賈 嵐 孟智睿 魏益謙 李 麗 邵紫萱 高學敏 王景霞
(北京中醫(yī)藥大學,北京,100029)
近年來隨著人民生活水平的提高和生活方式的改變,對酒類的消費也日益增多,過量飲酒已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)極受關(guān)注的社會公共問題。一次大量飲酒會引發(fā)急性乙醇中毒,對機體健康產(chǎn)生嚴重危害[1]。人體攝入的乙醇90%在肝臟代謝,乙醇代謝不暢是造成酒精性肝病的主要原因[2]。中醫(yī)學中沒有“酒精性肝病”之名,但在中醫(yī)學古文獻中有“傷酒”“酒痞”“酒疸”“脅痛”等相關(guān)記載。中醫(yī)學認為過量飲酒,可致濕熱有毒之邪困遏脾胃,脾胃失和,胃失降濁,則氣機壅滯;或損傷肝膽,致肝失疏泄,肝膽氣機逆亂,病位主要在肝和胃[3]。
目前,國內(nèi)外對解酒保健藥的研發(fā)頗多,但尚無明確療效的藥物面向臨床[4-7]。金昭膠囊由藥食兩用的葛根、枳椇子、梔子組成。其中葛根味辛、甘,性涼,歸脾胃經(jīng)?!肚Ы鸱健份d其“葛根主解酒毒”,能升舉脾胃清陽之氣,故為方中君藥。枳椇子為臣藥,與葛根同用,通利小便,加強酒毒排解,達到協(xié)同增效之能。梔子在配方中為佐藥,可使肝、膽、脾胃酒毒從小便而出,達到很好的解酒毒利肝膽作用[8-9]。金昭膠囊將3種藥食同源的中藥合用,既能解毒保肝,改善臨床癥狀,同時具有良好的安全性?,F(xiàn)代藥理學研究顯示,葛根可治療酒精性中毒[10]。高學清[11]發(fā)現(xiàn)葛根提取物能夠有效抑制血清中GOT和GPT活性,同時能夠減輕肝細胞的腫脹。枳椇子水提取物具有顯著的解酒毒,抗肝纖維化,抗氧化等作用[12]。梔子具有保肝利膽的作用[13]。以上研究均為金昭膠囊防治酒精性肝、胃損傷提供了藥理學方面的科學支撐。
本研究主要挖掘其產(chǎn)品優(yōu)勢,探究其對酒精性肝損傷的保護機制,提升科技含量。通過研究金昭膠囊對急性酒精性肝損傷模型小鼠醉酒狀態(tài)、肝功、肝脂質(zhì)及乙醇代謝酶、肝組織和胃組織抗氧化酶活性等指標的影響,對金昭膠囊對急性酒精性肝損傷的保護作用及機制進行初步探討,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 動物 選取無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠,周齡8~10周,體質(zhì)量為25~35 g,由北京斯貝福實驗動物科技有限公司提供,許可證號為SCXK(京)2016-0002,動物倫理審批號BUCM-4-2019091801-3074,動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物實驗室的屏障環(huán)境中,室溫為(24±2)℃,空氣相對濕度為(50±10)%,光照12 h/d,自由飲水。
1.1.2 藥物 金昭膠囊[無限極(中國)有限公司,批號:17C04ADB01],規(guī)格:0.35 g/粒。茵梔黃顆粒(魯南厚普制藥有限公司,批號:Z20030028),氯化鈉(常州市海拓實驗儀器有限公司,批號:20160704)。
1.1.3 試劑與儀器 氯化鈉(常州市海拓實驗儀器有限公司,批號:20160704);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)試劑盒,批號:2019001,谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)試劑盒,批號:2019002;均購于長春匯力;三酰甘油(triacylglycerol,TG)試劑盒,批號:20190605;總膽固醇(Total Cholesterol,TC)試劑盒,批號:20190605;丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒,批號:20190510;超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒,批號:20190327;還原型谷胱甘肽(glutathion,GSH)試劑盒,批號:20190529;過氧化氫酶(Catalase.CAT)試劑盒,批號:20190528;均購于南京建成科技有限公司;MDA試劑盒,批號:20190525;SOD試劑盒,批號:20190701;一氧化氮(Nitric Oxide,NO)試劑盒,批號:20190708;均購于南京建成科技有限公司;4%多聚甲醛,批號:30525-89-4,甘油明膠封片劑,批號:G1402,OCT包埋劑,批號:4583,武漢谷歌生物;醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒,批號:201905,醛脫氫酶(Aldehyde Dehydrogenase,ALDH)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒,批號:201905;均購于酶聯(lián)生物;前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒,批號:C0190030183;購于華美生物。純水儀(青島富勒姆科技,型號:FBZ2001-UP-P),超聲細胞粉碎機(寧波新芝生物,型號:JY92-Ⅱn),臺式高速冷凍離心機(Heal Force,型號:Neofuge 15R),渦旋混合器(Servicebio,型號:MX-F),水浴鍋(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司,型號:TL-420D),超低溫冰箱(海爾,型號:DW-86L626),全自動研磨儀(賽維爾生物,型號:KH-Ⅲ),自動洗板機(Rayto,型號:RT3100),酶標檢測儀(BioTeK,美國,型號:Epoch)。
