王小壯，劉雙平，孫海龍，韓 笑，毛 健*，應維茂

（1 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室 江蘇無錫 214122 2 江南大學生物工程學院 江蘇無錫 214122 3 江南大學食品學院 江蘇無錫 214122 4 國家黃酒工程技術研究中心 浙江紹興 312000）

在黃酒釀造過程中，霉菌提供了豐富的酶系，是必不可少的釀造微生物[1]。在工業(yè)化黃酒生產(chǎn)中，以純培養(yǎng)的黃曲霉SU-16 為主要糖化劑[2-4]，其中黃曲霉在熟麥曲中占到真菌群落結構的75%以上，在接種的生麥曲中占到群落結構的32.72%，在黃酒發(fā)酵過程中的相對含量>1%[5-6]，因此黃曲霉對黃酒的發(fā)酵至關重要。生物量是表征微生物生長情況的重要指標，快速、準確地測定生物量的變化，對于反映微生物的活性具有重要意義。然而，目前尚無對黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉的動態(tài)變化的定量分析。qPCR 利用熒光信號累積對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，通過實時監(jiān)測整個PCR 進程，準確定量樣品中微生物的生物量，同時具有操作簡便、專一性和靈敏度高、耗時短的優(yōu)勢，目前被廣泛應用于環(huán)境、食品[7-9]等領域中微生物的定量檢測。

黃酒發(fā)酵是一個復雜的發(fā)酵過程，發(fā)酵過程中微生物之間、環(huán)境與微生物之間存在著復雜的相互作用關系[10-11]。有研究指出pH 值、溫度、乙醇以及弱酸等環(huán)境因子會通過影響真菌生長，進而影響其代謝活性來對發(fā)酵產(chǎn)生作用[12-15]。黃酒發(fā)酵采用間歇開耙的方式為微生物提供氧氣，同時微生物的活動產(chǎn)生大量的乙醇和有機酸，發(fā)酵醪中乙醇和有機酸的積累可能對黃曲霉的生長有一定影響。毛青鐘等[16]僅研究了黃酒發(fā)酵醪中抑制霉菌生長的因子，未深入研究黃曲霉的生長脅迫條件。

本研究基于qPCR 方法對黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉的動態(tài)變化進行定量分析，解析發(fā)酵環(huán)境中主要代謝物質(zhì)對其生長的影響，以期為研究黃曲霉對黃酒發(fā)酵的貢獻提供基礎數(shù)據(jù)，同時可為研究其它釀造微生物提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

1）試驗過程中所用菌株黃酒酵母HJ 和黃曲霉SU-16 均為黃酒生產(chǎn)工業(yè)菌株；黃酒酵母用YPD 培養(yǎng)基，黃曲霉SU-16 用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基進行菌種活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基115 ℃高壓滅菌20 min 備用。

2）生麥曲和熟麥曲 （黃曲霉SU-16 純種麥曲）均取自紹興某黃酒廠，大米購于當?shù)爻小?/p>

3）所用菌株均為本實驗室保藏。

1.1.2 試驗試劑 無水乙醇、乳酸、乙酸、無水葡萄糖等試劑，國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母膏、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、TB Green Mix、溶菌酶、溶壁酶和蛋白酶K，無錫博瑞康有限公司；試驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

Legend Micro 17R 冷凍高速離心機，美國賽默飛世爾科技公司；DM500 RH 生物顯微鏡，德國徠卡顯微系統(tǒng)公司；Universal HoodⅡ凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；Q5000 超微量紫外分光光度計，美國QUAWEⅡ公司；Qtower 3.0 熒光定量PCR 儀，德國耶拿分析儀器股份公司；KC/HWS-250PY 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海凱測實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酒發(fā)酵與取樣 參照黃酒發(fā)酵工藝[17]在實驗室條件下模擬黃酒發(fā)酵。使用生麥曲、熟麥曲、酒母、米飯和水混合落料（按照表1配料添加），落料溫度28 ℃，前酵溫度30 ℃±2 ℃發(fā)酵120 h，每天開耙不少于1 次，頭耙時間為8～10 h；后酵15 ℃±2 ℃發(fā)酵408 h。發(fā)酵試驗在5 L 體系中進行，每個試驗3 個平行。分別在發(fā)酵0，24，48，72，96，120，168，240，312，432，528 h 后充分攪拌混勻3 min，用無菌取樣袋取樣100 g。

