査艷景，姜國(guó)銀，張炳炎，楊本壽*

(1.曲靖醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 微生物研究所，云南 曲靖 655000；2.云南省遺傳學(xué)會(huì)，云南 昆明 650091)

枸骨(IlexcornutaL.)名貓兒刺、八角刺、老虎刺、鳥(niǎo)不宿、枸骨刺等，四季常青，可用于綠化.其為被子植物門(Angiospermae)雙子葉植物綱(Dicotyledons)無(wú)患子目(Sapindales)冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(Ilex)植物，主要分布于長(zhǎng)江下游各省[1].枸骨是一種常用中藥，其葉、樹(shù)皮、果實(shí)、根均可入藥，在常見(jiàn)病痛治療方面有較好療效[2].枸骨葉清熱養(yǎng)陰、益腎、平肝，可用于治療肺癆咯血、骨蒸潮熱、頭暈?zāi)垦５劝Y狀[3].

根際是植物-土壤-微生物信息和物質(zhì)交換的重要場(chǎng)所,是土壤對(duì)植物根系的生命活動(dòng)和代謝影響最直接、最顯著的區(qū)域.根際微生物對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性以及病蟲(chóng)害防治等方面都具有非常重要的作用[4-5]，因此，根際微生物組被視作植物的第二基因組.當(dāng)前，對(duì)植物宿主、根際微生物和其他土壤微生物間相互作用和關(guān)系的研究屬于全球關(guān)注的熱門和研究的熱點(diǎn)[6-8].

目前，植物菌害防治的方式主要以化學(xué)防治為主，但是長(zhǎng)期施用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)帶來(lái)農(nóng)藥殘留、病原菌抗藥性增強(qiáng)、生物多樣性受破壞、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降、病害發(fā)生易反復(fù)等負(fù)面影響[9-11].而利用生防菌進(jìn)行植物病害的防治則具有對(duì)環(huán)境安全的優(yōu)點(diǎn)，因此，對(duì)生防菌的相關(guān)研究[12-14]是新農(nóng)藥研究和創(chuàng)制的方向之一.放線菌是一類重要的生防菌，是抗生素最重要的生物來(lái)源.在現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的2萬(wàn)多種微生物來(lái)源的天然抗生素中，約有40%由放線菌產(chǎn)生[15-16].而在應(yīng)用于臨床的天然抗生素中，約有70%來(lái)源于放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[17].且自然界中放線菌種資源十分豐富，盡管目前有新的放線菌種不斷被發(fā)現(xiàn)，但仍然不足自然界中放線菌種類總量的1%[18].研究[19-22]表明，許多具有重要生物活性的放線菌是從植物根際土壤中分離得到的.本研究擬以枸骨根際土壤為研究對(duì)象，以期在其中發(fā)掘出放線菌資源用以開(kāi)發(fā)新的生防菌劑，為進(jìn)一步研究利用抑菌活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根際土樣

枸骨根際土樣采自云南省曲靖市會(huì)澤縣，為枸骨根系周圍表層下的土壤.采集方法：將其表層雜物清除掉，挖取深度為 20 cm 耕作層的根際土壤.

1.1.2 供試病原指示菌

抑菌活性檢測(cè)所用的17種病原指示菌分別為8種革蘭氏陰性菌、8種革蘭氏陽(yáng)性菌和1種病原真菌(酵母菌).其類別與來(lái)源詳見(jiàn)表1.

表1 試驗(yàn)用病原指示菌

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

根際土壤放線菌分離、純化和形態(tài)觀察使用的培養(yǎng)基為改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基(制作流程：在可溶性淀粉 20 g、硝酸鉀 1 g、磷酸二氫鉀 0.5 g、硫酸鎂 0.5 g、氯化鈉 0.5 g、硫酸亞鐵 0.01 g、瓊脂 15 g 中加入蒸餾水至 1 000 mL，調(diào)節(jié)pH=7.2～7.4后，經(jīng) 121 ℃ 高壓滅菌 15 min 后冷卻得到培養(yǎng)液.當(dāng)冷卻至50～55 ℃ 時(shí)，在 300 mL 培養(yǎng)液中加入3%的重鉻酸鉀 1 mL 混勻，最后倒入無(wú)菌平皿)，分離培養(yǎng)溫度為 28 ℃；菌株純化后，培養(yǎng)溫度為 30 ℃.種子培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基即蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(制作流程：在胰蛋白胨大豆肉湯 30 g 中加蒸餾水至 1 000 mL，分裝至錐形瓶中，121 ℃ 高壓滅菌 15 min).發(fā)酵所用培養(yǎng)基為自配培養(yǎng)基(所含物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：葡萄糖6%、大豆粉1.5%、硫酸銨0.5%、蛋白胨0.5%、碳酸鈣0.5%、硫酸鎂0.05%、硫酸二氫鉀0.02%，調(diào)節(jié)pH=6.5)，液體搖床發(fā)酵溫度為 30 ℃.

