田苗苗, 郭佳婧*, 劉 娟, 單 楊*
(1. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖南省果蔬加工與質(zhì)量安全國際科技創(chuàng)新合作基地,湖南 長沙 410125;2. 湖南大學(xué) 隆平分院,長沙 410082)
柑橘是世界上產(chǎn)量最大的水果之一,我國柑橘種植面積位居世界前列,柑橘因具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特口感而廣受歡迎[1]。 類黃酮是柑橘中一種重要的次生代謝產(chǎn)物,其中槲皮素(3′,4′,3,5,7-五羥基黃酮,又名櫟精、槲黃素)是柑橘類黃酮中重要的一種組分,具有抗菌[2]、抗炎[3]和抗氧化[4]等生物學(xué)活性,并且在預(yù)防和治療各種慢性疾病方面具有廣泛的應(yīng)用前景[5]。 但是,由于槲皮素水溶性和脂溶性較差,導(dǎo)致其在人體小腸表面不易被吸收、生物利用度較低,從而限制了其廣泛應(yīng)用[6]。
研究表明,甲基化修飾可以提高槲皮素分子的代謝穩(wěn)定性和脂溶性,進(jìn)而提高其生物利用度[7];4′-O-甲基槲皮素(檉柳黃素)的抗氧化活性是槲皮素糖苷的3 倍, 且與槲皮素相比其抗炎活性提高了80%[8];3′-O-甲基槲皮素(異鼠李素)可以通過抑制脂多糖誘導(dǎo)的活性氧蛋白的產(chǎn)生而防止細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)[9],Ader 等通過在豬體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),證明異鼠李素比槲皮素更有利于腸道吸收,生物利用度由原來的0.54%提高到17.00%[10]。 但是槲皮素甲基化衍生物在植物中含量極少,目前主要通過化學(xué)合成和微生物合成兩種方式獲取,其中化學(xué)合成需要高溫高壓等反應(yīng)條件并伴有有毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生[11],微生物合成由于生產(chǎn)周期較短、生產(chǎn)過程綠色安全且有利于大規(guī)模生產(chǎn)等多種優(yōu)勢而備受關(guān)注[12]。
在植物體內(nèi), 類黃酮的O-甲基化主要通過類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶(FOMT) 催化甲基從S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)向類黃酮羥基的轉(zhuǎn)移[13]。 不同來源的FOMT 可以催化合成不同的甲基化類黃酮,如楊樹來源的POMT7 可以催化芹菜素合成7-O-甲基芹菜素[14],大豆來源的SOMT2 可以催化柚皮素合成異櫻花素等[15]。 同時(shí)不同來源的FOMT 可甲基化不同位點(diǎn)合成不同的甲基化類黃酮,如槲皮素可在F4′-OMT、F7-OMT、F3′-OMT 和F3-OMT 的催化下分別合成檉柳黃素、鼠李素、異鼠李素和3-O-甲基槲皮素 (見圖1)。 作者篩選出11種不同來源的FOMT,并根據(jù)催化位點(diǎn)對其進(jìn)行分類,將其分別導(dǎo)入大腸桿菌中構(gòu)建相應(yīng)的工程菌,以槲皮素為底物進(jìn)行發(fā)酵,合成槲皮素甲基化衍生物。
圖1 單O-甲基槲皮素Fig. 1 Mono O-methylquercetin
1.1.1菌株與質(zhì)粒E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3):作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。 pETDuet-1、pGEX-4T-1:上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。 PCR 引物以及優(yōu)化后的基因序列:上海生工生物工程股份有限公司合成。 基因來源及登錄號見表1。
表1 FOMT 基因來源Table 1 Source of FOMT gene
1.1.2試劑 蛋白胨、酵母粉:英國OXOID 公司產(chǎn)品;乙酸乙酯、甘油、氨芐青霉素鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、甲醇、二甲基亞砜(DMSO)、Tris-HCl 緩沖液:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG):上海瑞永生物科技公司產(chǎn)品;槲皮素、異鼠李素、4′,7-二甲氧基槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品:成都德斯特生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;檉柳黃素、鼠李素、3-O-甲基槲皮素液相標(biāo)準(zhǔn)品: 上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品;限制性核酸內(nèi)切酶、一步克隆試劑盒、膠回收試劑盒、2×Phanta Max Master Mix高保真DNA 聚合酶以及質(zhì)粒提取試劑盒: 南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品;5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、彩虹130 廣譜蛋白質(zhì)maker、考馬斯亮藍(lán)快速染色液:索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。