表1 黃酒模擬發(fā)酵體系Table 1 Huangjiu simulated brewing system

1.3.2 理化指標的檢測 參照GB/T 13662-2018《黃酒》[18]進行總酸（以乳酸計）、氨基態(tài)氮和酒精度的測定，采用3，5-二硝基水楊酸比色法[19]測定還原糖的含量。

1.3.3 熒光定量PCR 測定黃曲霉的生物量

1）黃曲霉的引物篩選及特異性驗證 真菌的ITS 區(qū)域和β-微管蛋白基因序列常被用于曲霉屬微生物的鑒定[20]。通過文獻查閱選擇這2 個區(qū)域，針對黃曲霉的特異性引物（表2），通過NCBI提供的Primer-Blast 功能模擬比對，選出特異性高且擴增產(chǎn)物在100～200 bp 的引物。以黃酒生產(chǎn)中篩選到的14 種真菌為模板，對該引物進行PCR特異性試驗驗證。PCR 反應體系：2×PrimeSTAR HS DNA Polymerase 12.5 μL、上下游引物各10 mmoL、模板100 ng，補充ddH2O 至25 μL；PCR 反應程序：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s 共30 個循環(huán)，72 ℃充分延伸5 min，16 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行引物特異性驗證。

表2 黃酒釀造中黃曲霉的引物篩選Table 2 Screening of primers for A.flavus in Huangjiu brewing

2）標準曲線的建立 將黃曲霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，待長滿孢子收集制成孢子懸浮液，參照文獻[8]和[9]的方法以Ct 值（即每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）為橫坐標，生物量（103～108）的對數(shù)值為縱坐標繪制標準曲線。通過擴增效率（Eff=10（-1/b）-1，95%～105%）和可信度（R2）來衡量標準曲線的可靠性，其中b 是標準曲線的斜率[24]。qPCR 反應體系：2×TB Green Mix 10 μL，上下游引物各10 mmoL，模板100 ng，補充ddH2O 至20 μL；qPCR 反應程序：95 ℃90 s，95 ℃15 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)，然后從60 ℃升溫至95 ℃，每隔1 ℃讀1 次板，每次讀板維持10 s，繪制熔解曲線。

3）DNA 的提取 稱取5 g 發(fā)酵醪樣品，液氮研磨后轉入50 mL 離心管中，加入無菌水10 mL，混勻振蕩30 min，超聲5～10 min 后離心（1 000 r/min，4 ℃，10 min），取上清，洗滌2 次。將所得上清液高速離心（12 000 r/min 離心10 min）后向沉淀中加入5 mL 無菌水，采用SDS-CTAB 抽提法[25]提取黃酒發(fā)酵醪預處理樣品的基因組。

4）樣品測定 將樣品DNA 濃度稀釋到合適濃度后，分別使用黃曲霉特異性引物進行qPCR擴增，測定Ct 值，按照1.3.3（2）節(jié)中的標準曲線計算生物量。

1.3.4 通氧量對黃曲霉SU-16 生長的影響 取1 mL（約1.0×107spores/mL）黃曲霉SU-16 孢子懸浮液接種于100 mL 黃酒模擬液[26]培養(yǎng)基中，分別置于搖床（28 ℃，150 r/min）以及培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)120 h，培養(yǎng)箱中每隔12 h 搖勻3 min，每隔24 h取樣按照1.2.3 節(jié)的方法測定黃曲霉SU-16 生物量的變化。

1.3.5 發(fā)酵因素對黃曲霉SU-16 生長的影響

1）乙醇對黃曲霉SU-16 生長的影響 將含有不同乙醇含量（1%，3%，5%，8%，12%vol）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒平板，晾干平板。

2）乳酸對黃曲霉SU-16 生長的影響 將含有不同質(zhì)量濃度乳酸（2，4，6，8 g/L）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒平板，晾干平板。

3）乙酸對黃曲霉SU-16 生長的影響 將含有不同質(zhì)量濃度乙酸（2，4，6，8 g/L）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒平板，晾干平板。

在以上平板正中間放置1 個直徑6 mm 的濾紙片，吸取3 μL （約1.0×107spores/mL） 黃曲霉SU-16 孢子懸浮液滴于濾紙片上，立即用封口膜密封，28 ℃培養(yǎng)120 h，每隔24 h 采用十字交叉法測量菌落直徑，各3 個平行。

