米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向進化、高效表達與應(yīng)用

李延嘯， 馬俊文， 閆巧娟， 武 建， 張 偉， 江正強

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院/中國輕工業(yè)食品生物工程重點實驗室， 北京 100083；2. 北京瓜爾潤科技股份有限公司，北京 100101；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；4. 南京財經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023）

魔芋粉是一種來源于魔芋（Amorophophallus konjac）塊莖的天然植物膠，具有多種功能活性，如控制餐后血糖、增強飽腹感、潤腸通便等，被國際上譽為“十大健康食品”之一[1]。 魔芋粉具有良好的持水力、增稠性和穩(wěn)定性，廣泛用于多種食品中，以改善食品品質(zhì)。 魔芋粉的主要成分是葡甘露聚糖，是一種由葡萄糖和甘露糖 （物質(zhì)的量比為1.0∶1.6）通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的線性多糖，可作為生產(chǎn)甘露寡糖的重要原料[2]。 魔芋粉在低濃度下即可形成高黏度凝膠狀溶液，阻礙了水解時體系內(nèi)分子移動和傳質(zhì)傳熱，嚴重降低了魔芋甘露寡糖的生產(chǎn)效率[3]。 因此，需要開發(fā)一種能夠高效水解高濃度魔芋粉的生產(chǎn)方法，以提高魔芋甘露寡糖的生產(chǎn)效率。

與化學(xué)和物理降解法相比，酶法水解魔芋粉生產(chǎn)甘露寡糖具有條件溫和、過程可控、綠色環(huán)保等多種優(yōu)勢， 是最具應(yīng)用潛力的甘露寡糖生產(chǎn)方法。酶法生產(chǎn)過程中，最重要的酶是甘露聚糖酶（mannanase，EC 3.2.1.78）， 能夠隨機水解甘露聚糖主鏈中的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生低聚合度的甘露寡糖[4]。 目前，已有一些甘露聚糖酶用于水解魔芋粉生產(chǎn)甘露寡糖，但這些甘露聚糖酶水解時所用底物濃度通常較低。例如白曲霉（Aspergillus kawachii）來源的甘露聚糖酶水解10 mg/mL 魔芋粉， 可以產(chǎn)生聚合度2~4的甘露寡糖，產(chǎn)物重均分子量約為2 000[5]；枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis） 來源的甘露聚糖酶水解50 mg/mL 魔芋粉，可以產(chǎn)生聚合度大于2 的一系列甘露寡糖[6]。 因此，發(fā)掘一種能夠高效水解魔芋粉的甘露聚糖酶，對魔芋甘露寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要。

定向進化、理性設(shè)計等分子改造手段是提高甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)和催化效率的有效手段。 白曲霉甘露聚糖酶通過理性設(shè)計實現(xiàn)了分子改造，所得突變體D273-V308 的最適溫度提高了5 ℃，75 ℃下的半衰期增加了73.9%[7]。 通過理性設(shè)計對黑曲霉（A. niger）甘露聚糖酶進行了分子改造，使其水解特性發(fā)生明顯改變，產(chǎn)物中高聚合度的寡糖組分含量明顯增多[8]。 通過定向進化對米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）甘露聚糖酶進行了分子改造，所得突變體與野生型甘露聚糖酶相比， 最適pH 降低2.5，最適溫度提高10 ℃， 在酸性高溫下的催化效率提高3 倍以上[9]。 此外，高產(chǎn)的甘露聚糖酶是工業(yè)化生產(chǎn)甘露寡糖的前提與基礎(chǔ)。 目前，已有一些甘露聚糖酶在畢赤酵母（Pichia pastoris） 中實現(xiàn)了高效表達，如來源于樟絨枝霉和枯草芽孢桿菌的McMan5B和Bman26-MEIR[10-11]。 由于水解特性和催化效率不足，這些甘露聚糖酶不適合用于水解魔芋粉生產(chǎn)甘露寡糖。 因此，對現(xiàn)有甘露聚糖酶進行分子改造，實現(xiàn)甘露聚糖酶的高效表達，提高其對魔芋粉的水解效率，對魔芋甘露寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

