王炎炎，張斐斐，熊 娟，王 雪，李 林，馮 蕊，董萍萍，殷伊君，張有剛，周麗娟*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國際農(nóng)業(yè)研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650205；3.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214；4.云南師范大學(xué) 能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650504)

茉莉酸(Jasmonates，JA)及其衍生物是植物體內(nèi)重要的信號分子，其具有調(diào)節(jié)多個發(fā)育過程及抗逆防御反應(yīng)的功能[1-2].在茉莉酸參與的眾多生物學(xué)信號傳導(dǎo)過程中，所依賴的大多為其下游的bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYCs.不同的JA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中主要以MYC家族成員的MYC2為主，同時還有其同系物MYC3和MYC4發(fā)揮同功能冗余作用[3-6].在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，茉莉酸參與誘導(dǎo)芥子油苷合成所介導(dǎo)的防御反應(yīng).其中MYC2，MYC3和MYC4能夠與MYBs互作促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄，也能夠結(jié)合到下游芥子油苷相關(guān)合成酶啟動子激活轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄[5-7].在茉莉酸調(diào)控葉片衰老的發(fā)育過程中，MYC2/3/4結(jié)合到PAO的啟動子上，促進(jìn)葉綠素降解關(guān)鍵酶的表達(dá)[8]，同時MYC2，MYC3，MYC4及MYC5還可以協(xié)同調(diào)控病蟲害防御、葉片衰老以及側(cè)根的發(fā)育[9].而JA響應(yīng)反應(yīng)中的幾個MYCs轉(zhuǎn)錄因子在功能上存在冗余，單個基因的突變體表型往往不明顯，只有獲得純合多突變體才能更好地對其基因功能喪失后的表型進(jìn)行觀察，從而確定其基因功能.因此，為研究JA及其下游轉(zhuǎn)錄因子的功能，制備myc234三突變體顯得至關(guān)重要.基于此，本研究擬通過單突變體的雜交、自交獲得初步確定的myc234純合三突變體的F3代種子，結(jié)合PCR技術(shù)、SqRT-PCR技術(shù)以及JA敏感性試驗(yàn)綜合驗(yàn)證純合三突變體，旨在為JA相關(guān)研究提供材料，同時也可為相關(guān)突變體的鑒定提供具體的方法和數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)為Columbia(Col-0)生態(tài)型，myc2為點(diǎn)突變，myc3(GK44B11),myc4(GK491E10)為T-DNA插入[10]，上述材料由云南大學(xué)陳小蘭教授惠贈.3個單突變體通過雜交、自交后對其F2代進(jìn)行初篩，并將初篩成功的植株進(jìn)行單株收種，獲得穩(wěn)定遺傳的F3代.在茉莉酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶催化下形成茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)，MeJA是植物體內(nèi)主要的JA活性物質(zhì)[4].本研究對野生型擬南芥及三突變體外源施加MeJA ，分析突變體對MeJA的敏感性變化.

1.2 材料培養(yǎng)

種子用V(30%過氧化氫)∶V(75%乙醇)=4∶ 1混合液消毒30 s，無菌水洗3次，分別點(diǎn)播于濃度為20，40 μmol/L MeJA的1/2MS固體培養(yǎng)基上，以不含MeJA的1/2MS培養(yǎng)基為對照，parafilm膜封口.倒置于4 ℃冰箱春化48 h，移至光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行垂直培養(yǎng).培養(yǎng)條件為光照16 h/d，22 ℃，相對濕度60%～70%，在培養(yǎng)的第21天觀察根的生長情況.

1.3 突變體的鑒定

植物總DNA的提取采用CTAB法，并將其保存于-20 ℃環(huán)境中.

引物設(shè)計：myc2為點(diǎn)突變[10]，在其突變位點(diǎn)上下游設(shè)計引物，對PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測序鑒定.myc3和myc4的突變信息于SIGnAL數(shù)據(jù)庫查詢(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress/)，結(jié)合“雙引物法”進(jìn)行鑒定[11].利用primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(表1)，并由生工生物工程(上海)有限公司合成.

PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：GreenTaqMix(南京諾唯贊)，10.0 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL，模板DNA 1.0 μL.擴(kuò)增條件：預(yù)變性(94 ℃，5 min)，變性(94 ℃，30 s)，退火(60 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，45 s)，33個循環(huán)，延伸(72 ℃，5 min).

1.4 SqRT-PCR

采用TRIzol法提取總RNA，按照MonScriptTMRTIIIAll-in-OneMixMonad(購于莫納生物)說明書的方法建立20 μL標(biāo)準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄體系，并去除基因組DNA及合成cDNA.利用primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(表1)，并由生工生物工程(上海)有限公司合成.SqRT-PCR以ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，分別在野生型col-0和myc234中擴(kuò)增ACTIN,MYC2,MYC3和MYC4.PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：GreenTaqMix(南京諾唯贊)，10.0 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL，模板DNA 1.0 μL.擴(kuò)增條件：預(yù)變性(94 ℃，5 min)，變性(94 ℃，30 s)，退火(60 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，30 s)，28個循環(huán)，延伸(72 ℃，5 min).

表1 引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

MeJA敏感性試驗(yàn)中，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量培養(yǎng)了21 d擬南芥各處理的根長，并利用SPSS 21.0軟件對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 myc2純合突變體的鑒定

myc2突變位點(diǎn)是位于582 bp的G顛換為A.通過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示條帶清晰，且與目標(biāo)條帶一致，結(jié)果詳見圖1(a).通過測序及序列比對可知7株突變體材料在突變位點(diǎn)均為堿基A的單峰，而Col-0野生型對照(8號樣)為堿基G的單峰(結(jié)果見圖1(b))，說明所鑒定的7株突變體樣品均為myc2的純合突變體.

2.2 myc3純合突變體的鑒定

myc3(GK445B11)為擬南芥MYC3(AT5G46760)基因的T-DNA插入突體，其插入位置為 1 587 bp處外顯子[10].通過雙引物法，分別以LP+RP和RP+LB為引物進(jìn)行兩組PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析可知，以LP+RP為引物時僅有Col-0野生型有目標(biāo)條帶，而7株突變體均無目標(biāo)條帶(圖2(a))；在RP+LB為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時僅Col-0無目標(biāo)條帶，而7株突變體均有目標(biāo)條帶(圖2(b))，綜合兩組試驗(yàn)結(jié)果說明1～7號植株均為myc3純合突變體.

(a)PCR產(chǎn)物電泳圖 (b)PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

(a)MYC3全長 PCR檢測 (b)突變體T-DNA插入位點(diǎn)PCR檢測

2.3 myc4純合突變體的鑒定

myc4(GK491E10)為擬南芥MYC4(AT4G17880)基因的正向T-DNA插入突體，其插入位置為外顯子 271 bp 處[10].試驗(yàn)分別以LP+RP和LP+LB為引物進(jìn)行兩組PCR擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以LP+RP為引物的擴(kuò)增結(jié)果顯示僅有Col-0野生型有目標(biāo)條帶，7株突變體均無目標(biāo)條帶(圖3(a))；在LP+LB為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試驗(yàn)結(jié)果中顯示7株突變體均有目標(biāo)條帶，而Col-0無目標(biāo)條帶(圖3(b)).因此，7株突變體均為myc4的純合突變體.

(a)MYC4全長PCR檢測 (b)突變體T-DNA插入位點(diǎn)PCR檢測

2.4 突變體基因表達(dá)量分析

將qRT-PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示(圖4)，內(nèi)參ACTIN在突變體myc234和野生型Col-0的植株中均能正常擴(kuò)增出清晰條帶，而MYC2,MYC3,MYC4這3個基因在myc234中表達(dá)量較野生型對照明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)PCR鑒定出的純合三突變體植株中MYC2,MYC3和MYC4基因在轉(zhuǎn)錄水平上幾乎無表達(dá).

