歐陽(yáng)樂(lè)飛，王林華，段健誠(chéng)，張慶起,高 煥,閻斌倫

(1.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222005；3.連云港贛榆佳信水產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限公司，連云港 222100；4.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，南京 210014)

藻類(lèi)與藻際微生物的相互關(guān)系復(fù)雜，二者相互利用或相互拮抗，通過(guò)相互作用進(jìn)行選擇[1]。藻類(lèi)在生長(zhǎng)過(guò)程中向外釋放有機(jī)物吸引微生物共附生，使藻體周?chē)纬删哂歇?dú)特結(jié)構(gòu)與功能的微生物群落，這種獨(dú)特的微環(huán)境稱(chēng)為“藻際微環(huán)境”(phccosphere)[2]。藻類(lèi)不斷向周?chē)h(huán)境釋放氨基酸與其他代謝產(chǎn)物，為共生、附生的藻際微生物提供營(yíng)養(yǎng)[3]。藻體表面適合微生物共附生，能夠?yàn)槲⑸锾峁┻m宜的蔽護(hù)[4]，并利用微環(huán)境特性篩選藻際微生物，微生物既是生產(chǎn)者，也是分解者，主要通過(guò)代謝參與藻際微環(huán)境中物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，通過(guò)分泌大量有機(jī)物，影響藻類(lèi)的生長(zhǎng)[5]。

條斑紫菜(Pyropiayezoensis)是我國(guó)北方地區(qū)產(chǎn)量最高的紫菜栽培種，具有較高的藥用、營(yíng)養(yǎng)及生態(tài)價(jià)值。近年來(lái)，紫菜養(yǎng)殖海區(qū)環(huán)境惡化，病害頻發(fā)，且紫菜病害過(guò)程復(fù)雜，在紫菜絲狀體時(shí)，河豚毒素假交替單胞菌(Pseudoalteromonastetraodonis)易引發(fā)黃斑病[6]，莖點(diǎn)菌(Phomaporphyrae)導(dǎo)致白斑病[7]；由紫菜腐霉導(dǎo)致赤腐病[8]等。此外，紫菜致病因素還與紫菜本身健康狀況和自然環(huán)境條件相關(guān)。光照太弱，通風(fēng)不良會(huì)導(dǎo)致紫菜絲狀體泥紅病[9]；光照太強(qiáng)會(huì)引起紫菜葉狀體綠斑病[10]；缺乏氮引起絲狀體綠斑病[11]，這表明環(huán)境變化會(huì)改變微生物的功能與組成，進(jìn)而影響藻類(lèi)生長(zhǎng)與生理狀態(tài)[12]。芽孢桿菌具有產(chǎn)芽孢、快速繁殖、高耐受性等特點(diǎn)，能夠增強(qiáng)藻類(lèi)生長(zhǎng)、改善水體微生態(tài)環(huán)境，被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的抗生素替代品之一[13]。因此，藻際微環(huán)境與藻類(lèi)之間的生態(tài)關(guān)系成為近年研究焦點(diǎn)，但是關(guān)于藻際附生菌與紫菜間的相互影響機(jī)制研究鮮有報(bào)道。通過(guò)研究藻際附生菌——芽孢桿菌(Bacillussp.LPyS1)對(duì)條斑紫菜生長(zhǎng)及生理的影響，以期為條斑紫菜健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 條斑紫菜葉狀體