米黑根毛霉是一種重要的絲狀真菌，能夠產(chǎn)生多種脂肪酶、蛋白酶和半纖維素酶[12-14]。 作者所在團隊前期研究中，從米黑根毛霉中發(fā)掘了一個糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH）5 家族的甘露聚糖酶，該酶具有優(yōu)良的酶學(xué)特性和水解特性，水解魔芋粉主要產(chǎn)生聚合度2~5 的甘露寡糖，在魔芋甘露寡糖生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用潛力[15]。 作者通過定向進化技術(shù)對該酶進行分子改造，以期提高該酶對魔芋粉的水解效率， 并將該酶在畢赤酵母中高效表達，為魔芋甘露寡糖的高效生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

1.2 試劑與儀器

甘露寡糖（甘露二糖、甘露三塘、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖）、DP10 葡聚糖：愛爾蘭Megazyme公司產(chǎn)品；槐豆膠（LBG）：美國Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；魔芋粉（葡甘露聚糖質(zhì)量分數(shù)≥80%，甘露糖與葡萄糖物質(zhì)的量比為1.62∶1.00）： 湖北強森魔芋科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

1260 Infinity II system 高效液相色譜儀、G7162A 型示差折光檢測器： 美國Agilent 公司產(chǎn)品；Shodex Sugar KS-802 色譜柱：日本Shodex 公司產(chǎn)品；?KTA 蛋白純化系統(tǒng)： 美國GE Healthcare 公司產(chǎn)品；100 L 發(fā)酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司產(chǎn)品。

1.3 甘露聚糖酶（RmMan5A）突變體文庫構(gòu)建

易 錯 PCR 利 用 引 物RmMan5AF（CGCGGATCCGCTTCTTCGTTTGTCCAGACAAG）和RmMan5AR （CCGCTCGAGCTACTTCTTGGCCATGG CATCAGC）， 以質(zhì)粒pET-28a-RmMan5A為模板進行擴增。 產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL 瓊脂糖凝膠回收后，用DNaseI 進行隨機片段化處理， 隨后用過酚/氯仿/異戊醇（體積比為25∶24∶1）和氯仿/異戊醇（體積比為24∶1）兩步抽提純化，得到隨機片段化后的DNA 片段。 以上述DNA 片段為模板，進行無引物重疊延伸PCR，得到重疊延伸PCR 產(chǎn)物。 再以上述重疊延伸PCR 產(chǎn)物為模板， 使用引物RmMan5AF 和RmMan5AR 進行PCR 擴增。 PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I 和XhoI 雙酶切，與載體pET-28a連接后電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），即得到甘露聚糖酶（RmMan5A）突變體文庫。

1.4 甘露聚糖酶（RmMan5A）突變體文庫高通量篩選

甘露聚糖酶（RmMan5A）突變體文庫的高通量篩選分為初篩和復(fù)篩。 首先，使用LBG-剛果紅平板法對突變體文庫進行初篩，篩選具有甘露聚糖酶活性的陽性克隆。 再利用LB 搖瓶培養(yǎng)基對陽性克隆進行復(fù)篩：將初篩獲得的陽性克隆接種于10 mL LB培養(yǎng)基中， 在37 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)至發(fā)酵液在600 nm 處的吸光度（OD600）達0.6~0.8，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG， 在30 ℃、200 r/min 下繼續(xù)培養(yǎng)4 h 誘導(dǎo)菌株產(chǎn)酶，離心（10 000g、5 min）收集菌體，經(jīng)超聲破壁獲得陽性克隆的粗酶液，測定粗酶液在pH 7.0、55 ℃下對魔芋粉的比酶活力， 并以比酶活力有所提高的突變體為正向突變體。

1.5 甘露聚糖酶突變體（RmMan5AM2）在大腸桿菌中表達與純化

重組大腸桿菌接種于10 mL 含有50 μg/mL 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中， 在37 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)過夜制備種子液。種子液以體積分數(shù)1%接種量接種于200 mL 相同的LB 培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600達0.6~0.8 后， 加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，在30 ℃、200 r/min 下誘導(dǎo)過夜。離心（10 000g、5 min） 收集菌體， 并用緩沖液A（20 mmol/L 磷 酸 緩 沖 液、pH 8.0，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑）懸浮菌體，超聲破壁，離心（10 000g、10 min）收集上清液（即粗酶液）。