TB 液體培養(yǎng)基:1.2 g/dL 的胰蛋白胨,2.4g/dL的酵母提取物,0.4 mL/dL 的甘油,17 mmol/L KH2PO4,72 mmol/L K2HPO4。并按要求添加氨芐青霉素(Amp)至終質(zhì)量濃度為100 mg/L。
TOne 96 PCR 儀: 德國Biometra 公司產(chǎn)品;核酸電泳儀: 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀: 英國UVItec 公司產(chǎn)品;5424R 小型臺式高速離心機(jī): 德國Eppendorf 公司產(chǎn)品;AcpitiJ-26XP 離心機(jī): 美國Beckman 公司產(chǎn)品;SYNERGY H1 酶標(biāo)儀: 美國Bio Tek 公司產(chǎn)品;LDZM-80L-III高壓滅菌鍋: 上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;DZKW-4電熱恒溫水浴鍋:北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品;ZQPZ-115 振蕩培養(yǎng)箱:天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;H-class 超高效液相色譜儀:美國Waters 公 司 產(chǎn) 品;qtof6550 型 質(zhì) 譜 儀: 美 國Agilent Technologies 公司產(chǎn)品;蛋白質(zhì)電泳儀:美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品。
1.3.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建 DNA 片段按照2×Phanta Max Master Mix 試劑盒方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后按照DNA 膠回收試劑盒方法進(jìn)行基因的回收,使用一步克隆試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建, 得到重組質(zhì)粒pETDuet-CrOMT6、pETDuet-MpOMT4、pETDuet-ObFOMT3、pETDuet-PaCOMT4、pETDuet-OsNOMT、pETDuet-POMT7、pETDuet-MpOMT1A、pETDuet-SaOMT2、pGEX-4TShMOMT3、pGEX-4T-ROMT9、pGEX-4T-SOMT9,使用E.coliDH5α 進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增,使用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)化,質(zhì)粒提取后由上海生工生物工程股份有限公司測序驗(yàn)證。
1.3.2SDS-PAGE 分析FOMT 蛋白的異源表達(dá)測序后序列比對成功的質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),從過夜活化的平板上挑取單菌落于含Amp (質(zhì)量濃度為100 mg/L)的TB 液體培養(yǎng)基中于37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8, 添加IPTG 至終物質(zhì)的量濃度為0.2 mmol/L 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá), 取誘導(dǎo)8 h 發(fā)酵液于4℃、5 000 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞,隨后加入等比例PBS 緩沖液重懸, 用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞,超聲功率為300 W, 超聲2 s 后停8 s 繼續(xù)超聲7 min,整個(gè)過程在冰上進(jìn)行。 超聲完畢后,將細(xì)胞破碎液于4 ℃、5 000 r/min 離心5 min,取離心后的上清液按照體積比4∶1 比例加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液,混勻后于沸水中水浴加熱5 min 后于冰上冷卻,離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。