1.2 方法
1.2.1 分組與模型制備
1.2.1.1 動物分組 所有ICR小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,按體質(zhì)量隨機區(qū)組法分為空白組,模型組,茵梔黃顆粒(陽性藥)組,金昭膠囊低、中、高劑量組共6組,每組10只。
1.2.1.2 金昭膠囊制備 將葛根、枳椇子和梔子(9∶4.5∶2)放入提取罐中,加10倍量的水,煎煮2次,2 h/次,提取并過濾,合并得到提取液(藥材提取率為20%~25%)。將提取液濃縮至相對密度為1.0~1.5,60~85 ℃干燥至含水率≤5%,粉碎,過60~100目篩,加輔料玉米淀粉和硬脂酸鎂,混合均勻,直充膠囊[14]。
1.2.1.3 模型制備 末次給藥1 h后,除空白組外,其余各組灌胃50%的乙醇溶液12 mL/kg,空白組灌予等體積的蒸餾水,建立小鼠急性酒精性肝胃損傷模型[2]。
1.2.2 給藥方法 金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠每日灌胃金昭膠囊混懸液0.21 g/kg、0.42 g/kg和0.84 g/kg,灌胃體積為20 mL/kg(金昭膠囊臨床成人用量2.52 g/d,動物系數(shù)按照10倍計算,成人體質(zhì)量按照60 kg計算,按人體推薦攝入量的5、10、20倍折算[15]);陽性藥組灌胃茵梔黃顆粒混懸液1.5 g/kg,20 mL/kg;空白對照組和模型對照組給予等體積蒸餾水灌胃,灌胃1次/d,并觀察動物一般狀況,稱重1次/周,并按動物體質(zhì)量調(diào)整灌胃量,持續(xù)給藥4周。
1.2.3 檢測指標與方法
1.2.3.1 樣本采集 在進行完醉酒狀態(tài)檢測后,摘眼球取血后處死,取肝臟、胃組織凍存、固定,檢測相關(guān)指標。
1.2.3.2 一般行為觀察 觀察灌酒后小鼠行為狀態(tài)、精神狀態(tài)、二便狀態(tài)等。
1.2.3.3 醉酒狀態(tài)檢測 小鼠醉酒是否以翻正反射是否消失為標準:小鼠灌酒后一定時間將其背向下輕輕側(cè)翻,若小鼠背向下的姿勢保持30 s以上,則認為翻正反射消失,即為醉酒[16]。
1.2.3.4 血清轉(zhuǎn)氨酶活性 嚴格按照試劑盒說明書,應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血清GPT和GOT的含量。
1.2.3.5 肝組織脂質(zhì)水平和酶活性 嚴格按照試劑盒說明書,應(yīng)用全自動生化分析儀檢測肝組織勻漿MDA、SOD、CAT、GSH、TC、TG活性水平,應(yīng)用酶標儀采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測酒精代謝酶細胞色素ADH、ALDH的含量。
1.2.3.6 肝臟病理切片的觀察 用蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)法染色肝臟組織,切片,顯微鏡的放大倍數(shù)為200,觀察病理學切片。
1.2.3.7 胃組織酶活性 嚴格按照試劑盒說明書,應(yīng)用全自動生化分析儀檢測胃組織勻漿MDA、SOD、NO活性,應(yīng)用酶標儀采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測胃組織勻漿PEG2水平。
2.1 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠行為狀態(tài)的影響 灌酒后,模型組小鼠均相繼出現(xiàn)不同程度的醉酒狀態(tài),表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)、動作遲緩、尿失禁、昏睡等癥狀,提示小鼠醉酒模型構(gòu)建成功。與模型組比較,金昭膠囊組與陽性藥組小鼠的步態(tài)更穩(wěn)、自主活動相對增加,尿失禁、昏睡癥狀減少,醉酒狀態(tài)改善。
2.2 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠醉酒狀態(tài)的影響 灌酒后,與空白組比較,模型組小鼠醉酒數(shù)和醉酒率升高;與模型組比較,陽性藥組、金昭膠囊各劑量組小鼠醉酒數(shù)和醉酒率降低。見表1。
表1 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠 醉酒狀態(tài)的影響(n=10)
2.3 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠血清GPT、GOT活性的影響 與空白組比較,模型組小鼠血清GPT、GOT活性顯著升高(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組小鼠血清GPT、GOT活性顯著降低(P<0.01,P<0.05);金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠血清GPT、GOT活性顯著降低(P<0.01,P<0.05)。見表2。
表2 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠血清GPT、GOT活性的影響