利用Ni-NTA 親和層析柱對甘露聚糖酶進行純化。用緩沖液A 平衡親和層析柱，粗酶液以0.5 mL/min的流量上樣，分別用緩沖液A 和B（20 mmol/L 磷酸緩沖液、pH 8.0，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑）洗脫5 個柱體積，再用緩沖液C（20 mmol/L 磷酸緩沖 液、pH 8.0，300 mmol/L NaCl，200 mmol/L 咪 唑）洗脫目的蛋白。 洗脫過程在?KTA 蛋白純化系統(tǒng)上進行，流動相流量為1.0 mL/min。收集有酶活的組分后，在50 mmol/L 檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 7.0）中低溫透析過夜，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析蛋白質(zhì)純度。

肇慶市政府指定疏浚物處理項目由肇慶市國資委管理，肇慶市國資委委托城投公司組織公開招投標(biāo)。最終，方少瑜名下的廣州市安邦裝飾工程有限公司以約6500萬元中標(biāo)。

1.6 甘露聚糖酶酶活力和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

甘露聚糖酶酶活力的測定采用3，5-二硝基水楊 酸 法 （DNS 法）[16]， 以0.5 g/dL 槐 豆 膠 溶 液（50 mmol/L 檸檬酸-磷酸緩沖液、pH 7.0）作為底物，900 μL 底物與100 μL 用50 mmol/L 檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 7.0）適當(dāng)稀釋后的酶液混合在55 ℃下反應(yīng)10 min。加入1 mL DNS 試劑，沸水浴15 min 后加入1 mL 40 g/dL 酒石酸鉀鈉，冷卻至室溫后在540 nm下測定吸光度。 以甘露糖為標(biāo)準計算反應(yīng)生成還原糖的含量。 在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。

酶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定采用Lowry 等的方法，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準蛋白質(zhì)[17]。

1.7 甘露聚糖酶突變體（RmMan5AM2）的酶學(xué)性質(zhì)

1）最適pH 和pH 穩(wěn)定性的測定 在不同pH 下按照標(biāo)準方法測定突變體酶活力， 以最大值為100%，計算各pH 下的相對酶活力。所用緩沖液（50 mmol/L）包括檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 3.0~7.0）、醋酸緩沖液（pH 4.0~6.0）、磷酸緩沖液（pH 6.0~8.0）、Tirs-HCl 緩沖液 （pH 7.0~9.0）、CHES 緩沖液（pH 8.0~10.0） 和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 （pH 9.5~11.0）。用上述緩沖液適當(dāng)稀釋酶液后，置于50 ℃下處理30 min， 按照標(biāo)準方法測定不同pH 下的殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液為對照。

2）最適溫度和溫度穩(wěn)定性的測定 在30~90 ℃下按照標(biāo)準方法測定突變體酶活力， 以最大值為100%，計算不同溫度下的相對酶活力。用50 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 7.0）將酶液適當(dāng)稀釋后在不同溫度下保溫30 min，按照標(biāo)準方法測定不同溫度下的殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液為對照。

3）底物特異性的測定 以0.5 g/dL 槐豆膠、魔芋粉、瓜爾膠為底物，按照標(biāo)準方法測定甘露聚糖酶酶活力。 槐豆膠為底物時測定的酶活力為100%，分別計算甘露聚糖酶對不同底物的相對酶活力。

4）動力學(xué)參數(shù)的測定 以不同質(zhì)量濃度槐豆膠（1.0~6.0 mg/mL）、魔芋粉（9.0~35.0 mg/mL）和瓜爾膠（3.0~14.0 mg/mL）為底物，與適當(dāng)稀釋后的酶液混合均勻后，在最適條件下反應(yīng)5 min，按照標(biāo)準方法測定酶活力。利用Grafit 軟件計算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。