1.3.3單O-甲基槲皮素的合成 上述構(gòu)建得到4株含F(xiàn)4′-OMT、4 株含F(xiàn)7-OMT、2 株含F(xiàn)3′-OMT 和1 株含F(xiàn)3-OMT 的大腸桿菌工程菌, 并分別以槲皮素為底物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)分別合成4種單O-甲基槲皮素(檉柳黃素、鼠李素、異鼠李素和3-O-甲基槲皮素)。 工程菌的培養(yǎng)方法如下:從過夜培養(yǎng)的平板上挑取單菌落至5 mL 含Amp(質(zhì)量濃度為100 mg/L)的TB 液體培養(yǎng)基中, 然后置于37 ℃、220 r/min 條件下過夜培養(yǎng)得到種子液, 按照體積分?jǐn)?shù)為1%接種量轉(zhuǎn)接至20 mL 含有Amp(質(zhì)量濃度為100 mg/L)的TB 液體培養(yǎng)基中于37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8,之后添加IPTG 至終物質(zhì)的量濃度為0.2 mmol/L,槲皮素底物(溶于DMSO 中)至終質(zhì)量濃度為100 mg/L, 于23 ℃、220 r/min 培養(yǎng)10 h,然后使用UPLC 進(jìn)行分析。
1.3.4二O-甲基槲皮素的合成 4′,7-二甲氧基槲皮素是槲皮素分子經(jīng)4′-OH 和7-OH 甲基化后的產(chǎn)物,屬于二O-甲基槲皮素中的一種。 由于其分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)甲氧基,因此其甲基化過程需要兩步反應(yīng)(見圖2)。 在本研究中,4′,7-二甲氧基槲皮素的合成途徑被分為兩個(gè)基本的大腸桿菌細(xì)胞模塊, 模塊1 為OsNOMT 催化的7-OH 的甲基化,模塊2 為MpOMT4 催化的4′-OH 的甲基化; 先將模塊1 的細(xì)胞用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液稀釋至相應(yīng)細(xì)胞質(zhì)量濃度分別為8、16、24、32 g/L(以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)), 隨后添加槲皮素底物, 于23 ℃、220 r/min 下反應(yīng)10 h,當(dāng)體系中積累到一定量的鼠李素后, 再按模塊1 與模塊2 質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 的比例添加模塊2 的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化(槲皮素底物終質(zhì)量濃度為100 mg/L), 反應(yīng)10 h 后取發(fā)酵液使用UPLC 進(jìn)行分析。
圖2 槲皮素到4′,7-二甲氧基槲皮素的轉(zhuǎn)化Fig. 2 Transformation of quercetin into 4′,7-dimethoxyquercetin
全細(xì)胞催化劑的制備參考Wang 等[16]方法,并稍有修改,具體方法如下:大腸桿菌工程菌的活化方法參考1.3.2,將活化后的種子液按照體積分?jǐn)?shù)為1%接種量轉(zhuǎn)接至含有Amp(質(zhì)量濃度為100 mg/L)的TB 液體培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8, 添加終物質(zhì)的量濃度0.2 mmol/L 的IPTG, 于23 ℃、220 r/min 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)12 h;然后于5 000g、15 ℃離心10 min, 收集菌體細(xì)胞,用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液沖洗后重懸至細(xì)胞質(zhì)量濃度為8、16、24、32 g/L(以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì),細(xì)胞干質(zhì)量與OD600之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系為OD600為1時(shí)代表細(xì)胞質(zhì)量濃度為0.35 g/L)[17]。
1.3.5產(chǎn)物的分析與鑒定 取發(fā)酵液等比例加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取,靜置后取上清液經(jīng)氮吹濃縮后加甲醇重溶, 經(jīng)0.22 μm 尼龍濾膜過濾后進(jìn)行分析。 UPLC 檢測條件: 使用安捷倫C18柱(4.6 mm×150 mm)、PDA 檢測器進(jìn)行檢測。 檢測條件:梯度洗脫;A 相為乙腈,B 相為體積分?jǐn)?shù)0.4%醋酸水溶液,0~20 min,B 相由20%升至85%(體積分?jǐn)?shù));流量為0.2 mL/min;檢測波長為254 nm。LC-MS 檢測條件:液相色譜按照上述進(jìn)行, 質(zhì)譜分析采用安捷倫qtof6550 系統(tǒng),在100~1 200m/z、電噴霧離子源負(fù)離子模式、電壓3 200 V 下進(jìn)行質(zhì)譜掃描分析。