條斑紫菜葉狀體采集于連云港市連云區(qū)西墅條斑紫菜養(yǎng)殖海區(qū)，洗凈陰干后，密封保存于-20℃冰箱。實(shí)驗(yàn)前取出樣品，在滅菌海水中復(fù)蘇1 d，挑選形狀一致的紅褐色葉片，裁成1 cm2小塊，用滅菌海水清洗3次以上、于0.7% 碘化鉀(KI)溶液浸泡10 min后，再用滅菌海水清洗干凈。條斑紫菜復(fù)蘇培養(yǎng)后，對(duì)葉片進(jìn)行無(wú)菌處理，處理方法參考文獻(xiàn)[14]。將葉片浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氨芐青霉素溶液中10 min，后轉(zhuǎn)移至組合抗生素(300 μg/mL氨芐青霉素、100 μg/mL卡那霉素、100 μg/mL慶大霉素)中處理10 h以上，經(jīng)滅菌海水漂洗3次后放入紫菜培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)母液：100 g/L KNO3、10 g/L KH2PO4、2.5 g/L FeSO4、0.25 g/L MnSO4和20 g/L EDTA-Na2，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，使用時(shí)與滅菌海水以1∶1 000配制成營(yíng)養(yǎng)海水)。培養(yǎng)2 d備用，培養(yǎng)條件：溫度12 ℃，鹽度30，光強(qiáng)3 500 lx，光周期12 L∶12 D，每24 h更換1次培養(yǎng)基，在充氣條件下培養(yǎng)。

1.1.2 芽孢桿菌

Bacillussp.LPyS1由本實(shí)驗(yàn)室分離自條斑紫菜葉狀體表面，加甘油后于-80 ℃凍存。37 ℃ 140 r/min培養(yǎng)24 h活化(Zobell 2216E海水培養(yǎng)基：酵母粉1 g，蛋白胨5 g，檸檬酸鐵0.1 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.6～8.0)。擴(kuò)大培養(yǎng)與活化培養(yǎng)條件一致，24 h后離心去除培養(yǎng)液。沉淀清洗離心后，用條斑紫菜培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度約1×106cells/mL備用。并對(duì)芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1最適生長(zhǎng)溫度進(jìn)行測(cè)定：在試管中加入10 mL Zobell 2216E海水培養(yǎng)基，滅菌冷卻后將芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1按1%接種量接種于液體培養(yǎng)基試管中，分別置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃這7個(gè)溫度梯度下，160 r/min搖床培養(yǎng)24 h，以不接種Zobell 2216E海水培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，測(cè)定OD600，以確定其生長(zhǎng)的最適溫度。

1.2 方法

向300 mL紫菜培養(yǎng)基中接種0.2 g無(wú)菌處理過(guò)的條斑紫菜葉狀體與3×106cells/mLBacillussp.LPyS1，在溫度12 ℃，鹽度30，光強(qiáng)3 500 lx，光周期12 L∶12 D,充氣條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的0、6、12、24、48和72 h取樣，測(cè)定其相對(duì)生長(zhǎng)率(RGR)、總蛋白(Total protein)、葉綠素a(Chla)、藻膽蛋白(RPE、RPC、APC)、游離脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)的含量，以及超氧化物岐化酶活性(SOD)與過(guò)氧化物酶(POD)活性。以經(jīng)無(wú)菌處理的條斑紫菜葉狀體培養(yǎng)作為對(duì)照，培養(yǎng)條件與共培養(yǎng)組相同，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

按照公式計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)率(RGR)[15]：RGR(%/d)=(lnMt-lnM0)/t×100，式中，M0為藻體的初始質(zhì)量，g；Mt為培養(yǎng)至第t天藻體的鮮重，g，稱(chēng)量前將藻體表面培養(yǎng)液吸干。酶活測(cè)定采用南京建成生物科技公司T-SOD試劑盒(A001-1，羥胺法)和POD測(cè)定試劑盒(A084-3，比色法)；采用南京建成生物科技公司試劑盒(A003-3-1，微板法)測(cè)定MDA含量；采用考馬斯亮藍(lán)法[16]測(cè)定可溶性蛋白含量；采用南京建成生物科技公司試劑盒(A107-1-1，酸性茚三酮法)測(cè)定Pro含量；參考陳新美等[17]的方法測(cè)定藻膽蛋白含量。實(shí)驗(yàn)中對(duì)每個(gè)樣本均進(jìn)行4次重復(fù)測(cè)定分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2018和SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05表示顯著性差異，P<0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定

由圖1可知，芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1隨著培養(yǎng)溫度的逐步升高OD600也逐步升高，培養(yǎng)溫度到35 ℃時(shí)OD600最大。在10 ℃～35 ℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的增加OD600呈上升趨勢(shì)，在35 ℃～40 ℃時(shí)OD600呈迅速下降的趨勢(shì)。芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1的最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃。

