自噬在光氣誘導(dǎo)急性肺損傷中的作用

何改花 ，李宏偉，于衛(wèi)華，劉江正，涂永梅，龍 子，孔德欽，劉 瑞，李文麗

(空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710032)

光氣，學(xué)名碳酰氯，是生產(chǎn)中必不可少的高產(chǎn)量中間體，主要用于生產(chǎn)重要化學(xué)品和各種類(lèi)型的塑料、藥品、農(nóng)藥、染料和日用品[1]。光氣還是一種劇毒的窒息性氣體，在空氣中分散度強(qiáng)，能較快形成殺傷濃度，被列為三類(lèi) A 級(jí)有機(jī)劇毒品。光氣全球年度總產(chǎn)量超過(guò)850萬(wàn)噸[2]，而我國(guó)年生產(chǎn)量超過(guò)300萬(wàn)噸，是世界上光氣產(chǎn)量和使用量最大的國(guó)家。由于光氣易生產(chǎn)、來(lái)源廣，其泄露導(dǎo)致眾多人員傷亡和嚴(yán)重社會(huì)危害的威脅始終存在。

光氣主要通過(guò)吸入途徑暴露，高濃度光氣可導(dǎo)致人出現(xiàn)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，嚴(yán)重者可發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征，甚至在短時(shí)間內(nèi)窒息死亡。我們團(tuán)隊(duì)從上世紀(jì)50年代開(kāi)始對(duì)光氣進(jìn)行研究，是國(guó)內(nèi)最早研究光氣肺損傷的課題組。近20年本教研室對(duì)光氣的中毒機(jī)制、防治研究雖然取得了很大的進(jìn)展[3]，但光氣中毒機(jī)制仍然不清，目前仍無(wú)有效救治辦法[4]。光氣的防治是世界范圍內(nèi)的難題之一，也是我國(guó)亟待解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外報(bào)道，光氣致?lián)p機(jī)制主要有炎癥作用、酸燒傷作用、氧化損傷作用、心肺神經(jīng)失調(diào)和Ⅱ型肺泡損傷學(xué)說(shuō)，而炎癥作用是導(dǎo)致光氣誘導(dǎo)ALI的重要原因之一。大量文獻(xiàn)表明，光氣中毒后，炎癥細(xì)胞因子大量釋放，通過(guò)扳機(jī)樣作用，觸發(fā)中性粒細(xì)胞釋放大量的髓過(guò)氧化物酶，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)大量釋放，產(chǎn)生肺損傷[5]。然而，光氣導(dǎo)致炎癥損傷的調(diào)控機(jī)制仍然不清。自噬是通過(guò)溶酶體途徑對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞器降解再利用的過(guò)程，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞更新的重要方式，在免疫、炎癥的調(diào)控中非常重要[6]。近期的研究表明，自噬在ALI中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，如增強(qiáng)自噬減輕了結(jié)晶二氧化硅誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并減輕肺損傷[7]。自噬是否在光氣誘導(dǎo)的ALI中發(fā)揮作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，深入探討自噬在光氣中毒肺損傷中的作用及機(jī)制具有重要的臨床意義。本文研究了自噬在光氣染毒動(dòng)物和細(xì)胞模型中的變化及機(jī)制，旨在從新的角度探討光氣中毒誘導(dǎo)肺損傷的新機(jī)制，并為尋找光氣中毒救治的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