2.4 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD、CAT、GSH活性的影響 與空白組比較,模型組小鼠肝組織MDA活性顯著升高(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組、金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠肝組織MDA活性顯著降低(P<0.01)。與空白組比較,模型組小鼠肝組織SOD、CAT、GSH活性顯著降低(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組小鼠肝組織SOD、CAT、GSH活性顯著升高(P<0.01);金昭膠囊中劑量組小鼠肝組織GSH活性顯著升高(P<0.01);金昭膠囊高劑量組小鼠肝組織SOD、CAT、GSH活性顯著升高(P<0.01)。見表3。
表3 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD、CAT、GSH活性的影響
2.5 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織TC、TG、ADH、ALDH活性的影響 與空白組比較,模型組小鼠肝組織TC、TG活性顯著升高(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組小鼠肝組織TC、TG活性顯著降低(P<0.01);金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠肝組織TC、TG活性顯著降低(P<0.01)。與空白組比較,模型組小鼠肝組織ADH、ALDH活性顯著降低(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組小鼠肝組織ADH、ALDH活性顯著升高(P<0.01,P<0.05);金昭膠囊低劑量組小鼠肝組織ADH活性顯著升高(P<0.01);金昭膠囊中、高劑量組小鼠肝組織ADH、ALDH活性顯著升高(P<0.01)。見表4。
表4 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織TC、TG、ADH、ALDH活性的影響
2.6 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理學變化的影響 肝組織病理學切片結(jié)果表明,空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝小葉結(jié)構(gòu)完整,未見肝細胞變性、壞死等病理變化。模型組組織肝細胞排列規(guī)則,廣泛可見肝細胞胞質(zhì)疏松,胞質(zhì)內(nèi)可見微小的圓形空泡(黑色箭頭),并可見少量炎癥細胞浸潤(黃色箭頭),未見其他明顯異常。陽性藥組、金昭膠囊低、中、高劑量組組織肝細胞排列規(guī)則,廣泛可見肝細胞空泡變性,胞質(zhì)內(nèi)可見微小的圓形空泡(黑色箭頭),未見其他明顯異常。結(jié)果表明,陽性藥及金昭膠囊對小鼠的肝臟具有一定程度的保護作用。見圖1。
圖1 小鼠肝臟組織病理切片(HE染色,×200)
2.7 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠胃組織MDA、SOD、NO、PGE2活性的影響 與空白組比較,模型組小鼠胃組織MDA活性顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥組小鼠胃組織MDA活性顯著降低(P<0.01);金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠胃組織MDA活性顯著降低(P<0.01)。與空白組比較,模型組小鼠胃組織SOD、NO、PGE2活性顯著降低(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,陽性藥組小鼠胃組織SOD、NO、PGE2活性顯著升高(P<0.01,P<0.05);金昭膠囊低劑量組小鼠胃組織SOD活性顯著升高(P<0.01);金昭膠囊中劑量組小鼠胃組織SOD、NO活性顯著升高(P<0.01);金昭膠囊高劑量組小鼠胃組織SOD、NO、PGE2活性顯著升高(P<0.01,P<0.05)。見表5。
表5 金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠胃組織MDA、SOD、NO、PGE2活性的影響
本研究模型組小鼠灌酒后均相繼出現(xiàn)不同程度的醉酒狀態(tài),表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)、動作遲緩、尿失禁、昏睡等癥狀,且小鼠醉酒數(shù)和醉酒率顯著升高,血清中GOT、GPT水平明顯升高,且肝組織形態(tài)及功能出現(xiàn)明顯損傷改變,肝組織各指標出現(xiàn)了明顯改變,證明急性酒精性肝損傷模型建立成功。陽性對照藥茵梔黃顆粒由茵陳、梔子、黃芩組成,具有清熱解毒,利濕退黃的作用[17-18]。本研究中金昭膠囊各劑量組小鼠灌酒后醉酒數(shù)和醉酒率均比模型組低,步履不穩(wěn)、昏睡等醉酒癥狀較模型組輕。與模型組比較,血清中GOT、GPT水平明顯降低,且肝組織損傷狀況明顯改善。從表征與肝損傷情況上看,金昭膠囊對急性酒精性肝損傷具有一定程度的保護功效。