1.8 甘露聚糖酶突變體（RmMan5AM2）在畢赤酵母中表達和高密度發(fā)酵

PCR 擴增甘露聚糖酶突變體基因（RmMan5AM2）時，以RmMan5AM2F（CCATGTACG TAGCTTCTTCGTTTGTCCAGACAAG） 和RmMan5AM2R（CCGCCTAGGCTACTTCTTGGCCAT GGCATC）為引物，以質(zhì)粒pET-28a-RmMan5AM2為模板。 擴增產(chǎn)物用1 g/dL 瓊脂糖凝膠回收純化后，利用限制性內(nèi)切酶SnaB I 和AvrII 雙酶切， 與載體pPIC9k 連接后獲得質(zhì)粒pPIK9k-RmMan5AM2。將上述質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SalI 線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得重組菌株。

在不同質(zhì)量濃度遺傳霉素G418（1.0~4.0 mg/mL）下，對重組菌株進行高拷貝篩選，選取搖瓶發(fā)酵酶活力最高的重組菌株在100 L 發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵，整個過程包括種子液培養(yǎng)、分批發(fā)酵培養(yǎng)、甘油流加培養(yǎng)、100%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。 將酶活力最高的重組菌株接種于200 mL BMGY 培養(yǎng)基中， 在30℃、200 r/min 下培養(yǎng)過夜， 接種于3 L BMGY 培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)至OD600達10.0，得到種子液。種子液接種于裝有30 L BSM 培養(yǎng)基的100 L發(fā)酵罐內(nèi)， 在30 ℃、pH 4.0、600 r/min 下發(fā)酵至罐內(nèi)甘油耗盡后，開始流加50%（體積分數(shù)）甘油4~5 h；待發(fā)酵液OD600達180 后，停止流加甘油饑餓30 min；隨后流加100%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在30 ℃、pH 6.0、800 r/min 下繼續(xù)發(fā)酵168 h； 于不同時間點取樣，分析發(fā)酵液中甘露聚糖酶酶活力、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和菌體質(zhì)量濃度（單位體積發(fā)酵液酵母的濕質(zhì)量）的變化。

1.9 甘露聚糖酶突變體（RmMan5AM2）水解魔芋粉

甘露聚糖酶突變體以300 U/mL 加入500 mL檸檬酸-磷酸緩沖液（50 mmol/L、pH 7.0）中，在攪拌下加入150 g 魔芋粉， 置于50 ℃、200 r/min 下水解8 h，再沸水浴滅酶20 min，離心（10 000g、10 min）后取上清液凍干后即為魔芋甘露寡糖。

魔芋甘露寡糖（10 mg/mL）過膜（0.22 μm）后，用高效液相色譜- 示差折光檢測器（high performance liquid chromatography - differential refractive index detector，HPLC-RID）進行分析，色譜柱為Shodex Sugar KS-802（7.8 mm× 300 mm），柱溫為65 ℃，流動相為純水，流量為0.6 mL/min，以甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖和葡聚糖（PD10）為標(biāo)準品。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘露聚糖酶（RmMan5A）突變體文庫的高通量篩選

甘露聚糖酶突變體文庫含有12 000 多個克隆，隨機挑選10 個克隆進行測序分析， 結(jié)果表明該突變體文庫中的基因突變率為0.72%， 這一突變率略高于定向進化的推薦突變率 （2~5 bp/kp）[18]。 利用LBG-剛果紅初篩培養(yǎng)基對突變體文庫進行初篩，30%以上的克隆能夠形成清晰的透明圈， 即可以產(chǎn)生有活性的甘露聚糖酶。其中，894 個克隆形成了能夠準確測量直徑的透明圈（≥3 mm）。 隨后，對上述894 個克隆進行復(fù)篩， 測定其最適催化條件和對魔芋粉的比酶活力，最終篩選到一株在pH 7.0 下對魔芋粉催化效率明顯提高的正向突變， 命名為RmMan5AM2。