圖1 不同溫度對(duì)芽孢桿菌Bacillus sp.LPyS1的影響Figure 1 Effects of different temperatures on Bacillus sp.LPyS1

2.2 芽孢桿菌對(duì)條斑紫菜生長(zhǎng)的影響

條斑紫菜培養(yǎng)至第4天，對(duì)照組葉片開(kāi)始變白，出現(xiàn)空泡，邊緣呈不規(guī)則狀態(tài)，表明在無(wú)菌培養(yǎng)條件下，條斑紫菜的生長(zhǎng)受到不利影響。而共培養(yǎng)組中，細(xì)菌多聚集在條斑紫菜的葉片的邊緣區(qū)域，顏色無(wú)明顯變化。圖2顯示，從開(kāi)始至培養(yǎng)48 h期間，共培養(yǎng)組條斑紫菜的RGR一直處于上升狀態(tài)，至48 h達(dá)到最大(4.8%/d)，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，之后開(kāi)始緩慢下降但仍高于對(duì)照組。

*表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間差異顯著(P<0.05)。Treat表示藻-菌共培養(yǎng)組；Control表示對(duì)照組。圖2 Bacillus sp.LPyS1對(duì)條斑紫菜相對(duì)生長(zhǎng)率的影響Figure 2 Effects of Bacillus sp.LPyS1 on relative growth rate (RGR) of P. yezoensis

2.3 芽孢桿菌對(duì)條斑紫菜抗氧化性的影響

由圖3(a)可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，共培養(yǎng)組SOD一直處于下降趨勢(shì)，而對(duì)照組在0～24 h先下降后上升至最大值(14.3 U/mg)，之后一直下降，與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組在6 h顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但在24 h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。由圖3(b)可知，共培養(yǎng)組與對(duì)照組的POD活性波動(dòng)相似，呈先下降后上升的循環(huán)趨勢(shì)，兩組條斑紫菜POD活性分別在12 h和48 h達(dá)到最大值，分別為9.2 U/mg與8.9 U/mg，對(duì)照組POD活性在6 h最低，為3.3 U/mg，而共培養(yǎng)POD活性則在24 h最低，為3.8 U/mg，只有在6 h共培養(yǎng)組POD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。由圖3(c)可知，共培養(yǎng)組與對(duì)照組MDA含量在6～48 h呈上升趨勢(shì)，但在48～72 h下降，兩組MDA含量均在48 h達(dá)到最大，其中共培養(yǎng)組為137.91 nmol/mg，對(duì)照組為226.33 nmol/mg，兩組間具有極顯著性差異(P<0.01)。

*表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間差異顯著(P <0.05)。Treat表示藻-菌共培養(yǎng)組；Control表示對(duì)照組。圖3 Bacillus sp.LPyS1對(duì)條斑紫菜抗氧化性的影響Figure 3 Effect of Bacillus sp.LPyS1 on the antioxidant indexes of P. yezoensis

2.4 芽孢桿菌對(duì)條斑紫菜滲透性的影響

由圖4(a)可知，共培養(yǎng)組總蛋白含量總體呈上升趨勢(shì)，而對(duì)照組在0～48 h先上升后下降，兩組總蛋白含量在12、48和72 h均有顯著性差異(P<0.05)，其中在12 h共培養(yǎng)組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而48 h與72 h共培養(yǎng)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。由圖4(b)可知，兩組Pro含量變化趨勢(shì)相似，在0～12 h與24～72 h期間均為上升，其中對(duì)照組在12 h的Pro含量陡然上升，達(dá)到最大(31.14 ug/g)，極顯著高于共培養(yǎng)組(P<0.01)；與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組Pro含量組間變化幅度較小。

*表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間差異顯著(P <0.05)。Treat表示藻-菌共培養(yǎng)組；Control表示對(duì)照組。圖4 Bacillus sp.LPyS1對(duì)條斑紫菜滲透性的影響Figure 4 Effect of Bacillus sp.LPyS1 on the penetration index P. yezoensis