病原酵母菌培養(yǎng)采用酵母膏胨葡萄糖(YPD)瓊脂培養(yǎng)基(所含物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、瓊脂粉2%).病原指示細(xì)菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(制作流程：在牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 20 g 中加蒸餾水至 1 000 mL，其中牛肉膏用玻棒挑取，放在小燒杯中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，調(diào)節(jié)pH=7.4～7.6后，經(jīng) 121 ℃ 高壓滅菌 15 min 后，倒入無(wú)菌平皿).病原指示細(xì)菌和病原指示酵母菌培養(yǎng)溫度均為 37 ℃.

1.1.4 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)中所用重鉻酸鉀溶于蒸餾水，配制成3%的重鉻酸鉀水溶液.蛋白酶K(20 mg/mL)，DNA連接酶(5 U/μL)，溶菌酶(50 mg/mL)等均購(gòu)自Sigma公司；Taq酶及試驗(yàn)中所用培養(yǎng)基組分、各類生化試劑等均購(gòu)自昆明碩陽(yáng)科技有限公司.

1.1.5 引物

擴(kuò)增所用引物為細(xì)菌的 16S rDNA 通用引物(由北京百泰克公司合成)：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) ；1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).

1.2 方法

1.2.1 根際放線菌的分離、純化

稱取研細(xì)、自然風(fēng)干的土樣 10 g，加入含 90 mL 無(wú)菌蒸餾水的錐形瓶中，160 r/min 搖床振蕩 20 min，靜置后制備成土壤懸液.用10倍稀釋法將土壤懸液配制成10-1，10-2，10-3這3個(gè)質(zhì)量濃度梯度的土壤懸液.然后，吸取每個(gè)質(zhì)量濃度梯度的土壤懸液各 100 μL 分別涂布于單個(gè)改良高氏一號(hào)平皿上，每個(gè)平皿重復(fù)涂布3次，在 30 ℃ 環(huán)境下培養(yǎng)5～7 d.經(jīng)多次純化后，挑取單菌落到改良高氏一號(hào)試管斜面上培養(yǎng)，并對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，4 ℃ 環(huán)境下保存?zhèn)溆?

1.2.2 抑菌活性檢測(cè)

1)次生代謝產(chǎn)物粗提物的制備：首先，將分離得到的放線菌單菌落接種到 20 mL 改良高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，在 30 ℃ 環(huán)境下，200 r/min 搖床培養(yǎng)3～5 d.然后，按10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)在 30 ℃ 環(huán)境下，200 r/min 搖床培養(yǎng) 5 d.最后，在得到的發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯，浸提 24 h 后過(guò)濾除去菌體，并將發(fā)酵液濃縮至 2 mL，制備成次生代謝產(chǎn)物粗提物.

2)指示菌的培養(yǎng)：挑取病原指示細(xì)菌、病原指示酵母菌單菌落分別接種到牛肉膏蛋白胨、YPD培養(yǎng)基中，在 37 ℃ 環(huán)境下，200 r/min 搖床培養(yǎng) 1 d，制成指示菌懸液.

3)含菌平板的制備：無(wú)菌條件下分別提取各種供試指示菌懸液各 0.2 mL，置于相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、YPD固體培養(yǎng)基中制成含菌平板.

4)抑菌試驗(yàn)檢測(cè)：采用濾紙片法(直徑 6 mm)測(cè)定抗菌活性.首先，將浸泡于根際放線菌濃縮后發(fā)酵液的無(wú)菌濾紙片三片疊加，干燥后放入含菌平板上，每個(gè)樣品重復(fù)3次，設(shè)置乙酸乙酯液為發(fā)酵液的空白對(duì)照.然后將上述樣品置于 37 ℃ 環(huán)境中培養(yǎng) 24 h.最后，使用十字交叉法分別測(cè)量抑菌圈的直徑大小.

1.2.3 抑菌活性菌株的分類鑒定

1)形態(tài)鑒定.在改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基上接種并插片，30 ℃ 環(huán)境下培養(yǎng).從第二天開(kāi)始在顯微鏡下觀察菌絲生長(zhǎng)情況及孢子鏈形態(tài)等特征，所用顯微鏡型號(hào)為奧林巴斯bx43，觀察時(shí)所用目鏡為10×，物鏡為100×，放大倍數(shù) 1 000 倍，進(jìn)行初步鑒定.

2)分子鑒定.(a)枸骨根際放線菌基因組DNA的提?。翰捎酶牧几呤弦惶?hào)培養(yǎng)基液體，30 ℃ 環(huán)境下，200 r/min 搖床培養(yǎng)3～5 d，然后使用鹽析法[23]提取DNA.(b)16S rDNA的PCR擴(kuò)增條件和程序以及PCR產(chǎn)物的克隆參照文獻(xiàn)[24]進(jìn)行.首先采用BLAST和DNAMAN序列分析軟件進(jìn)行序列一致性分析.在GenBank中進(jìn)行同源序列搜索，并調(diào)出相關(guān)菌株的16S rDNA序列，然后用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，最后使用MEGA 7軟件，并采用Neighbor-Joining法模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤放線菌分離、純化結(jié)果

根據(jù)菌株培養(yǎng)特征的不同，排除重復(fù)菌株，選擇代表菌株.從枸骨根部土壤中共分離出2株放線菌菌株，分別將其命名為ZY-1和ZY-2.抑菌活性檢測(cè)結(jié)果表明，只有菌株ZY-2具有較為明顯的抑菌活性.