圖4 MYCs基因SqRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.5 突變體對茉莉酸的敏感性試驗(yàn)

試驗(yàn)將消毒后的野生型Col-0及純合三突變體種子點(diǎn)種于含有40 μmol/L MeJA的1/2MS培養(yǎng)基上，并設(shè)不含MeJA的1/2MS的培養(yǎng)基為對照，通過垂直培養(yǎng)觀察幼苗根的發(fā)育的情況(圖5).試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)21 d后，MeJA對野生型幼苗根的發(fā)育造成了嚴(yán)重的抑制作用，而myc234突變體對MeJA的抑制效應(yīng)的敏感性較對照明顯下降.野生型植株在40 μmol/L處理試驗(yàn)中的平均根長比空白組下降了39.57%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而myc234純合突變體根長反而上升3.54%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義.上述結(jié)果表明，myc234突變體的根發(fā)育對JA的調(diào)控作用不敏感.

(a)擬南芥野生型和突變體根生長對MeJA敏感性表型 (b)擬南芥野生型和突變體根生長對MeJA敏感性統(tǒng)計分析

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

在茉莉酸調(diào)控的根發(fā)育、氣孔發(fā)育、雄蕊發(fā)育及芥子油苷合成的生物學(xué)過程中[12-15]，MYC2，MYC3，MYC4均以功能冗余的方式參與其中，但在某些發(fā)育過程中三者也具有各自獨(dú)立的特異性功能，如MYC2在整個植物中都有表達(dá)，特別是在根組織中表達(dá)強(qiáng)烈，MYC3主要在營養(yǎng)組織中表達(dá)，MYC4在維管組織中表達(dá)[16].就目前的研究報道來看，MYCs的三個成員的基因功能還有很多不清楚的地方.同時，對于myc234三突變體的鑒定方法也存在很多差異，因此鑒定獲得myc234純合三突變體材料，建立其鑒定方法體系，對于研究JA相關(guān)調(diào)控機(jī)制，深入了解MYC2，MYC3，MYC4的具體生物學(xué)功能具有重要的意義.

本研究利用40 μmol/L MeJA對擬南芥進(jìn)行外源化學(xué)處理以確定突變體對JA的敏感度.在野生型中，MeJA處理后其根長較未處理對照下降了39.57%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而在myc234純合三突變體中，處理樣較對照樣根長未受抑制，反而增加了3.54%，說明該myc234純合三突變體對JA的敏感性明顯下降.這一結(jié)果與Chen等[12]的研究結(jié)論的總體趨勢一致.但本研究發(fā)現(xiàn)，在對JA敏感的度的測試試驗(yàn)中與多篇文章所用的MeJA濃度有所區(qū)別，Chen等[12]用的是20 μmol/L，喬菊香等[14]用的是28 μmol/L，Zhuo等[15]用的是 5 μmol/L，而且在處理的時間上也各不相同，由此可以看出，在對擬南芥進(jìn)行外源化學(xué)處理的敏感試驗(yàn)中，雖然各個試驗(yàn)的總體趨勢一致，但未形成統(tǒng)一的處理標(biāo)準(zhǔn)，在數(shù)據(jù)的具體細(xì)節(jié)方面存在一定的差異.因此，在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)考慮濃度梯度的問題，加強(qiáng)試驗(yàn)的全面性及系統(tǒng)性.

3.2 結(jié)論

通過PCR鑒定，SqRT-PCR半定量試驗(yàn)以及MeJA敏感試驗(yàn)，證明了通過雜交獲得的突變體材料為myc234的純合三突變體.該突變體材料中MYC2，MYC3和MYC4在轉(zhuǎn)錄水平基本無表達(dá)，其根發(fā)育對MeJA的敏感程度明顯低于野生型，結(jié)果可為深入研究MYC2，MYC3和MYC4參與JA以及其他激素調(diào)控生理生化過程中發(fā)揮的功能提供研究材料.