基因測序分析結(jié)果表明該突變體基因（RmMan5AM2）中有7 個堿基發(fā)生突變，其中3 個為同義突變（Asn128 中aat-aac、Ala280 中g(shù)ct-gcc、Lys306 中aag-aaa），4 個為錯義突變，導(dǎo)致該突變體中4 個氨基酸殘基在野生型甘露聚糖酶上發(fā)生改變， 分別是Leu122His （ctt-cat）、Lys162Arg （aagagg）、Glu194Asp（gaa-gac）和Asp305Gly（gac-ggc）。該突變體的氨基酸序列與其他GH5 家族甘露聚糖酶的多重序列比對表明：Leu122 和Glu194 均為嚴格保守氨基酸，Lys162 為部分保守氨基酸，Asp305為非保守氨基酸（見圖1）。

圖1 甘露聚糖酶突變體（RmMan5AM2）與其他GH5 家族甘露聚糖酶氨基酸序列多重比對分析Fig. 1 Amino acid sequence similarity of RmMan5AM2 with other GH family 5 mannanases

2.2 突變體（RmMan5AM2）的表達與純化

甘露聚糖酶突變體RmMan5AM2 在大腸桿菌BL21（DE3）中可溶表達。 該突變體經(jīng)Ni-NTA 親和層析柱進一步純化得到電泳級純酶， 純化倍數(shù)為7.5 倍，回收率為60.8%。 經(jīng)SDS-PAGE 分析，該突變體的相對分子質(zhì)量為44 000（見圖2），與野生型甘露聚糖酶（RmMan5A）的相對分子質(zhì)量一致[15]。

圖2 甘露聚糖酶突變體（RmMan5AM2）的純化圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified RmMan5AM2

2.3 突變體（RmMan5AM2）的酶學(xué)性質(zhì)

甘露聚糖酶突變體RmMan5AM2 的酶學(xué)性質(zhì)如圖3 所示。該突變體的最適pH 為7.0，在pH 5.0~8.5 表現(xiàn)出50%以上的酶活力。 該突變體具有優(yōu)良的pH 穩(wěn)定性， 在pH 4.0~10.0 下處理30 min 仍能保留80%以上的酶活力。 該酶的最適溫度為65 ℃，在70、75 ℃下分別具有90%和50%左右的酶活力。該突變體具有良好的溫度穩(wěn)定性， 在60 ℃以下處理30 min 仍能保留90%以上的酶活力。

圖3 甘露聚糖酶突變體（RmMan5AM2）的最適pH、pH 穩(wěn)定性、最適溫度和溫度穩(wěn)定性Fig. 3 Optimal pH，pH stability，optimal temperature，and thermostability of RmMan5AM2

與野生型甘露聚糖酶RmMan5A 相比， 該突變體的最適pH 和pH 穩(wěn)定性沒有發(fā)生明顯改變[15]。該突變體在中性條件下具有最高的酶活力，這與大多數(shù)真菌來源的甘露聚糖酶明顯不同，如嗜熱毀絲菌（Myceliophthora thermophila）和米曲霉（A. oryzae）來源的甘露聚糖酶[19-20]。 該突變體在pH 5.0~8.5 仍具有50%以上的酶活力， 且在pH 4.0~10.0 具有良好的穩(wěn)定性， 表明其能夠在寬泛的pH 范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高催化活性。 此外，與野生型甘露聚糖酶相比，該突變體的最適溫度提高了10 ℃， 熱穩(wěn)定性溫度提高5 ℃[15]。該突變體最適溫度明顯提高，高于許多天然甘露聚糖酶的最適溫度， 如嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca） 和芽孢桿菌 （Bacillussp.）來源的甘露聚糖酶[21-22]。 較高的反應(yīng)溫度有利于提高水解時的底物濃度和催化反應(yīng)效率，并減少反應(yīng)過程中微生物污染的風(fēng)險[23]。

2.4 突變體（RmMan5AM2）的底物特異性和動力學(xué)參數(shù)