在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)異源蛋白時(shí)存在密碼子偏好性問題, 若存在稀有堿基或AT 含量過高均會導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻,密碼子可能發(fā)生錯配,使得外源蛋白難以在大腸桿菌體內(nèi)高效表達(dá)[18]。 因此對不同來源的FOMT 基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,可有效提高其表達(dá)水平。 表2 為基因優(yōu)化后的各項(xiàng)指數(shù),其中密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)是用來反應(yīng)編碼區(qū)的同義密碼子和最佳密碼子使用頻率的相符合程度,一般可用CAI 來評估外源基因在宿主內(nèi)的表達(dá)水平,其取值在0~1.00; 當(dāng)CAI 為0.80~1.00 時(shí)認(rèn)為基因與宿主的偏好性較高。 GC 含量的最佳百分比為40.00%~60.00%。
表2 基因優(yōu)化后各項(xiàng)指標(biāo)Table 2 Indexes after gene optimization
使用SDS-PAGE 對大腸桿菌工程菌誘導(dǎo)8 h后細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測,SDS-PAGE 結(jié)果如圖3 所示。 結(jié)果表明,表達(dá)CrOMT6(4.07×104)、MpOMT4 (3.78×104)、ObFOMT3 (3.68×104)、PaCOMT4(4.15×104)、OsNOMT(4.00×104)以及帶有GST 標(biāo) 簽 的ROMT9(6.57×104)、SOMT9(5.36×104)和ShMOMT3(6.66×104)蛋白的重組大腸桿菌中檢測到了符合目的蛋白相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)條帶且條帶較亮,說明其在大腸桿菌中能夠可溶表達(dá)且蛋白質(zhì)表達(dá)量高。 對含有POMT7 (3.96×104)和MpOMT1A(3.80×104)的菌株中的可溶性蛋白進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量極少;而含有SaOMT2(3.75×104)的重組菌株中的蛋白質(zhì)幾乎不能可溶性表達(dá),在后期的發(fā)酵中也無法發(fā)揮催化活性。
圖3 SDS-PAGE 分析FOMT 蛋白表達(dá)Fig. 3 Analysis of FOMT protein expression by SDSPAGE
構(gòu)建了含有11種不同來源FOMT 的大腸桿菌工程菌, 并根據(jù)FOMT 催化位點(diǎn)對其進(jìn)行分類,其中包括4種F4′-OMT、4種F7-OMT、2種F3′-OMT和1種F3-OMT, 重組菌株按上述方法加入槲皮素底物至終質(zhì)量濃度為100 mg/L 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),隨后使用UPLC 對發(fā)酵液進(jìn)行分析(見圖4),并分別與檉柳黃素、鼠李素、異鼠李素以及3-O-甲基槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果進(jìn)行對比。 樣品檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),含不同催化位點(diǎn)FOMT 的重組菌中均檢測到與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間相同的產(chǎn)物峰。 其中4種含F(xiàn)4′-OMT 的重組菌中, 僅有PaCOMT4 沒有檢測到檉柳黃素;4種含F(xiàn)7-OMT 的重組菌中, 除SaOMT2 外,在11.2 min 處均檢測到鼠李素;其余3 株工程菌分別檢測到異鼠李素、3-O-甲基槲皮素相應(yīng)峰。 質(zhì)譜分析顯示4種產(chǎn)物與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品離子峰位置一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