1.3.6 乙醇/乳酸/乙酸對黃曲霉SU-16 生物量的影響 分別配制不同濃度的乙醇 （1%，3%，5%，8%，12%vol）、乳酸（2，4，6，8 g/L）和乙酸（2，4，6，8 g/L） 黃酒模擬液，吸取1 mL （約1.0×107spores/mL）黃曲霉孢子懸浮液加入黃酒模擬液中恒溫28℃培養(yǎng)，每隔12 h 搖勻3 min，每隔24 h 取樣按照1.3.3 節(jié)的方法測量黃曲霉SU-16 生物量的動態(tài)變化，各3 個平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 7、qPCRsoft（Version 4.0）和Excel（Version 2013）進行樣品數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果與分析

2.1 黃酒發(fā)酵過程中理化指標和黃曲霉的動態(tài)變化

2.1.1 黃酒發(fā)酵過程中理化指標的動態(tài)變化 黃酒發(fā)酵過程中理化指標的變化如圖1所示，隨著發(fā)酵時間的延長，樣品中的還原糖含量降低，酸度和乙醇升高，理化指標在前酵（28 ℃，0～120 h）過程中，尤其是0～48 h 變化較大，120 h 時發(fā)酵醪液中總酸含量為（3.51 ± 0.11）g/L，氨基態(tài)氮含量為（1.24±0.02）g/L，還原糖含量為（28.74±1.01）g/L，乙醇含量為15.27%±0.51%vol。由于原料在前酵過程中被充分利用，后酵（15 ℃，120～528 h）過程理化指標基本趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結束后（528 h），發(fā)酵醪液中總酸含量為（3.82 ± 0.33）g/L，氨基態(tài)氮含量為（1.83 ± 0.05）g/L，還原糖含量為（28.65 ±3.87）g/L，乙醇含量為16.03%±0.93%vol。

圖1 黃酒發(fā)酵過程中理化指標的變化Fig.1 Changes of physicochemical indexes of Huangjiu brewing

陳青柳等[27]對機械化黃酒釀造發(fā)酵過程中的理化指標進行動態(tài)檢測，發(fā)現(xiàn)理化指標在0～48 h變化最為迅速，后酵過程中理化指標變化緩慢趨于穩(wěn)定，與本試驗結果相符。周佳冰等[17]研究了不同黃酒酵母發(fā)酵過程理化指標的變化曲線，理化指標均在前酵過程中快速變化，后酵趨于穩(wěn)定，說明理化指標的變化主要在前酵過程中。

2.1.2 黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉生物量的變化 通過Primer-blast 模擬比對，排除特異性較差的引物β-Tub-F/R，引物Af-F/R 特異性高而擴增產(chǎn)物長度為73 bp，因此以黃酒生產(chǎn)中篩選到的14 種真菌為模板，對引物Ao-F/R 進行特異性驗證，黃酒釀造中的真菌主要有酵母屬、曲霉屬以及笄霉屬[6]，米曲霉是由黃曲霉馴化而來，被認為是黃曲霉亞種，因此在定量黃曲霉過程中Ao-For/Rev 可以擴增黃曲霉和米曲霉，瓊脂糖凝膠電泳擴增得到的產(chǎn)物長度與目的基因長度相符（圖2）。生物量的測定參考路虎和陳筆等[8-9]建立的qPCR 方法，經(jīng)qPCR 擴增反應熔解曲線呈現(xiàn)單一熔解峰（圖3a），說明產(chǎn)物特異性良好，無非特異性擴增；然后以黃曲霉孢子濃度與Ct 值做標準曲線 （圖3b），結果具有良好的線性關系，R2大于0.999，斜率為-0.3137，對應的擴增效率為105%，滿足qPCR 的基本要求。經(jīng)過適用性驗證，回收率在86%以上，能夠較準確的將添加的黃曲霉進行定量分析，說明該方法適用于黃酒體系中黃曲霉生物量的定量分析。

