩選耐熱菌株生產(chǎn)藻膽蛋白[33]、添加葡萄糖等穩(wěn)定劑[34]、制成微膠囊[35]等方法，提高藻膽蛋白的穩(wěn)定性。

3 藻膽蛋白的提取純化方法

3.1 藻膽蛋白的提取

3.1.1 化學(xué)破壁法 化學(xué)破壁法借助化學(xué)試劑將細(xì)胞壁、細(xì)胞膜中的磷脂層溶解，增加細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，使得胞內(nèi)物質(zhì)溶出。常見的化學(xué)試劑有酸、堿、有機(jī)溶劑[39]、表面活性劑[40]等。許河山等[41]以江蘺泡堿液為原料，分離純化藻膽蛋白，利用膜過濾去除雜質(zhì)，得到0.5%～2.0%藻膽蛋白提取液，使得瓊脂生產(chǎn)中的泡堿液得到二次利用。此方法雖然提取速度快、效率高，但是化學(xué)試劑會(huì)影響藻膽蛋白活性，對(duì)后續(xù)純化工藝有一定影響，不利于獲得高純度的藻膽蛋白。

3.1.2 物理破壁法 物理破壁法是利用物理作用來破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破碎，胞內(nèi)物質(zhì)溶解到提取液中。常見的物理破碎法有反復(fù)凍融法[42]、滲透壓法[43]、高壓破碎法、研磨法[44]、粉碎破壁法[45]等。反復(fù)凍融使細(xì)胞液形成冰晶組織，細(xì)胞液濃度減少，細(xì)胞內(nèi)滲透壓增大，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，藻膽蛋白從胞內(nèi)溶出，此方法操作簡(jiǎn)單，能運(yùn)用到工業(yè)化生產(chǎn)中，但具有耗時(shí)長(zhǎng)、效率低等缺點(diǎn)。與反復(fù)凍融法相比，溶脹法耗時(shí)較短，提取率略高，王翠芹等[46]比較了不同破碎方法對(duì)壇紫菜中藻紅蛋白提取量的影響，用0.01 mol/L Tris-HCl 作溶脹劑提取9 h，得到藻紅蛋白含量為9.71 mg/g，純度0.45，純度高于化學(xué)試劑處理法和攪切法。Soni 等[47]在藻體研磨粉碎時(shí)加入液氮，隨后用Tris-HCl 緩沖液進(jìn)行提取，得到了純度為4.52 的藻藍(lán)蛋白。液氮可以降低周圍的溫度，避免研磨時(shí)摩擦產(chǎn)生的溫度導(dǎo)致藻膽蛋白變性失活，且低溫能使細(xì)胞膜脆性增加，有助于細(xì)胞壁破碎。液氮法操作簡(jiǎn)便、成本低廉，適合實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備，但工業(yè)化生產(chǎn)中，液氮使用量高，增加成本。物理破壁法作用條件溫和，但耗時(shí)較長(zhǎng)。在實(shí)際生產(chǎn)中需進(jìn)一步優(yōu)化提取時(shí)間、溫度、次數(shù)等參數(shù)。此方法還可與其他方法混用，提高藻膽蛋白提取量。

3.1.3 生物破壁法 酶法是利用細(xì)胞自身的酶系或者添加的酶制劑，將細(xì)胞壁、細(xì)胞膜通過酶催化作用進(jìn)行消化溶解，提取藻膽蛋白。常見的酶有瓊脂酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶[48]。張文怡[49]用纖維素酶、果膠酶復(fù)合酶制劑，以藻紅蛋白的提取量為比較值，得出當(dāng)纖維素酶和果膠酶的配比為7:3 時(shí)，從紅毛菜中提取的藻紅蛋白達(dá)到了13.07 mg/g，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)凍融法的7.83 mg/g。相比于傳統(tǒng)的提取方法，酶法簡(jiǎn)單快捷，作用條件溫和，酶解效率高，提取的藻膽蛋白生物活性高。隨著優(yōu)化不同酶的配比、酶反應(yīng)時(shí)間等相關(guān)參數(shù)，酶法會(huì)進(jìn)一步提高藻膽蛋白提取量，這一方法具有廣泛的應(yīng)用前景。