由圖5(a)可知，兩組葉綠素a均在0～48 h上升，至48 h達(dá)到最大，其中共培養(yǎng)組為9.72 mg/L，對(duì)照組為8.24 mg/L，且在12 h與48 h共培養(yǎng)組葉綠素a含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。如圖5(b)～5(d)所示，藻膽蛋白含量變化總體上相似，共培養(yǎng)組均呈先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)照組則呈先下降后上升的趨勢(shì)。除0 h外，共培養(yǎng)組含量均高于對(duì)照組，且在6 h和48 h差異顯著(P<0.05)。兩組藻膽蛋白含量均在48 h達(dá)到最大，其中對(duì)照組R-藻紅蛋白(phycoerythrin,RPE)為4.16 mg/g,R-藻藍(lán)蛋白(phycocyanin,RPC)為2.02 mg/g，別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin,APC)為1.19 mg/g；共培養(yǎng)組RPE為6.82 mg/g，RPC為3.46 mg/g，APC為2.69 mg/g。

*表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間差異顯著(P <0.05)。Treat表示藻-菌共培養(yǎng)組；Control表示對(duì)照組。圖5 Bacillus sp.LPyS1對(duì)條斑紫菜色素的影響Figure 5 Effect of Bacillus sp.LPyS1 on pigment of P. yezoensis

3 討論與結(jié)論

3.1 芽孢桿菌對(duì)條斑紫菜生長(zhǎng)的影響

藻類(lèi)和藻際微生物兩者處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)自然環(huán)境發(fā)生劇變時(shí)，二者之間的相互關(guān)系被破壞，造成藻際微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，導(dǎo)致各種藻類(lèi)病害暴發(fā)[18]。研究表明，芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1有利于促進(jìn)條斑紫菜生長(zhǎng)與總蛋白的積累，與對(duì)照組相比，前期共培養(yǎng)組RGR顯著上升(P<0.05)，兩者關(guān)系為互利共生，說(shuō)明良好的藻際環(huán)境能夠促進(jìn)微生物與藻類(lèi)之間的生態(tài)平衡，這與周進(jìn)等[19]在藻-菌相互作用關(guān)系的研究一致。培養(yǎng)至72 h后，芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1對(duì)條斑紫菜RGR影響不顯著(P>0.05)，這與熊玉琴等[20]研究藻際微生物對(duì)壇紫菜生長(zhǎng)的結(jié)果一致，由圖1可知該溫度不適合芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其活力逐漸下降。

藻類(lèi)分泌的胞外產(chǎn)物，一部分可以被異養(yǎng)微生物生長(zhǎng)繁殖利用，此類(lèi)微生物可將大分子的有機(jī)物質(zhì)分解為小分子物質(zhì)或微量元素再次被藻類(lèi)利用[21-22]。研究表明，在光合作用下，藻類(lèi)所產(chǎn)生的溶解氧會(huì)增強(qiáng)其光呼吸作用，不利于藻類(lèi)的生長(zhǎng)，而異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖會(huì)消耗大量溶解氧并釋放CO2，使周?chē)纬梢环N還原性的藻際微環(huán)境，從而促進(jìn)藻類(lèi)的生長(zhǎng)[23-24]。Hughes等[25]研究發(fā)現(xiàn)玫瑰桿菌(Roseobacter)與顆石藻(Coccolithophore)共培養(yǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生新物質(zhì)——玫瑰毒素，該物質(zhì)抑制了顆石藻的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1對(duì)條斑紫菜生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，條斑紫菜前期的RGR快速上升可能是利用了芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1分解的小分子物質(zhì)，如維生素、礦物質(zhì)等。