圖2 引物擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of PCR products

圖3 黃曲霉的熔解曲線及標準曲線Fig.3 Melting curve and standard curve of A.flavus

采用qPCR 方法對黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉的生物量進行跟蹤檢測。結果如圖4所示，黃曲霉的生物量變化在0～24 h 變化最大，48 h 時增殖到105.87CFU/g，生物量達到最高，之后呈波動下降趨勢，發(fā)酵結束后生物量降低至104.37CFU/g，低于初始接種量，黃曲霉在發(fā)酵過程中呈先增后降的變化趨勢。路虎等[8]和Chen 等[9]的研究結果顯示，塔賓曲霉和鏈霉菌均在制曲階段微生物明顯增加，在堆積/酒醅發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的進行生物量有所減少；蔡琪琪等[28]采用PCR-DGGE 結合qPCR 定量檢測的方法發(fā)現(xiàn)紅曲霉在釀酒過程中被抑制。黃曲霉的生物量增加發(fā)生在發(fā)酵初期（0～48 h），此階段發(fā)酵環(huán)境發(fā)生變化，乙醇含量從0%vol 升高至10%vol 以上，總酸含量由（0.9±0.07）g/L 升高至（3.83±0.04）g/L，之后在一定的乙醇（>10%vol）和酸度（>4 g/L）的發(fā)酵環(huán)境中，黃曲霉的生物量開始下降。說明發(fā)酵環(huán)境的變化可能影響到了黃曲霉的生長。

圖4 黃酒發(fā)酵中黃曲霉生物量的變化Fig.4 Changes of A.flavus biomass during Huangjiu brewing

2.2 乙醇對黃曲霉SU-16 生長的影響

乙醇是黃酒發(fā)酵的重要代謝產(chǎn)物，占到發(fā)酵環(huán)境的0～17%vol，在前酵過程中乙醇快速增加，至120 h 乙醇可增加至10%vol 以上。乙醇的含量不僅影響黃酒的品質(zhì)，還會對微生物有一定的抑制作用[28]。乙醇對黃曲霉SU-16 生長的影響如表3和圖5所示，隨著乙醇含量的增加，黃曲霉SU-16 的生長均呈下降趨勢，與對照組（0%vol）相比，添加乙醇均對菌落生長產(chǎn)生顯著影響 （P<0.05）（圖5a），其中乙醇含量≥5%vol 時，嚴重影響到了孢子的萌發(fā)（表3）。乙醇含量為1%vol 時，對黃曲霉SU-16 生物量的影響差異不顯著（P>0.05），而乙醇含量為3%vol 時，對黃曲霉SU-16 的生物量影響顯著（P<0.01），當乙醇含量≥5%vol 時，黃曲霉SU-16 生物量變化呈下降趨勢（圖5b）。因此，可以確定黃酒發(fā)酵的代謝產(chǎn)物（乙醇） 對黃曲霉SU-16 的生長具有顯著的影響，其中乙醇含量≥5%vol 時，嚴重影響到了孢子的萌發(fā)。

表3 乙醇對黃曲霉SU-16 生長的影響Table 3 Effects of ethanol on the growth of A.flavus SU-16

圖5 乙醇對黃曲霉SU-16 生物量的影響Fig.5 Effects of ethanol contents on the growth of A.flavus SU-16

黃永光等[29]對醬香白酒中曲霉菌進行分離并研究Aspergillus hennebergii 酶分泌脅迫條件，結果顯示乙醇含量>8%vol 時，對Aspergillus hennebergii 的生長和產(chǎn)酶存在抑制；蔡琪琪等[28]研究結果顯示發(fā)酵初期的酒精度（<4%vol）對紅曲霉無影響，而隨著酒精度的增加，紅曲霉的生長逐漸受到抑制；Vinayavekhin 等[14]對黑曲霉的乙醇耐受性進行研究，結果顯示黑曲霉對乙醇的耐受濃度為5%vol。由此可見，不同菌株對乙醇的耐受性不同，黃曲霉SU-16 的乙醇耐受能力在5%vol 左右。然而黃曲霉對于乙醇脅迫的耐受機制尚不明確，這對其在黃酒釀造中生存和適應高乙醇環(huán)境至關重要。乙醇是一種小的二碳醇，易溶于水和脂類環(huán)境，可以通過增加膜的流動性而通過質(zhì)膜進入細胞，這種膜流動性的增加導致膜完整性的喪失，從而增加滲透性，同時乙醇還會改變線粒體的結構，降低ATP 的水平和細胞呼吸頻率，并促進乙醛和活性氧的生成，從而導致脂質(zhì)過氧化、DNA 損傷和氧化應激，最終降低細胞活力[30]。馬龍等[31]研究了米曲霉響應乙醇脅迫機制，結果表明乙醇可能引起了細胞內(nèi)部的變化，如細胞核不規(guī)整和空泡的增加，對菌絲生長和分生孢子形成產(chǎn)生抑制作用，并且這種抑制作用隨著乙醇含量的增加而顯著增強。