2.2 放線菌ZY-2的抑菌活性檢測(cè)結(jié)果

在 120 mL 根際放線菌ZY-2的發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯，靜置 1 d 后過(guò)濾除去菌體，并旋蒸濃縮成 2 mL 乙酸乙酯發(fā)酵粗提物.采用濾紙片擴(kuò)散法檢測(cè)其抑菌活性，見(jiàn)表2.結(jié)果表明，除了對(duì)恥垢分枝桿菌無(wú)明顯抑菌活性，ZY-2的乙酸乙酯提液對(duì)17種病原指示菌中的16種均具有抑制效果，抑菌圈直徑都在 9 mm 以上.說(shuō)明其抑菌活性較為明顯，具有廣譜抗菌活性.

表2 菌株ZY-2抑菌活性檢測(cè)結(jié)果

2.3 放線菌ZY-2的形態(tài)鑒定結(jié)果

在改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)菌株ZY-2，3 d 后觀察菌落正面形態(tài)(圖1).結(jié)果顯示,其單菌落呈皺褶狀，菌落正面顏色由初期的純白色慢慢變成淡黃色.菌株菌絲體和孢子觀察結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2可見(jiàn)，菌株初期菌絲體有分枝，菌絲間無(wú)橫膈膜，且不產(chǎn)生孢子，顏色淺而透明.隨著菌株生長(zhǎng)，菌絲體逐漸分化為營(yíng)養(yǎng)菌絲和氣生菌絲.菌株成熟后形成孢子絲，并產(chǎn)生大量孢子.孢子呈卵圓形、圓柱狀或桿狀，孢子鏈長(zhǎng)，且有波狀彎曲.參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[25]，上述特征符合鏈霉菌特征，因此可初步認(rèn)定菌株ZY-2屬于放線菌門鏈霉菌屬.

圖1 菌株ZY-2培養(yǎng)3 d的菌落正面圖

(a)插片2 d后觀察的營(yíng)養(yǎng)菌絲 (b)插片2 d后觀察的氣生菌絲 (c)插片3 d后觀察的氣生菌絲和孢子絲

(d)插片3 d后觀察的孢子絲 (e)插片4 d后觀察的孢子鏈和孢子

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析結(jié)果

采用鹽析法提取菌株ZY-2的基因組DNA.經(jīng)PCR擴(kuò)增 16S rDNA 基因片段，得到了 1 500 bp 左右的條帶.然后將擴(kuò)增出的菌株ZY-2 16S rDNA片段膠純化、克隆、抽提質(zhì)粒并雙向測(cè)序.而后將所得到的基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選用大腸桿菌Escherichia coli ATCC 25922 MW029931作為外類群，構(gòu)建系統(tǒng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3).16S rDNA序列的結(jié)果分析顯示,菌株ZY-2與細(xì)黃鏈霉菌Streptomyces microflavus NRRL B-1332 EF178673聚在同一分支，序列同源性為100%.結(jié)合形態(tài)特征的相似性，可將菌株ZY-2鑒定為鏈霉菌屬細(xì)黃鏈霉菌.

圖3 鄰接法構(gòu)建菌株ZY-2及相關(guān)菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

鏈霉菌是抗生素和其他生物活性物質(zhì)的主要來(lái)源，在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 1 000 多種微生物產(chǎn)生的活性物質(zhì)中，約2/3是從鏈霉菌屬的次生代謝產(chǎn)物中得到的[26].且已有實(shí)驗(yàn)[27-30]證明，細(xì)黃鏈霉菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)多種植物病害真菌、細(xì)菌具有廣譜抑制作用.此外，細(xì)黃鏈霉菌還能在植物生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)生長(zhǎng)和生物防治的作用[31-32].單一使用細(xì)黃鏈霉菌或配合其他微生物菌劑可制作具有生防效應(yīng)的微生態(tài)肥料，此類肥料在植物病害防治等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景[33].尤其是在當(dāng)前傳統(tǒng)化肥、化學(xué)農(nóng)藥大量使用而造成生態(tài)環(huán)境日趨惡化的情況下，利用鏈霉菌等頗具生防與生態(tài)價(jià)值的菌種資源開(kāi)發(fā)出用于防治植物病蟲(chóng)害、改善土壤微環(huán)境的新產(chǎn)品顯得尤為重要.

3.2 結(jié)論

采用枸骨根際土壤懸液分離、純化到了1株根際放線菌ZY-2.使用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)其發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性結(jié)果表明，除了對(duì)恥垢分枝桿菌無(wú)明顯抑菌活性外，該菌種對(duì)所測(cè)試的其他16種病原指示菌均表現(xiàn)出明顯的抑制效果，有廣譜抗菌活性.形態(tài)特征結(jié)合 16S rDNA 系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，該根際放線菌ZY-2為鏈霉菌屬細(xì)黃鏈霉菌.