3.1.4 輔助破碎法 單一的破壁方法很難對(duì)藻膽蛋白進(jìn)行高質(zhì)量的提取，往往采用復(fù)合的方法來提高藻膽蛋白得率。輔助破碎法是利用超聲、微波方法配合物理、生物破壁法對(duì)藻膽蛋白提取。超聲輔助破碎法是利用聲能在液體中傳導(dǎo)使細(xì)胞壁受到?jīng)_擊破裂，更高效快速的獲得粗提液。Kong 等[50]對(duì)超聲時(shí)間、功率、pH、料液比等進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，酶解與超聲共同提取壇紫菜中的藻紅蛋白，得出pH5，料液比1:40，超聲時(shí)間40 min，功率450 W 條件下，藻紅蛋白得率最高1.808%，純度0.46。雖然超聲時(shí)易產(chǎn)生熱量，對(duì)藻膽蛋白的活性產(chǎn)生一部分影響，但可用冰浴或液氮保持低溫避免藻膽蛋白高溫失活。由于超聲設(shè)備容量有限，只適宜實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備，不適用于工業(yè)大規(guī)模提取。微波輔助破碎法是微波與細(xì)胞內(nèi)極性分子耦合，形成定向加熱，細(xì)胞壁失水收縮，得以破壞。朱曉君[51]對(duì)比了條斑紫菜在微波輔助前后藻紅蛋白的提取率，加入微波輔助后，藻紅蛋白比之前提取率提高了6.4%，純度達(dá)到0.225。微波穿透力強(qiáng)，反應(yīng)物混合均勻，簡(jiǎn)單快速、高效易得，但藻膽蛋白容易受溫度影響，在40 ℃以下時(shí)，藻紅蛋白吸收峰均正常，隨著溫度上升至52 ℃時(shí)，因蛋白質(zhì)受熱變性，進(jìn)而藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，藻膽蛋白變性失活，導(dǎo)致吸收峰發(fā)生偏移[52]。目前微波輔助法由于難以保持低溫環(huán)境，易使藻膽蛋白變性失活，使用較少，不過此方法為大規(guī)模開發(fā)提取藻膽蛋白提供了新方法和新思路。

3.1.5 多針板電暈放電提取法 多針板電暈放電技術(shù)是一種全新的提取藻膽蛋白的方法，該裝置利用反應(yīng)罐口的針電極和罐底電極板放射出負(fù)離子和正離子，通過調(diào)節(jié)電機(jī)的快慢，控制釋放能量的強(qiáng)度，使得細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂，藻膽蛋白溶出，且圍繞反應(yīng)罐的外周還設(shè)有螺旋形的冷凝管，以降低提取溫度，防止藻膽蛋白因高溫變性失活[53]。電場(chǎng)強(qiáng)度和電場(chǎng)中處理時(shí)間將影響膽蛋白提取量，Martínez 等[54]將紫球藻在放置在2～10 kV/cm 不同強(qiáng)度的電場(chǎng)下，處理150 μs，藻紅蛋白得率從5.1 mg/g 提高至25.4 mg/g。這一全新的方法目前仍在實(shí)驗(yàn)室操作階段，還需對(duì)電機(jī)快慢、放射離子數(shù)目、處理時(shí)間等參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，以便達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的需求。

3.2 藻膽蛋白的分離純化

由于細(xì)胞被破碎，制備得到的藻膽蛋白粗提液中還含有很多細(xì)胞內(nèi)容物以及其他雜蛋白，藻膽蛋白的利用價(jià)值隨著純度的增加而提高，所以要得到一定純度的藻膽蛋白，就要進(jìn)行藻膽蛋白的分離和純化。藻膽蛋白分離純化方法主要分成傳統(tǒng)型和新型方法兩大類。表1 總結(jié)了最新的藻膽蛋白提取純化方法。