重組菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后通過UPLC 檢測并計(jì)算產(chǎn) 量 (見 圖5)。 結(jié) 果 表 明,4種F4′-OMT 中,MpOMT4 活性最高, 合成了31.17 mg/L 檉柳黃素,CrOMT6 和ObFOMT3 催化合成檉柳黃素產(chǎn)量分別為4.12 mg/L 和12.18 mg/L;4種F7-OMT 中,OsNOMT 最高催化合成了11.17 mg/L 鼠李素;兩種F3′-OMT(ROMT9 和SOMT9)催化合成的異鼠李素的產(chǎn)量分別為8.72 mg/L 和8.90 mg/L;ShMOMT3 催化合成3-O-甲基槲皮素的產(chǎn)量為52.95 mg/L。在表達(dá)鈍磷紫背苔來源的PaCOMT4 和阿維菌素鏈霉菌來源的SaOMT2 的大腸桿菌工程菌發(fā)酵液中未檢測到相應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物,這可能是因?yàn)槠湓诖竽c桿菌中不能有效可溶性表達(dá),產(chǎn)生蛋白質(zhì)包涵體而無法發(fā)揮催化活性[19]。而且,研究表明FOMT 存在底物偏好性差異,不同來源的FOMT 對槲皮素底物的親和性可能會影響其催化效率,從而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量之間的差異[20]。
圖5 不同來源FOMT 發(fā)酵結(jié)果Fig. 5 Fermentation results of FOMT from different sources
2.4.1不同添加順序?qū)?′,7-二甲氧基槲皮素產(chǎn)量的影響 按照大腸桿菌共培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),通過改變模塊1(OsNOMT)與模塊2(MpOMT4)細(xì)胞前后添加順序, 探究4′,7-二甲氧基槲皮素合成產(chǎn)量的變化。在細(xì)胞質(zhì)量濃度為16 g/L(以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)), 菌體質(zhì)量比為1∶1 條件下進(jìn)行發(fā)酵 (見圖6)。 結(jié)果表明,MpOMT4 可利用鼠李素作為底物,而OsNOMT 不可利用檉柳黃素作為底物。 當(dāng)細(xì)胞質(zhì)量濃度為16 g/L(以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)),模塊1 與模塊2質(zhì)量比為1∶1 時(shí), 先將模塊1 細(xì)胞添加底物, 反應(yīng)10 h 后再添加模塊2 細(xì)胞進(jìn)行催化, 可以得到15.75 mg/L 4′,7-二甲氧基槲皮素;若先添加模塊2細(xì)胞,催化4′-OH 甲基化,再添加模塊1 細(xì)胞進(jìn)行催化, 發(fā)酵液中未檢測到4′,7-二甲氧基槲皮素的合成。這可能是由于槲皮素4′-OH 的甲基化導(dǎo)致其分子構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致OsNOMT 無法與其結(jié)合發(fā)生催化活性。 研究發(fā)現(xiàn)FOMT 具有嚴(yán)格的催化位點(diǎn)特異性和底物特異性,一種FOMT 只能特異性地結(jié)合某一類類黃酮底物。 Kim 等通過在大腸桿菌中構(gòu)建RSOMT 共表達(dá)載體發(fā)現(xiàn),ROMT9 不能以4′-甲氧基槲皮素為底物,而SOMT2 能夠以3′-甲氧基槲皮素為底物[21]。 根據(jù)國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的關(guān)于多種植物FOMT 晶體結(jié)構(gòu)分析表明, 不同植物來源的FOMT 底物特異性主要是與其結(jié)合的類黃酮底物結(jié)合域之間的差異而引起的[22]。
圖6 不同添加順序?qū)?′,7-二甲氧基槲皮素產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effects of different addition sequences on 4′,7-dimethoxyquercetin yield
D 和4T 為質(zhì)粒載體名稱縮寫。
隨后通過UPLC 對發(fā)酵液進(jìn)行分析 (見圖7)。結(jié)果表明樣品中出現(xiàn)與4′,7-二甲氧基槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的峰, 隨后按照本文1.3.5 中的方法對產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜掃描, 發(fā)現(xiàn)樣品中存在與4′,7-二甲氧基槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品一致的離子峰,相對分子質(zhì)量檢測結(jié)果一致(見圖8)。
圖7 4′,7-二甲氧基槲皮素UPLC 檢測結(jié)果Fig. 7 Determination results of 4′,7-dimethoxyquercetin by UPLC
圖8 4′,7-二甲氧基槲皮素LC-MS 檢測結(jié)果Fig. 8 Determination results of 4′,7-dimethoxyquercetin by LC-MS