光氣(10 L/150 bar氣瓶)購(gòu)自德國(guó)林德公司；光氣鼻吸入染毒設(shè)備由德國(guó)拜耳公司吸入毒理實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；光氣細(xì)胞染毒設(shè)備購(gòu)自德國(guó)Cultex公司；雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)購(gòu)自iCell公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo 公司；自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)購(gòu)自漢恒生物公司；LAMP2a抗體購(gòu)自Abcam公司(ab12506)；P62抗體購(gòu)自Abcam公司(ab109012)；LC3-Ⅱ/Ⅰ抗體購(gòu)自 Abcam公司(ab109012)；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑購(gòu)自TIANGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型 所有實(shí)驗(yàn)均按照空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物福利和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的程序進(jìn)行[SCXK(陜)2019-001]。大鼠在恒溫[(23±1)℃]和恒濕 [(55±5)%]條件下飼養(yǎng)，并遵循嚴(yán)格的12 h/12 h明暗周期。將40只SD雄性大鼠(SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g)隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、染毒后3 h組、染毒后6 h組、染毒后12 h組，每組各10只。對(duì)照組大鼠鼻吸入空氣，染毒組大鼠鼻吸入41 mg/m3光氣30 min，構(gòu)建光氣誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物模型。鼻吸入染毒參照文獻(xiàn)[8]的方法。大鼠經(jīng)鼻吸入光氣染毒后，置于正常環(huán)境飼養(yǎng)，分別在3 、6、12 h使用20 g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，解剖大鼠，收集肺組織以及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。

1.2.2 BALF總蛋白測(cè)定 肺組織稱(chēng)質(zhì)量后，在左主支氣管結(jié)扎左肺，將灌洗針緩慢插入氣管，隨后用棉繩在氣管中間1/2處打結(jié)。使用注射器吸取3 mL 37 ℃生理鹽水，注入右肺內(nèi)，停留30 s后吸出，繼續(xù)重復(fù)灌洗一次后將灌洗液吸出，注入EP管中。另取3 mL生理鹽水重復(fù)以上操作，將2次收集到的灌洗液混合在同一EP管中備測(cè)。將收集到的BALF以 3 000 r/min離心5 min，收集上清液并分裝。使用BCA試劑盒測(cè)定BALF中的總蛋白濃度，具體步驟嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，最后使用全波段酶標(biāo)儀(Infinite M200PRO，奧地利)檢測(cè)BALF的總濃度A562 nm值并計(jì)算蛋白濃度。

1.2.3 肺組織HE染色切片制作及觀察 取大鼠左肺上葉， 經(jīng)過(guò)40 mL/L多聚甲醛固定—蒸餾水清洗—乙醇梯度脫水—二甲苯透明—石蠟包埋—切片(LeicaRM2135型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，4 μm)—蘇木素-HE染色等步驟后，使用正置光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)觀察HE染色切片并拍照。

1.2.4 Western blotting測(cè)定蛋白表達(dá) 取肺組織50 mg(冰上操作)，加入RIPA裂解液，經(jīng)組織研磨器(新芝生物，寧波)充分研磨后，在室溫放置5 min，12 000 r/min離心10 min，提取上清液。配制不同濃度的SDS-PAGE分離膠，以濃縮膠90 V，分離膠120 V的電壓使用SDS-PAGE垂直電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后使用Trans-blot蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，美國(guó))將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后將膜浸泡在50 g/L脫脂牛奶中，室溫封閉2 h，封閉完成后，使用TBST洗凈殘余封閉液體。根據(jù)不同的目的蛋白敷相應(yīng)的一抗， 4 ℃搖床過(guò)夜，次日使用TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h后，使用TBST洗滌3次，每次10 min，最后用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(Bio-Rad, 美國(guó))顯影。使用Image J軟件分析條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、50 mL/L CO2的條件下培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞(人源支氣管上皮細(xì)胞)。當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%～ 90%時(shí)，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按密度接種于不同類(lèi)型培養(yǎng)板，分組處理后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞染毒與分組 將BEAS-2B細(xì)胞以1×107個(gè)/L的密度接種于Transwell六孔板細(xì)胞培養(yǎng)小室中，對(duì)照組3個(gè)小室，染毒組3個(gè)小室。待細(xì)胞貼壁后，吸去小室中的液體，將小室放入氣液界面細(xì)胞暴露系統(tǒng)(Cultex Technology, 德國(guó))中。對(duì)照組給予空氣，染毒組以3.2 mg/m3光氣動(dòng)態(tài)染毒60 min，構(gòu)建光氣誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型。