2.3 有機酸對黃曲霉SU-16 生長的影響

有機酸是黃酒發(fā)酵過程中重要的呈味和呈香物質(zhì)，同時具有一定的抑制雜菌的作用[15]，總酸含量不斷增加，其中含量最多的有機酸為乳酸和乙酸[32]，乳酸占到總酸含量的75.30%，乙酸占到總酸的8.59%。乳酸和乙酸對黃曲霉SU-16 生長的影響如表4和圖6所示，隨著乳酸和乙酸濃度的增加，黃曲霉SU-16 的生長均呈下降趨勢，與對照組（0 g/L）相比，添加乳酸和乙酸均對菌落生長和生物量產(chǎn)生顯著影響（P<0.05），然而乳酸的添加不能完全抑制到孢子的萌發(fā)，當乙酸≥4 g/L 時，孢子不能萌發(fā)，生物量不斷下降，因此，可以確定乳酸和乙酸的添加對黃曲霉SU-16 的生長具有顯著影響，同時黃曲霉SU-16 對乳酸的耐受大于8 g/L，對乙酸的耐受界于2～4 g/L 之間。

圖6 有機酸對黃曲霉SU-16 生物量的影響Fig.6 Effects of organic acid on the growth of A.flavus SU-16

表4 有機酸對黃曲霉SU-16 生長的影響Table 4 Effects of organic acid on the growth of A.flavus SU-16

有機酸不同于強酸，以非解離形式存在，這種形態(tài)可以自由滲透到微生物質(zhì)膜中，進而產(chǎn)生胞內(nèi)酸化抑制微生物生長[33]。乙酸的毒性作用嚴重影響微生物生長與物質(zhì)代謝過程，Casey 等[15]研究顯示乙酸能夠抑制釀酒酵母對葡萄糖與木糖的利用，從而抑制其生長；León 等[34]研究了不同濃度乙酸和乳酸對黃曲霉的影響，結果顯示非產(chǎn)毒黃曲霉對乙酸的耐受濃度為41.6 mmol/L （約2.498 g/L），對乳酸耐受濃度為357.7 mmol/L（約32.222 g/L）[35]，以上研究結果與黃曲霉SU-16 乙酸耐受性相似，而乳酸耐受性仍有待進一步探究；同時鄧楠[35]研究了釀酒酵母的乳酸耐受機制，結果顯示當乳酸質(zhì)量濃度為40 g/L 時，嚴重影響到了釀酒酵母的產(chǎn)乙醇代謝特性[36]，說明乙酸對菌株的毒害作用遠遠強于乳酸。

2.4 間歇通氧對黃曲霉SU-16 生長的影響

黃酒發(fā)酵過程中會通過間歇開耙來為微生物提供一定的氧氣，因此采用搖瓶培養(yǎng)以及間歇搖瓶培養(yǎng)的方式探究通氧量對黃曲霉SU-16 生長的影響，如圖7所示，在搖瓶培養(yǎng)條件下24～36 h時，黃曲霉SU-16 的生物量快速增加，之后緩慢增加。而在間歇搖瓶培養(yǎng)條件下36～48 h 時，孢子萌發(fā)開始產(chǎn)生大量菌絲，生物量快速增加。因此通氧量會影響到黃曲霉SU-16 孢子的萌發(fā)速率以及菌絲生長的速率，然而120 h 時2 種培養(yǎng)條件下黃曲霉SU-16 生物量差異不顯著，由此可以推斷黃酒發(fā)酵的微氧環(huán)境會對黃曲霉的生長速率產(chǎn)生一定影響，然而對最終生物量影響不顯著（P＞0.05），說明間歇通氧的方式可以滿足黃曲霉生長所需氧氣量。因此，通氧量不是影響黃酒發(fā)酵體系中黃曲霉生長的主要因素。蔡琪琪等[28]探究了溶氧量對紅曲霉生長的影響，結果顯示在封壇后發(fā)酵體系中殘留的氧氣仍可以滿足紅曲霉的生長，結果與本試驗一致。因此可以確定發(fā)酵環(huán)境中的乙醇和有機酸類物質(zhì)是影響黃曲霉生長的主要因素。