表1 藻膽蛋白分離純化方法Table 1 Extraction and purification methods of phycobiliproteins

3.2.1 傳統(tǒng)分離純化方法 傳統(tǒng)分離純化的方法是根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、分子量來進(jìn)行分離。例如鹽析法[55]、超濾法[56]、層析法[57]、等電點(diǎn)沉淀法[9]、層析法等。鹽析法是在粗提液中加入大量的強(qiáng)電解質(zhì)，利用大分子物質(zhì)溶解度降低而析出，從而進(jìn)行分離的方法。藻膽蛋白常用硫酸銨鹽析。層析法原理是不同蛋白質(zhì)性質(zhì)不同，通過柱子的時(shí)間有所差異，分離不同的蛋白質(zhì)。根據(jù)層析柱內(nèi)的填料不同，分為羥基磷灰石柱、疏水層析柱、陰離子交換柱等。郭凝[58]將粗提后多管藻提取液經(jīng)過葡聚糖凝膠和DEAE 離子交換層析純化，相比于鹽析法純度低，層析法使藻膽蛋白純度超過4，大幅提高藻膽蛋白純度。層析柱純化效果明顯，低溫環(huán)境有利于藻膽蛋白保持生物活性，但層析柱參數(shù)優(yōu)化目前多集中于小規(guī)模提取，尚未有中試及大規(guī)模提取的參數(shù)優(yōu)化，有待于進(jìn)一步開發(fā)研究。與前兩種方法不同，等電點(diǎn)沉淀法根據(jù)不同蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同且蛋白質(zhì)位于等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的性質(zhì)來分離。用稀鹽酸作為等電點(diǎn)沉淀介質(zhì)，馬瑩等[59]得出在pH4.25 的條件下，低溫沉淀藻膽蛋白，干燥后粗蛋白的含量高達(dá)35.9 mg/g，等電點(diǎn)沉淀其操作與前兩種相比較為便捷，一次提取量大，稀鹽酸易揮發(fā)，適宜工廠化生產(chǎn)。綜上所述，傳統(tǒng)分離純化方法具有純化成本低、工藝簡(jiǎn)單及保持生物活性等優(yōu)勢(shì)，但提取效率低的缺點(diǎn)也十分明顯，需要進(jìn)一步優(yōu)化傳統(tǒng)方法工藝參數(shù)或者探索出新的分離純化的方法。

3.2.2 新型分離純化方法

3.2.2.1 膨化柱法 本課題組發(fā)明了膨化柱方法，利用疏水層析與膨化床結(jié)合的方式，分別從多管藻、壇紫菜中提取藻紅蛋白，上樣后，用硫酸銨從上至下洗脫，通過優(yōu)化進(jìn)樣速度、洗脫劑濃度工藝，分別獲得了純度為3.9 和5.29 的藻紅蛋白[26]。隨后又以細(xì)基江蘺為原料，得出藻紅蛋白提取率達(dá)到13.83%，純度超過4，且對(duì)后續(xù)瓊脂開發(fā)無影響[60]。膨化柱法改變了傳統(tǒng)層析柱由上方進(jìn)樣的順序，將粗提液通過蠕動(dòng)泵從層析柱下方進(jìn)樣，避免了傳統(tǒng)上方進(jìn)樣時(shí)粗提液中的粘性多糖堵塞層析柱，影響分離效果。膨化柱法雖然只改變了進(jìn)樣順序，但提高藻膽蛋白純度和回收率，減少層析時(shí)間與成本，但對(duì)膨化柱洗脫時(shí)間、洗脫pH 等因素仍需要進(jìn)一步的完善優(yōu)化。

3.2.2.2 利凡諾沉淀法 利凡諾能夠與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成復(fù)合物，用硫酸銨沉淀后其會(huì)與其他的雜質(zhì)分離，再用凝膠過濾的方式去除。這一方法步驟簡(jiǎn)單，適宜大規(guī)模分離純化，且純度高于用硫酸銨沉淀的純度，無需后續(xù)純化操作。但此方法需要增加去除利凡諾的步驟，增加了時(shí)間和成本，純化效率較低。在分離純化過程中不同配比的利凡諾、pH、離子強(qiáng)度等因素會(huì)影響藻膽蛋白純化效果，仍需要后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化。目前對(duì)于利凡諾去除問題，水楊酸可在去除利凡諾時(shí)減少對(duì)藻膽蛋白的影響，這也為快速高效去除利凡諾提供了新方法[61]。