甘露聚糖酶突變體RmMan5AM2 保留了野生型甘露聚糖酶高比酶活力的特點，對槐豆膠具有最高比酶活力，為10 371.4 U/mg，其次分別為魔芋粉（6 430.3 U/mg）和瓜爾膠（2 604.0 U/mg）。 該突變體對魔芋粉和瓜爾膠的比酶活力有明顯提高，分別為野生型甘露聚糖酶的20.9%和74.5%[15]。 定向進化后，突變體對槐豆膠的比酶活力顯著高于大部分甘露聚糖酶，如來源于短小芽孢桿菌（B. pumilus，3 462.0 U/mg）和 白 曲 霉（763.6 U/mg）的 甘 露 聚糖 酶[5，24]。

甘露聚糖酶突變體RmMan5AM2 的動力學(xué)參數(shù)如表1 所示。 可以看出，該突變體對魔芋粉的最大反應(yīng)速率（Vmax）最高，為36 696.0 μmol/（min·mg）；對槐豆膠的親和能力（Km）最高，為3.1 mg/mL。 與野生型甘露聚糖酶相比，突變體對不同底物的最大反應(yīng)速率沒有明顯改變，但對槐豆膠、魔芋粉和瓜爾膠的Km值分別提高了18.4%、16.7%和12.8%[15]，表明定向進化后突變體對甘露聚糖底物的親和力有明顯提升。 此外，在最適條件下，該突變體對槐豆膠、魔芋粉和瓜爾膠的催化效率（kcat/Km）分別較野生型甘露聚糖酶提高了37.4%、28.9%和34.4%。 高比酶活力和高催化效率能夠有效降低甘露聚糖酶使用成本，提高魔芋甘露寡糖生產(chǎn)效率，對甘露聚糖酶的商業(yè)化應(yīng)用和魔芋甘露寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要。

2.5 突變體（RmMan5AM2）的結(jié)構(gòu)分析

野生型甘露聚糖酶RmMan5A 的分子結(jié)構(gòu)呈經(jīng)典的（β/α）8-TIM 桶結(jié)構(gòu)。 根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)可知，突變Leu122His 位于分子內(nèi)部， 突變Lys162Arg、Glu194Asp 和Asp305Gly 位于分子表面 （見圖4）。突變體中，疏水的Leu122 突變?yōu)橛H水的His122，有利于穩(wěn)定該酶的α2 螺旋，從而提高該酶的穩(wěn)定性。突變Lys162Arg 和Asp305Gly 距離該酶催化中心較遠，其中酸性的Asp305 突變?yōu)橹行缘腉ly305，可能在一定程度上改變了酶分子局部與溶劑的相互作用，從而有利于酶分子穩(wěn)定。 突變Glu194Asp 位于催化位點中心， 長側(cè)鏈的Glu194 突變?yōu)槎虃?cè)鏈的Asp194，使突變體催化凹槽變得開闊，便于底物與產(chǎn)物的進入和離去。 同時，與Glu194 相同，突變后的Asp194 也是帶有羧基的酸性氨基酸， 該突變并不改變催化凹槽內(nèi)的電荷分布及其與周圍分子的相互作用。 這可能是該突變體比酶活力顯著提高的原因之一。

圖4 甘露聚糖酶突變體（RmMan5AM2）的分子結(jié)構(gòu)Fig. 4 Overall structure of RmMan5AM2

2.6 高密度發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶

甘露聚糖酶突變體基因RmMan5AM2在畢赤酵母GS115 中成功表達，經(jīng)高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選，從含有1.0 mg/mL 遺傳霉素G418 的篩選培養(yǎng)基中得到一株高產(chǎn)重組菌株， 搖瓶發(fā)酵的酶活力達862.8 U/mL。該重組菌株在100 L 發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵，隨著發(fā)酵進行發(fā)酵液中甘露聚糖酶酶活力、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和菌體質(zhì)量濃度都逐漸增加。 發(fā)酵至156 h，甘露聚糖酶酶活力達到最高值， 為176 000 U/mL，此時蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和菌體質(zhì)量濃度分別為22.6 mg/mL 和421 g/L（見圖5）。

圖5 畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶突變體（RmMan5AM2）歷程Fig. 5 Time course of RmMan5AM2 expression in Pichia pastoris