2.4.2不同緩沖液對4′,7-二甲氧基槲皮素產(chǎn)量的影響 為了探究不同緩沖液和pH 對發(fā)酵產(chǎn)量的影響,選取PBS 6.0(pH 6.0)、PBS 7.0(pH 7.0)、PBS 8.0(pH 8.0)、50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液進(jìn)行對比;在細(xì)胞質(zhì)量濃度為16 g/L(以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)),模塊1 與模塊2 質(zhì)量比為1∶1 條件下進(jìn)行發(fā)酵(見圖9)。 結(jié)果表明,在50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液中4′,7-二甲氧基槲皮素產(chǎn)量最高, 為15.75 mg/L; 在3種不同pH 的PBS 緩沖液中發(fā)酵結(jié)果顯示, 在PBS 6.0、PBS 7.0、PBS 8.0 緩沖液中4′,7-二甲氧基槲皮素質(zhì)量濃度分別為10.57、9.64、5.68 mg/L。
圖9 不同緩沖液對4′,7-二甲氧基槲皮素產(chǎn)量影響Fig. 9 Effects of different buffers on 4′,7-dimethoxyquercetin yield
2.4.3培養(yǎng)體系的優(yōu)化 為了提高4′,7-二甲氧基槲皮素產(chǎn)量, 通過調(diào)整培養(yǎng)體系中模塊1 與模塊2細(xì)胞的比例和生物量對其進(jìn)行優(yōu)化(見圖10)。菌體細(xì)胞質(zhì)量濃度分別設(shè)置為8、16、24、32 g/L (以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì));模塊1 與模塊2 質(zhì)量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。 結(jié)果表明,隨著菌體細(xì)胞質(zhì)量濃度的增加,4′,7-二甲氧基槲皮素產(chǎn)量呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢;在槲皮素底物添加量(質(zhì)量濃度)為100 mg/L 情況下,當(dāng)模塊1 與模塊2 質(zhì)量比為1∶2,細(xì)胞質(zhì)量濃度為24 g/L(以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì))時(shí),4′,7-二甲氧基槲皮素產(chǎn)量最高,為21.56 mg/L。
圖10 培養(yǎng)體系的優(yōu)化Fig. 10 Optimization of cultivation system
一些具有生物活性的O-甲基黃酮類化合物,如鼠李秦素、4′,7-二甲氧基槲皮素等, 在不同的芳香環(huán)和類黃酮骨架中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的甲基[23]。由于FOMT 具有嚴(yán)格的區(qū)域特異性,所以多甲氧基類黃酮的生物合成需要兩個(gè)以上的FOMT 和甲基化反應(yīng)[24]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)試圖在單個(gè)微生物中表達(dá)多種酶以構(gòu)建體內(nèi)全細(xì)胞催化劑時(shí),經(jīng)常會出現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)負(fù)擔(dān)和氧化還原平衡等問題[25];為了解決這些問題,4′,7-二甲氧基槲皮素的生物催化途徑被分為兩個(gè)基本的大腸桿菌細(xì)胞模塊, 模塊1 為OsNOMT 催 化 的7-OH 的 甲 基 化, 模 塊2 為MpOMT4 催化的4′-OH 的甲基化。先將模塊1 的細(xì)胞添加槲皮素底物,當(dāng)發(fā)酵液中積累了一定量的鼠李素后,再添加模塊2 的細(xì)胞,用以催化鼠李素轉(zhuǎn)化合成4′,7-二甲氧基槲皮素, 并通過對發(fā)酵體系進(jìn)行優(yōu)化, 最高合成了21.56 mg/L 的4′,7-二甲氧基槲皮素。
研究表明,甲基化修飾可提高槲皮素分子的藥理活性和生物利用度,然而由于甲基化槲皮素的植物獲取與化學(xué)合成具有諸多限制,利用微生物表達(dá)FOMT 催化槲皮素轉(zhuǎn)化為甲基化槲皮素因具有生產(chǎn)周期短、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。 本研究中通過構(gòu)建11種含有不同來源FOMT 的大腸桿菌工程菌,成功合成了4種單O-甲基槲皮素(檉柳黃素、鼠李素、異鼠李素和3-O-甲基槲皮素),最高產(chǎn)量分別為31.17、11.17、8.90 、52.95 mg/L; 另外還通過構(gòu)建大腸桿菌共培養(yǎng)體系成功合成了4′,7-二甲氧基槲皮素,在槲皮素底物質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)4′,7-二甲氧基槲皮素產(chǎn)量最高為21.56 mg/L,為解決在單個(gè)微生物中表達(dá)多種酶導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)負(fù)擔(dān)和氧化還原平衡等問題以及為合成不同甲基化黃酮或多甲氧基黃酮提供了科學(xué)參考。