3.2.2.3 雙水相萃取法 雙水相萃取的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)在兩相之間的靜電、疏水等作用進(jìn)行選擇性分配。常見的雙體系為聚乙二醇（PEG）和葡聚糖或者聚乙二醇和鹽體系。Nascimento 等[62]比較了聚乙二醇與磷酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉不同比例體系的萃取效果，發(fā)現(xiàn)13%PEG 與14%磷酸鉀體系純化效果較好，且連續(xù)萃取比間歇萃取效果好。Rochak 等[63]利用PEG1450-磷酸鉀體系，連續(xù)萃取，與PEG3350-磷酸鉀體系相比，前者萃取后的純化效果較好，純度提高了11 倍，得率達(dá)到了57%。雙水相萃取法可在低溫環(huán)境下操作，有助于保持藻膽蛋白的活性，安全環(huán)保。還可與層析法相結(jié)合，獲得更高純度的藻膽蛋白。不同比例體系的靜電引力和疏水力不同，純化效果也有所差異，根據(jù)目標(biāo)蛋白選擇合適的分離體系是這一方法要考慮的首要問題。

4 藻膽蛋白的開發(fā)與應(yīng)用

藻膽蛋白顏色鮮艷，安全無毒，可作為天然著色劑用于食品、化工等領(lǐng)域，藻膽蛋白具有抗氧化、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力的功效以及獨(dú)特的熒光特性，可作為抗氧化劑、熒光標(biāo)記試劑、腫瘤抑制劑、光敏劑用于醫(yī)藥保健、生物檢測(cè)、光動(dòng)力治療等領(lǐng)域。隨著對(duì)藻膽蛋白的深入研究，進(jìn)一步拓展了藻膽蛋白的應(yīng)用。

4.1 天然著色劑

當(dāng)今人們?cè)絹碓阶非筇烊?、綠色健康的理念，藻膽蛋白作為一種純天然的色素添加劑，是食品、化妝品等優(yōu)選的天然色素物質(zhì)。藻紅蛋白具有鮮艷的紅色，藻藍(lán)蛋白是藍(lán)色，別藻藍(lán)蛋白是孔雀藍(lán)，可以將這幾種蛋白按不同的比例進(jìn)行混合，從而調(diào)制出更多不同的顏色，以用于不同的物質(zhì)。法國(guó)已推出B-BLUE的藻藍(lán)蛋白功能性飲料，推動(dòng)了藻藍(lán)蛋白發(fā)展。藻藍(lán)蛋白加入到冰淇淋中，182 d 內(nèi)可保持顏色穩(wěn)定，提高了產(chǎn)品抗氧化能力，改善了冰淇淋的風(fēng)味和品質(zhì)[68]。將藻藍(lán)蛋白添加到酸奶中不僅顏色吸引消費(fèi)者，而且可以提高酸奶粘度，增加其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)保質(zhì)期，具有不同于普通酸奶獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[69]。藻膽蛋白還可用于硬糖、餅干、松蛋糕、乳制品、罐頭、飲料、布丁等食品的著色，一般使用量為0.1～0.8 g/kg[70]。食品級(jí)藻紅蛋白的開發(fā)程度較藻藍(lán)蛋白低，但藻紅蛋白的紅色較藍(lán)色相比更易被消費(fèi)者接受，未來可研發(fā)以藻紅蛋白為添加劑的飲料、糕點(diǎn)、糖果等產(chǎn)品。隨著3D 打印技術(shù)在食品領(lǐng)域的發(fā)展，未來可將不同顏色的藻膽蛋白與3D 食品打印相結(jié)合，進(jìn)行個(gè)性化定制食品加工。隨著藻膽蛋白提取純化工藝的進(jìn)一步改進(jìn)完善，食品級(jí)藻膽蛋白價(jià)格會(huì)下降，藻膽蛋白這一天然色素運(yùn)用范圍將更加廣泛。