1.2.7 細(xì)胞自噬流的測(cè)定 將BEAS-2B細(xì)胞接種至共聚焦皿中，接種密度為1×108個(gè)/L，待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)4 h，構(gòu)建mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞，然后光氣暴露1 h，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，完畢后使用40 mL/L多聚甲醛固定、封片，激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)拍照分析。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定炎癥因子mRNA的表達(dá) 使用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。實(shí)驗(yàn)中所使用引物的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 光氣染毒大鼠ALI模型的建立

2.1.1 光氣染毒對(duì)大鼠肺濕質(zhì)量和肺體比的影響 與對(duì)照組相比，光氣染毒后大鼠肺濕質(zhì)量和肺體比值在染毒后3 h開(kāi)始增加，到染毒后6 h明顯增加(P<0.05)，12 h顯著增加(P<0.01,圖1)。結(jié)果表明，光氣染毒后大鼠肺濕質(zhì)量、肺體比與染毒后時(shí)間存在時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

aP<0.05， bP<0.01 vs對(duì)照組(n=10)。圖1 光氣染毒后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肺濕質(zhì)量和肺體比的變化

2.1.2 光氣染毒對(duì)大鼠肺組織病理學(xué)的變化 HE染色觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，表現(xiàn)為肺泡壁薄，肺泡結(jié)構(gòu)完好 (圖2A)；光氣染毒后3 h組大鼠肺間質(zhì)增厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多 (圖2B)；染毒后6 h組大鼠肺泡腔有少量滲出液，炎癥細(xì)胞顯著增多 (圖2C)；染毒后12 h組大鼠肺組織炎癥細(xì)胞大量增多，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔融合并可見(jiàn)大量滲出液 (圖2D)。

A：對(duì)照組；B：染毒后3 h組；C：染毒后6 h組；D：染毒后12 h組。HE ×200。圖2 光氣染毒后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織病理改變

2.1.3 光氣染毒對(duì)大鼠BALF中總蛋白含量的影響 與對(duì)照組相比，光氣染毒后3 h大鼠BALF中總蛋白濃度開(kāi)始增加，到染毒后6 h有明顯增加 (P<0.05)，12 h增加最顯著(P<0. 01，圖3)。

aP<0.05， bP<0.01 vs對(duì)照組(n=10)。圖3 光氣染毒后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠BALF中總蛋白濃度的變化

2.2 光氣染毒大鼠ALI中自噬相關(guān)分子的變化

為了觀察自噬在光氣誘導(dǎo)大鼠ALI中的作用，用Western blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的變化(圖4A)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，溶酶體相關(guān)膜蛋白 2a型(LAMP2a)和微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3 (LC3-Ⅱ/Ⅰ) 蛋白在染毒后 6、12 h顯著降低(P<0.01, 圖4B～C)， P62蛋白染毒后6、12 h顯著增加(P<0.01, 圖4D)。以上結(jié)果提示光氣染毒后6、12 h顯著抑制了肺組織自噬的發(fā)生。

2.3 光氣致人支氣管上皮細(xì)胞損傷模型的建立

光氣染毒BEAS-2B細(xì)胞12 h后，經(jīng)PCR測(cè)定，與對(duì)照組相比，IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA水平顯著升高(P<0.01，圖5)。

A：肺組織LAMP2a、LC3-Ⅱ/Ⅰ及P62蛋白水平的表達(dá)；B：LAMP2a蛋白相對(duì)灰度值變化；C：P62蛋白相對(duì)灰度值變化；D： LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白相對(duì)灰度值變化。LAMP2a：溶酶體相關(guān)膜蛋白2a型，LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3。 aP<0.05， bP<0.01 vs對(duì)照組。圖4 光氣染毒后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

A： IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)；B：IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)；C：IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)。 bP<0.01 vs對(duì)照組(n=3)。圖5 光氣染毒細(xì)胞后對(duì)炎癥相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