甘露聚糖酶突變體RmMan5AM2 在畢赤酵母中表達表現(xiàn)出很高的酶活力，大大高于野生型甘露聚糖酶RmMan5A 在畢赤酵母中的酶活力（85 200 U/mL）[25]。迄今，已有多種甘露聚糖酶在畢赤酵母中實現(xiàn)了高效表達，如枯草芽孢桿菌（105 836 U/mL）和樟絨枝霉（42 200 U/mL）來源的甘露聚糖酶[10-11]。 該突變體發(fā)酵液胞外酶活力顯著高于其他已報道甘露聚糖酶，是目前甘露聚糖酶的最高表達水平。 同時，該突變體發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度也顯著高于畢赤酵母表達的大多數(shù)甘露聚糖酶（2~10 mg/mL）[26-27]。

2.7 突變體（RmMan5AM2）制備魔芋甘露寡糖

甘露聚糖酶突變體RmMan5AM2 在最適條件下（加酶量300 U/mL、底物質(zhì)量濃度300 g/L）水解魔芋粉8 h，魔芋粉的水解率達90.2%，魔芋甘露寡糖的得率達88.5%。 HPLC 分析結(jié)果表明（見圖6）：產(chǎn)物主要為聚合度2~6 的甘露寡糖，這些組分的峰面積超過總峰面積的85%； 聚合度2~10 的甘露寡糖組分峰面積超過總峰面積的95%。 該突變體水解魔芋粉制備的魔芋甘露寡糖符合我國 “新食品原料”目錄（2013 年第10 號公告）中甘露寡糖組分的有關(guān)規(guī)定。

圖6 魔芋甘露寡糖的組成分析Fig.6 HPLC analysis of the composition of konjac mannooligosaccharides

通常，底物質(zhì)量濃度是影響多糖水解效率的重要因素[28]。 水解時提高魔芋粉質(zhì)量濃度在一定程度上可以提高產(chǎn)物得率，但魔芋粉質(zhì)量濃度高會顯著增加反應(yīng)體系黏度，阻礙體系中甘露聚糖酶分子移動及其與底物結(jié)合，反而降低魔芋粉水解率。 因此，水解魔芋粉制備魔芋甘露寡糖時，所用底物質(zhì)量濃度一般在5~20 g/L[29-30]。 硫色曲霉（A. sulphureus）甘露聚糖酶水解10 g/L 魔芋粉時， 水解率達74%；但當(dāng)魔芋粉質(zhì)量濃度增加到100 g/L 時， 水解率顯著降低至53%[31]。 甘露聚糖酶突變體RmMan5AM2 制備魔芋甘露寡糖時，所用魔芋粉質(zhì)量濃度及其水解率分別達300 g/L 和90.2%， 均顯著高于大多數(shù)已報道的甘露聚糖酶。 此外，利用該突變體制備的魔芋甘露寡糖主要為聚合度2~6 的寡糖組分，這與枯草芽孢桿菌和產(chǎn)黃青霉來源的甘露聚糖酶明顯不同， 其水解魔芋粉主要產(chǎn)生聚合度7~12 的甘露寡糖[11，26]。 本研究中制備的魔芋甘露寡糖主要在人體近端結(jié)腸中發(fā)揮作用，能夠有效預(yù)防小鼠的便秘情況，改善小鼠的胰島素水平和瘦素抵抗[32-33]。

3 結(jié) 語

利用定向進化技術(shù)對米黑根毛霉來源的甘露聚糖酶（RmMan5A）進行了分子改造，獲得了一個正向突變體（RmMan5AM2）。 該突變體對甘露聚糖的比酶活力和催化效率顯著提高，同時保留了野生型甘露聚糖酶優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)。 利用畢赤酵母實現(xiàn)了該突變體的高效生產(chǎn)， 發(fā)酵液胞外酶活力最高達176 000 U/mL，是目前甘露聚糖酶的最高產(chǎn)酶水平。該突變體能夠水解高質(zhì)量濃度魔芋粉制備低聚合度的魔芋甘露寡糖，在甘露寡糖生產(chǎn)應(yīng)用具有很好的應(yīng)用潛力。 本研究為甘露聚糖酶的分子改造、高效表達及其在生產(chǎn)甘露寡糖中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。