圖7 通氧量對黃曲霉SU-16 生物量的影響Fig.7 Effect of oxygen supply on biomass of A.flavus SU-16

3 結論與討論

黃曲霉被廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn)過程中以加快發(fā)酵的進行，對黃酒的發(fā)酵至關重要。生物量是表征微生物生長情況的重要指標，運用qPCR 方法對黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉進行定量分析，結果顯示在0～24 h 這段時間內(nèi)，黃曲霉生物量的變化最大，然而也只是增加了1 個數(shù)量級，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵醪液中乙醇和酸度含量上升（圖1），嚴重抑制了黃曲霉的生長和代謝，使其開始趨于不斷下降的趨勢，因此制曲階段是黃曲霉生長的必要階段，而發(fā)酵階段不利于黃曲霉的生長?；诎―GGE、高通量測序、宏基因組測序等在內(nèi)的免培法研究黃酒發(fā)酵環(huán)境中微生物種群結構的結果表明，黃曲霉是黃酒發(fā)酵過程中真菌群落結構組成中的優(yōu)勢物種[5-6]，其在黃酒發(fā)酵過程中的生態(tài)學意義、功能信息已有大量報道[6，33]，研究普遍發(fā)現(xiàn)，霉菌呈先減少后增加的變化趨勢[6，37]，其中曲霉屬占到霉菌的94%～99%；然而，與以往的研究結果不同，基于qPCR 檢測黃曲霉SU-16 的結果表明，黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉的生物量一直處于較低水平，呈先增加后減少的趨勢，這主要是由于高通量測序表示物種的相對豐度，受到整體微生物含量的影響（例如：黃酒發(fā)酵初期黃酒酵母快速增加，隨著發(fā)酵時間的延長黃酒酵母急劇減少，對物種相對豐度影響較大），而qPCR 表示物種的絕對含量，不受其它物種的影響。同時，已有大量研究報道的白酒釀造微生物相關的研究也證明了這一點，基于擴增子測序和宏基因組測序報道的部分物種的豐度與其絕對定量結果存在明顯差異[9，38]。因此，發(fā)酵環(huán)境中微生物的研究不能脫離微生物的生長情況，基于免培法的測序手段解析發(fā)酵過程中微生物物種組成、功能信息等的研究存在一定的缺陷[39-40]。

通過發(fā)酵間歇通氧以及發(fā)酵代謝產(chǎn)物（乙醇和有機酸） 對黃曲霉SU-16 的生長影響探究，結果表明黃酒發(fā)酵過程中間歇通氧可以滿足黃曲霉SU-16 的生長耗氧需求，乙醇、乳酸和乙酸均對黃曲霉SU-16 的生長有影響，其中乙醇為3%vol，乳酸為2 g/L，以及乙酸為2 g/L 時即影響顯著，主要表現(xiàn)為影響了孢子萌發(fā)和菌絲生長。微生物的脅迫作用一方面通過改變細胞膜結構或者線粒體活力[30]，一方面通過滲透作用引起細胞死亡[33]，隨著發(fā)酵時間的延長，乙醇和有機酸不斷積累，然而微生物耐受能力有限，黃曲霉SU-16 對于乙醇的耐受能力為5%vol，在發(fā)酵48 h，乙醇含量達到11.24% ± 0.74%vol，此時乙醇含量超過黃曲霉SU-16 的耐受能力，所以生物量開始不斷下降；黃曲霉SU-16 對乳酸的耐受能力>8 g/L，對乙酸的耐受能力界于2～4 g/L，黃酒發(fā)酵過程中乳酸呈先快速增加后緩慢增加的趨勢，發(fā)酵結束時達到（5.57 ± 0.20）g/L，乙酸呈先升后降的趨勢，在120 h 時最高達到（0.56 ± 0.02）g/L，因此在發(fā)酵過程中乙醇起到主要抑制黃曲霉生長的作用。乙醇和弱酸對黃曲霉生長影響的分子機制仍有待進一步的研究，以上研究結果可為黃酒發(fā)酵的精準調(diào)控提供一定的指導，同時對其它微生物的相關研究具有借鑒意義。