短期內(nèi)乙醇的攝入過量會造成三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化障礙,影響脂肪代謝,導致TC、TG在肝臟中大量蓄積,TG大量積聚進而造成脂肪病變,最終會導致酒精性脂肪肝的形成[19-20]。當肝組織受到損傷,乙醇在代謝過程中產(chǎn)生過量的活性氧損傷肝細胞膜,肝細胞膜的通透性增大,存在于肝細胞質(zhì)內(nèi)的GPT和肝細胞線粒體中的GOT會大量進入血清[21-22]。本研究金昭膠囊各劑量組顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠血清GPT、GOT水平,肝組織TC、TG水平,改善肝組織細胞腫脹、壞死、炎癥細胞浸潤等病理狀態(tài),說明金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠的保護機制可能與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)氨酶水平,脂質(zhì)水平有關(guān)。
SOD是機體內(nèi)廣泛存在的清除氧化自由基的酶類,它與CAT、GSH共同構(gòu)成體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),可以有效地清除機體產(chǎn)生的自由基,對維持機體內(nèi)自由基的平衡起著至關(guān)重要的作用[9,23]。MDA是活性氧自由基氧化生物膜過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,可以與酶和蛋白質(zhì)交聯(lián)從而生成脂褐質(zhì),改變膜的通透性,其水平的高低與氧化應(yīng)激對肝臟的損害程度相關(guān)[24-25]。SOD是生物體抗氧化酶防御體系的主要組成部分,其酶活性的降低將導致氧自由基蓄積,從而誘導細胞損傷。GSH是機體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物,是評價機體抗氧化能力大小的重要因素[26]。本研究金昭膠囊各劑量組顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA水平,升高SOD、CAT、GSH水平,說明金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠的保護機制可能與調(diào)節(jié)抗氧化水平有關(guān)。
乙醇在人類體內(nèi)的代謝和排泄是一個復(fù)雜的、多系統(tǒng)參與的過程。攝入的乙醇90%在肝臟代謝降解,可引起肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng),使肝細胞膜及細胞器結(jié)構(gòu)遭到破壞從而引起代謝和功能方面的障礙[27-29]。經(jīng)胃腸道吸收的乙醇通過胞質(zhì)ADH和線粒體ALDH途徑、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑氧化代謝,上述代謝過程產(chǎn)生的大量自由基介導了氧化應(yīng)激反應(yīng),從而損傷肝細胞[30]。ADH通過將乙醇代謝為乙醛,再經(jīng)ALDH代謝形成乙酸,最后通過三羧酸循環(huán)排出體外[9]。本研究金昭膠囊各劑量組顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠肝組織ADH、ALDH含量,說明金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠的保護機制可能與調(diào)節(jié)乙醇代謝酶有關(guān)。
胃是乙醇代謝最先接觸的重要器官,過度飲酒或長期飲酒可引起胃黏膜急性或慢性損傷。在乙醇的刺激下,胃黏膜組織可產(chǎn)生大量氧自由基,氧自由基與膜內(nèi)多價不飽和脂肪酸結(jié)合,形成MDA[31]。SOD是機體清除氧自由基的重要酶,可通過歧化反應(yīng)清除機體內(nèi)氧代謝過程中產(chǎn)生的有害超氧負離子自由基。PGE2是胃黏膜重要的調(diào)控介質(zhì),在組織中的減少與多種因素導致的胃黏膜損傷有關(guān)[32]。NO具有擴張黏膜血管,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及作為神經(jīng)遞質(zhì)等作用,可增加胃黏膜血流量,從而維護黏膜完整性,發(fā)揮黏膜防御作用[33]。本研究金昭膠囊各劑量組顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠胃組織MDA活性,增加SOD、NO、PGE2活性,說明金昭膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠的胃組織也有一定保護作用,且對胃黏膜的保護機制可能與調(diào)節(jié)過氧化物酶有關(guān)。
綜上所述,金昭膠囊具有解酒的作用,對于急性酒精性肝損傷有明顯的保護作用,其作用機制可能與增強體內(nèi)肝組織中乙醇代謝關(guān)鍵酶及抗氧化酶活性,減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,保護肝細胞膜完整性,減少轉(zhuǎn)氨酶的釋放相關(guān)。同時金昭膠囊還可以通過調(diào)節(jié)胃組織過氧化物酶活性,起到保護胃黏膜損傷的作用。說明金昭膠囊對于飲酒過量所導致的肝、胃損傷均有良好的保護作用。