4.2 腫瘤抑制劑

體外實(shí)驗(yàn)表明，藻膽蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。褚靜等[71]研究不同濃度的藻藍(lán)蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，得出藻藍(lán)蛋白可以抑制乳腺癌MDA-MB-468 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移速度和表達(dá)，且激活p38 MAPK 和JNK 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。此外藻膽蛋白對(duì)肺癌、喉癌、肝癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞均有很好的抑制效果。在將藻膽蛋白應(yīng)用于腫瘤治療中時(shí)，可將其光敏特性與其他腫瘤治療方法結(jié)合，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，減少病人副反應(yīng)。

4.3 消炎劑

藻膽蛋白與一些非甾體抗炎的藥物成分具有相似的結(jié)構(gòu)，具有消炎的活性，與化學(xué)合成消炎藥物相比，藻膽蛋白可減少過敏反應(yīng)，安全性高。Li 等[72]對(duì)肺部纖維化的小鼠灌喂藻藍(lán)蛋白，發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白降低了造成炎癥的細(xì)菌數(shù)，減輕了輻射造成的肺部炎癥和肺部纖維化，恢復(fù)了肺部及腸道正常微生物菌群。這一發(fā)現(xiàn)為藻膽蛋白的消炎活性提供了實(shí)驗(yàn)論證。

4.4 抗氧化劑

現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明藻膽蛋白具有很好的抗氧化活性，Grover 等[73]小鼠實(shí)驗(yàn)表明藻藍(lán)蛋白能有效清除OH-和RO-自由基，當(dāng)藻膽蛋白含量達(dá)到500 mg/kg時(shí)，有顯著抗氧化、提高免疫的功能，且不會(huì)產(chǎn)生毒性。藻藍(lán)蛋白還能抑制肝臟微粒脂過氧化物生成，增加體內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的表達(dá)，減少肝臟損傷[74]。李文軍等[75]以藻紅蛋白、松花粉為主要材料，以壓片糖果的形式對(duì)小鼠進(jìn)行灌喂，結(jié)果得出該壓片糖果能提高小鼠淋巴細(xì)胞的活性，清除體內(nèi)自由基，產(chǎn)生抗氧化、緩解疲勞等作用。哈爾濱捷康生物利用藻膽蛋白的抗氧化活性研制出了美容面膜，該面膜具有延緩面部皮膚衰老等功效，為藻膽蛋白在醫(yī)用保健方向的開發(fā)利用提供了一定的新思路。

4.5 光敏劑

光動(dòng)力治療是一種新興治療腫瘤的技術(shù)，具有治療效果好、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢(shì)。光動(dòng)力治療利用激光照射光敏劑，光敏劑從基態(tài)上升至激發(fā)態(tài)產(chǎn)生能量和活性氧物質(zhì)組分，特定殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療疾病的目的。傳統(tǒng)光敏劑血卟啉紫外吸收較強(qiáng)，人體代謝緩慢，副作用較大。李冠武等[76]發(fā)現(xiàn)藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白光敏毒性都比血卟啉要低，特別是別藻藍(lán)蛋白是理想的光敏劑材料。Silva 等[77]證實(shí)藻藍(lán)蛋白可以特異性抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。藻膽蛋白作為光敏劑，不僅可以用于光動(dòng)力治療腫瘤、痤瘡等疾病，還可作為一些害蟲的捕殺劑和抑菌劑。只需4000 μg/mL 的藻膽蛋白，果蠅的死亡率達(dá)到93.3%，但傳統(tǒng)血卟啉甲醚在相同條件下果蠅死亡率只有66.66%。利用藻膽蛋白光敏殺蟲，既降低使用量，也減少對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響，環(huán)保高效。吳亞琴等[78]利用紅毛菜中的藻紅蛋白，發(fā)明出一款抗菌防霉型可食用膜，該膜可產(chǎn)生超氧自由基，殺死膜表面的細(xì)菌，保持膜內(nèi)食物的風(fēng)味。但目前藥品級(jí)、試劑級(jí)藻膽蛋白的售價(jià)較高，高成本限制了藻膽蛋白在光敏劑方面的運(yùn)用，降低試劑級(jí)藻膽蛋白純化成本，對(duì)藻膽蛋白的應(yīng)用開發(fā)具有推動(dòng)作用。