2.4 自噬在光氣染毒BEAS-2B細(xì)胞損傷中的作用

2.4.1 光氣染毒對(duì)BEAS-2B自噬流的影響 為了觀察自噬在光氣誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞中的作用，使用自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染BEAS-2B細(xì)胞，結(jié)果見(jiàn)圖6。經(jīng)自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染BEAS-2B細(xì)胞4 h，光氣染毒1 h后，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，發(fā)現(xiàn)染毒組與對(duì)照組相比，綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein， GFP)和紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein， mRFP)斑點(diǎn)顯著減少，表明溶酶體和LC3減少(圖6A～B)，GFP圖片和mRFP圖片重合后出現(xiàn)的黃色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn)均減少，表明自噬體和自噬溶酶體均減少(圖6C)。

A：LC3熒光斑點(diǎn)代表圖；B：GFP 和 mRFP 點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞的平均數(shù)；C：GFP圖像和mRFP圖像 merge 后每個(gè)細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體的平均數(shù)。 aP<0.05， bP<0.01 vs對(duì)照組GFP 和mRFP。GFP:綠色熒光蛋白；mRFP：紅色熒光蛋白。 標(biāo)尺為20 μm。圖6 光氣染毒BEAS-2B細(xì)胞后自噬流的變化

2.4.2 自噬激動(dòng)劑雷帕霉素干預(yù)對(duì)光氣染毒誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞損傷的影響 光氣染毒BEAS-2B細(xì)胞后，給予0.5 μmol/L雷帕霉素處理12 h。結(jié)果顯示，給予雷帕霉素后，與染毒組相比，對(duì)照組及染毒+RaPa組IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA水平均顯著降低(P<0.05，圖7)。

A： IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)；B：IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)；C：IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)。 RaPa：雷帕霉素。 aP<0.05 vs 染毒組， bP<0.01 vs對(duì)照組 (n=3)。圖7 雷帕霉素干預(yù)對(duì)光氣染毒誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

3 討論

光氣作為一種軍用窒息性化學(xué)戰(zhàn)劑，被廣泛用于第一次和第二次世界大戰(zhàn)中。侵華日軍在我國(guó)曾生產(chǎn)和使用大量的化學(xué)武器，造成我國(guó)大量軍人和平民傷亡。日本戰(zhàn)敗撤出我國(guó)時(shí)，在我國(guó)19個(gè)省市遺棄、埋藏了40多萬(wàn)枚化學(xué)彈藥，即日本遺留的化學(xué)武器，簡(jiǎn)稱(chēng)“日遺化武”，其中大量為光氣炸彈或炮彈。1986年在山西等地發(fā)現(xiàn)了數(shù)千發(fā)光氣彈，天津、珠江口等地也挖出了大量光氣炮彈，含光氣的日遺化武對(duì)我國(guó)人民的生命安全造成了巨大的現(xiàn)實(shí)威脅。光氣作為一種雙用途化學(xué)戰(zhàn)劑，也是平時(shí)化學(xué)生產(chǎn)中必不可少的高產(chǎn)量中間體，主要用于生產(chǎn)重要化學(xué)品的原料，例如亞甲基二苯基二異氰酸酯和甲苯二異氰酸酯。光氣也用于生產(chǎn)各種類(lèi)型的塑料、藥品、農(nóng)藥、染料和日用品。許多化工產(chǎn)品如氯仿、三氯乙烯、塑料等燃燒也會(huì)產(chǎn)生光氣。我國(guó)是世界上光氣產(chǎn)量和使用量最大的國(guó)家，年產(chǎn)量超過(guò)300萬(wàn)噸，職業(yè)性接觸人員眾多。目前，我國(guó)光氣安全生產(chǎn)態(tài)勢(shì)嚴(yán)峻，許多中小型工廠(chǎng)光氣生產(chǎn)設(shè)備陳舊，很容易造成光氣泄露，導(dǎo)致眾多人員傷亡和嚴(yán)重社會(huì)危害。如2004年6月15日，福州市發(fā)生光氣泄漏事故，導(dǎo)致260人光氣中毒。天津、大連、宿遷等地也都曾發(fā)生過(guò)光氣泄露致人傷亡事故，損失慘重，教訓(xùn)深刻。目前，光氣中毒的治療是世界范圍內(nèi)的難題之一，也是我國(guó)亟待解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