3.2 芽孢桿菌對(duì)條斑紫菜生理的影響

植物體內(nèi)SOD與POD活性提高表明植物對(duì)多種抗氧化脅迫的抗性得到提高，當(dāng)植物受到嚴(yán)重脅迫時(shí)尤為明顯[26]。在12 ℃培養(yǎng)條件下，共培養(yǎng)組SOD一直下降說(shuō)明芽孢桿菌對(duì)條斑紫菜的脅迫作用很小，而對(duì)照組上升后下降表明無(wú)菌狀態(tài)不利于條斑紫菜生長(zhǎng)，但是條斑紫菜自身的抗逆性使得其受到的氧化脅迫減小，導(dǎo)致在6 h與24 h共培養(yǎng)組與對(duì)照組具有顯著性差異(P<0.05)。POD呈先下降后上升的循環(huán)趨勢(shì)表明藻菌共培養(yǎng)初期芽孢桿菌對(duì)條斑紫菜的促進(jìn)作用較大，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)芽孢桿菌逐漸弱化，其作用下降造成條斑紫菜氧化脅迫上升，致使48 h共培養(yǎng)組與對(duì)照組兩者POD活性較高，最終在72 h兩組條斑紫菜均由于自身保護(hù)機(jī)制促使酶活下降。而衡量細(xì)胞膜脂損傷程度的指標(biāo)MDA，與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組含量在48 h出現(xiàn)了極顯著差異(P<0.01)，含量為226.33 nmol/mg，高于張?jiān)萚27]測(cè)定的野生型壇紫菜MDA含量，這表明無(wú)菌處理不利于條斑紫菜生長(zhǎng)。

藻菌共培養(yǎng)組總蛋白含量總體呈上升趨勢(shì)說(shuō)明芽孢桿菌有利于條斑紫菜蛋白的合成，而前期對(duì)照組總蛋白含量先上升后下降表明無(wú)菌處理短期內(nèi)對(duì)條斑紫菜的影響不顯著，培養(yǎng)48 h后對(duì)條斑紫菜蛋白的合成造成的抑制作用，導(dǎo)致48 h與72 h共培養(yǎng)組總蛋白含量顯著高于對(duì)照組。非酶促系統(tǒng)Pro含量可判斷逆境環(huán)境對(duì)藻類(lèi)的危害程度以及藻類(lèi)對(duì)逆境的抵抗能力[28]。本研究共培養(yǎng)組12 h時(shí)Pro含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。當(dāng)藻類(lèi)生物膜被破壞，藻細(xì)胞內(nèi)Pro含量會(huì)隨之上升[29]，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，條斑紫菜Pro含量會(huì)因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)SOD下降而下降，表明Pro具有清除自由基，從而避免細(xì)胞被損傷的作用。

芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1對(duì)條斑紫菜光和色素合成具有顯著影響(P<0.05)，其中在12 h與48 h共培養(yǎng)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，主要包括藻膽蛋白和葉綠素Chla。藻膽蛋白具有儲(chǔ)存氮源的功能，同時(shí)豐富的氮源有利于促進(jìn)藻膽蛋白合成，反之，當(dāng)缺乏氮源時(shí)，藻膽蛋白的合成會(huì)顯著下降或停止[30]。本實(shí)驗(yàn)研究表明芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1有利于條斑紫菜所需氮源的合成，這與Amin等[31]的研究結(jié)果一致。Ben等[32]通過(guò)篩選幾種氮源促進(jìn)芽孢桿菌Bacillussp.R2快速繁殖，間接證實(shí)了氮源有利于條斑紫菜生長(zhǎng)及藻膽蛋白的累積。由此推測(cè)藻際芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1有可能通過(guò)產(chǎn)生生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)氮源合成從而影響條斑紫菜的生長(zhǎng)，這有待進(jìn)一步研究。

條斑紫菜的病害防治、藻-菌間相互作用機(jī)制已經(jīng)成為熱門(mén)研究之一，通過(guò)研究芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1對(duì)條斑紫菜生長(zhǎng)和生理的影響，更好地指導(dǎo)條斑紫菜的病害防治與健康養(yǎng)殖。本研究表明，短期內(nèi)芽孢桿菌Bacillussp.LPyS1能促進(jìn)條斑紫菜生長(zhǎng)與光合作用，藻際附生菌Bacillussp.LPyS1可以為條斑紫菜提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以促進(jìn)其健康生長(zhǎng)，同時(shí)也為穩(wěn)定藻際微環(huán)境提供必要的條件。