4.6 熒光檢測(cè)劑

藻膽蛋白上不同的藻膽色素，通過特定波長(zhǎng)光照射，能夠產(chǎn)生熒光。藻膽蛋白產(chǎn)生的熒光大多為橙色或紅色，與檢測(cè)的背景形成鮮明的顏色對(duì)比，更容易觀察到檢測(cè)結(jié)果。藻膽蛋白熒光探針可與不同金屬離子結(jié)合，用于金屬離子的檢測(cè)[79]。Wang 等[80]用條斑紫菜提取的藻紅蛋白作熒光探針，檢測(cè)不同水環(huán)境下的Hg2+含量，發(fā)現(xiàn)峰值與含量呈現(xiàn)線性關(guān)系，靈敏度高達(dá)0.0130 μmol/L，且穩(wěn)定性好，相對(duì)偏差1.6%。藻膽蛋白熒光探針不僅能檢測(cè)離子，還可通過交聯(lián)劑與待檢測(cè)抗原/抗體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞、組織、血清中的抗體/抗原檢測(cè)。吳昌義[81]將海洋紅藻的藻紅蛋白用于雞法氏囊病毒檢測(cè)中，提高檢測(cè)靈敏度；鄭允權(quán)等[82]用藻藍(lán)蛋白熒光探針來檢測(cè)黃曲霉素，實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)。與傳統(tǒng)探針相比，藻膽蛋白熒光強(qiáng)度大、Stoke 位移大、靈敏度高、無毒副作用、安全高效[83]，但藻膽蛋白分子量大及易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)仍需解決，可研究特定剪切的藻膽蛋白肽段來降低藻膽蛋白空間位阻，使藻膽蛋白更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

5 結(jié)論

海藻在我國(guó)的養(yǎng)殖規(guī)模大、產(chǎn)量高，但對(duì)其的應(yīng)用目前多集中在海藻食用、干制等初加工，其產(chǎn)品價(jià)值較低，較少存在精加工和對(duì)海藻天然產(chǎn)物的開發(fā)利用；且目前養(yǎng)殖末水海藻浪費(fèi)嚴(yán)重，被大量遺棄在養(yǎng)殖區(qū)域；因此可選取養(yǎng)殖末水海藻作原料提取藻膽蛋白，既能夠合理利用資源，又提高了經(jīng)濟(jì)價(jià)值。作為海藻中一類重要的活性物質(zhì)-藻膽蛋白其傳統(tǒng)提取方式耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，新型方法技術(shù)尚未成熟，未來探索簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效的工業(yè)規(guī)模化制備方法，降低藻膽蛋白價(jià)格，有助于藻膽蛋白的開發(fā)利用。隨著人們對(duì)藻膽蛋白生物活性研究的進(jìn)一步深入，未來可探索以藻膽蛋白為添加劑的功能飲品、肉制品、功能乳品的規(guī)?；a(chǎn)以及與3D 打印技術(shù)結(jié)合，個(gè)性化制備功能食品，增加市售產(chǎn)品種類，進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用范圍。已有研究證實(shí)藻膽蛋白具有抗氧化、清除自由基、消炎等活性，利用特定的酶切可在保留活性的同時(shí)減少分子量，可作為功能因子添加到保健食品中，增強(qiáng)人體吸收，達(dá)到保健的效果。藻膽蛋白熒光特性使其在熒光檢測(cè)方面具有發(fā)展?jié)摿?，未來可與不同抗體偶聯(lián)，制備成快速方便的試劑盒，以檢測(cè)不同的抗原物質(zhì)。藻膽蛋白還是理想光敏劑材料，應(yīng)加強(qiáng)在腫瘤治療中的研究，以用于臨床治療。但是藻膽蛋白的不穩(wěn)定性限制了當(dāng)下的發(fā)展，或許可與水凝膠包埋、納米材料等現(xiàn)代材料技術(shù)結(jié)合，提高藻膽蛋白的光、熱穩(wěn)定性。

綜上所述，藻膽蛋白具有非常重要的利用價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景，開發(fā)藻膽蛋白可以提高海藻的商業(yè)價(jià)值和利用率，對(duì)海洋生物資源開發(fā)和利用具有重要意義。