光氣中毒主要靶器官是肺組織，引起中毒者發(fā)生ALI，嚴(yán)重者可窒息死亡，但近百年來(lái)，國(guó)際上始終未闡明光氣肺水腫的發(fā)生機(jī)制。本課題組開(kāi)展了大量研究，提出了酸燒傷、氧化應(yīng)激、炎癥作用、細(xì)胞凋亡等學(xué)說(shuō)，并針對(duì)這些中毒機(jī)制，開(kāi)展了大量光氣中毒藥物的篩選，雖然取得了一定進(jìn)展，但仍然沒(méi)有找到一種治療光氣致ALI的特效藥物[9-10]。因此，深入解析光氣導(dǎo)致ALI的分子機(jī)制，對(duì)于平戰(zhàn)時(shí)光氣中毒的救治具有重要意義。我們團(tuán)隊(duì)從20世紀(jì)50年代開(kāi)始對(duì)光氣進(jìn)行研究，是國(guó)內(nèi)最早研究光氣肺損傷的課題組。近10年，我們與德國(guó)拜爾公司毒理室國(guó)際知名的吸入毒理學(xué)家JUERGEN PAULUHN教授進(jìn)行了合作研究，建立了與國(guó)際接軌的吸入毒理學(xué)研究平臺(tái)，并發(fā)表了大量相關(guān)研究文章和論著[11-13]。本文利用該平臺(tái)，給予大鼠動(dòng)態(tài)鼻吸入染毒1 230 mg/m3的光氣30 min，大鼠肺濕質(zhì)量、肺體比和BALF總蛋白在染毒后6 h明顯增加，12 h增加到最高[14]。光鏡下觀察肺組織HE切片顯示，光氣染毒組大鼠肺間質(zhì)增厚、炎性細(xì)胞增多、肺泡腔有滲出液。以上結(jié)果表明我們成功建立了鼻吸入光氣染毒大鼠ALI模型。

為了更好地在細(xì)胞水平研究光氣中毒機(jī)制及分子調(diào)控，必須建立光氣染毒細(xì)胞損傷模型。目前，國(guó)際上未見(jiàn)此模型的相關(guān)報(bào)道。我們科室利用德國(guó)Cultex公司生產(chǎn)的國(guó)際先進(jìn)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞染毒設(shè)備，真實(shí)地模擬了符合人體氣血屏障特點(diǎn)的氣液界面環(huán)境，暴露效率高,用3.2 mg/m3的光氣動(dòng)態(tài)染毒60 min構(gòu)建體外光氣染毒人支氣管上皮細(xì)胞模型。我們的研究發(fā)現(xiàn)，光氣暴露后導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生顯著的炎癥反應(yīng)，提示炎癥反應(yīng)在光氣誘導(dǎo)的ALI中可能發(fā)揮了重要作用[15]。研究表明，光氣暴露可引起大量中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞聚集在肺泡表面，釋放大量的髓過(guò)氧化物酶，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)大量釋放，促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，組織液大量滲出或漏出，引起ALI[15]。因此，我們將炎癥指標(biāo)作為光氣染毒細(xì)胞損傷模型建立的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)光氣染毒后，人支氣管上皮細(xì)胞IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA水平均顯著升高，證明我們成功建立光氣染毒細(xì)胞損傷模型，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

自噬是一種自我降解的過(guò)程，在去除錯(cuò)誤折疊和聚集的蛋白質(zhì)，清除受損細(xì)胞器(如線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng))，以及消除細(xì)胞內(nèi)病原體方面發(fā)揮“管家”的作用[16]。在正常情況下，自噬不影響細(xì)胞的生存和正常功能，只有當(dāng)機(jī)體自噬平衡被打破時(shí)(自噬增強(qiáng)或者不足)，才會(huì)引起細(xì)胞功能異常，導(dǎo)致相關(guān)組織病理?yè)p害加重或者壞死。自噬對(duì)于細(xì)胞的生存和死亡具有雙重作用，適度自噬有利于細(xì)胞生存，自噬不足和過(guò)度自噬均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。自噬可通過(guò)抑制細(xì)胞炎癥因子而恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài)，從而減輕組織炎癥和相關(guān)損傷[17]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自噬可能通過(guò)直接抑制炎癥復(fù)合物和間接清除炎癥刺激物如受損的細(xì)胞器來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受持久炎癥的侵害。研究報(bào)道[18]，在脂多糖誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中，肺組織中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化顯著增高，自噬顯著降低。在人支氣管上皮細(xì)胞中，脂多糖增加mTOR磷酸化，抑制自噬，而敲減mTOR可通過(guò)增強(qiáng)自噬，減輕脂多糖誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。也有研究報(bào)道，自噬抑制氧化銅納米粒子誘導(dǎo)的ALI[19]。上述研究提示，自噬可能在肺損傷的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色。

我們前期觀察到光氣所致ALI肺組織多種細(xì)胞發(fā)生凋亡[20-21]，而在某些情況下，自噬抑制凋亡是細(xì)胞的存活途經(jīng)，二者通路相互關(guān)聯(lián)、互為調(diào)控，但自噬是否也參與光氣所致ALI目前未見(jiàn)研究報(bào)道。自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、P62蛋白和LAMP2a蛋白表達(dá)改變被廣泛作為自噬流活化或抑制的標(biāo)志物，通常認(rèn)為L(zhǎng)C3-Ⅱ/Ⅰ升高、LAMP2a蛋白增多、P62蛋白水平下降代表了自噬活化[22]，反之表示自噬被抑制。本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物模型中觀察到，大鼠肺組織LAMP2a和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)在光氣染毒后6 h開(kāi)始下降，而P62蛋白表達(dá)在6 h開(kāi)始增加，表明光氣誘導(dǎo)大ALI過(guò)程中肺組織自噬降低。在細(xì)胞模型中我們觀察到同樣的現(xiàn)象，光氣染毒感染自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)BEAS-2B細(xì)胞，重合后的黃色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn)均減少，表明自噬體和自噬溶酶體都減少，提示光氣所致支氣管上皮細(xì)胞損傷中自噬流降低。通過(guò)光氣染毒體內(nèi)和體外模型，我們證明了光氣染毒后6～12 h顯著抑制了肺組織自噬的發(fā)生，自噬抑制可能是光氣中毒的重要發(fā)病機(jī)制之一。

為進(jìn)一步驗(yàn)證自噬在光氣所致ALI中的作用，我們給予光氣染毒的BEAS-2B細(xì)胞0.5 μmol/L自噬激動(dòng)劑雷帕霉素處理12 h，結(jié)果表明，雷帕霉素干預(yù)組與光氣染毒組相比，細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)，提示雷帕霉素激活自噬能夠有效減輕光氣所致細(xì)胞的驗(yàn)證反應(yīng)。因此，我們進(jìn)一步確證自噬抑制可能是光氣誘導(dǎo)ALI的重要機(jī)制之一，尤其是參與了光氣誘導(dǎo)肺組織炎癥損傷過(guò)程。

綜上所述，我們證實(shí)光氣染毒能造成大鼠ALI和支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時(shí)抑制肺組織自噬。自噬激動(dòng)劑雷帕霉素干預(yù)可有效減輕光氣對(duì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，提示光氣染毒后自噬降低可能是光氣所致ALI的重要機(jī)制 。下一步我們將在動(dòng)物模型上使用自噬激動(dòng)劑或抑制劑驗(yàn)證該結(jié)論。同時(shí)，光氣誘導(dǎo)自噬降低的具體機(jī)制也不明確，可能是自噬流的阻斷或者是自噬流過(guò)度活化所致，具體機(jī)制還需要我們進(jìn)一步研究。