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      某院2015—2019年肺炎克雷伯菌的耐藥性及耐藥基因分析

      2022-08-18 03:22:40胡小騫王琴
      中國抗生素雜志 2022年7期
      關(guān)鍵詞:環(huán)素克雷伯青霉

      胡小騫 王琴

      (安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院,合肥 230601)

      肺炎克雷伯菌(KP)最初于1882年由Friedlander[1]發(fā)現(xiàn),其廣泛存在于自然界中,包括土壤、水質(zhì)及動物體內(nèi)。KP是人體內(nèi)的常見病原菌,當機體免疫力低下或定植部位發(fā)生變化時,可引起呼吸道、泌尿道、血液感染,甚至是敗血癥[2]。近年來,由于第三代頭孢菌素及碳青霉烯類抗生素的不合理使用,產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及耐碳青霉烯類的肺炎克雷伯菌逐年增加[3-4]。CR-KP的泛耐藥性、強致病性、高傳染性,增大了臨床抗感染治療及耐藥菌防控的難度[5-6]。本研究通過分析安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院2015—2019年2416株KP的臨床分布及對常用抗菌藥物的耐藥情況,研究5年來KP耐藥性的變遷,分析CR-KP的耐藥基因型,為臨床抗感染治療及合理用藥提供數(shù)據(jù)支持。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 菌株來源

      回顧性分析安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院2015年1月—2019年12月臨床分離的肺炎克雷伯菌,剔除同一患者的重復菌株,共計2416株。選取2019年內(nèi)科重癥監(jiān)護病區(qū)(ICU)的19株CR-KP進行全基因組測序。

      1.1.2 試劑與儀器

      采用法國VITEK-2 Compat全自動細菌分析系統(tǒng)和配套試劑GN/GN13,進行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗,藥敏試驗采用微量稀釋法(MIC法)和K-B紙片擴散法,藥敏紙片及M-H培養(yǎng)基購自O(shè)xoid公司,質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603購自國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心,使用天根生化科技有限公司的試劑盒進行細菌基因組DNA的提取,DNA Marker D、4S Red plus核酸染色劑、上樣緩沖液均購于上海生工生物工程股份有限公司,DNA產(chǎn)物濃度及純度測定使用英國Biochrom公司的超微量分光光度計,運用上海一恒科學儀器有限公司恒溫培養(yǎng)搖床進行細菌液體培養(yǎng),使用美國Bio-Rad公司的電泳儀進行瓊脂糖凝膠電泳,采用美國Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行瓊脂糖凝膠的成像。

      1.2 方法

      1.2.1 細菌培養(yǎng)、鑒定及藥敏實驗

      依據(jù)《臨床微生物樣本采集規(guī)范》采集標本,參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第4版)》,在血瓊脂平皿、麥康凱瓊脂平皿上按照四區(qū)劃線原則進行接種,于CO2恒溫培養(yǎng)箱(36℃±1℃)培養(yǎng)24~48 h,采用法國VITEK-2 Compat全自動細菌分析系統(tǒng)進行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗。參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)當年標準判定細菌的藥敏結(jié)果,使用微量稀釋法(MIC法)和K-B紙片擴散法對CR-KP菌株進行表型確認,CR-KP藥敏結(jié)果判定標準為對任一種碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美羅培南、多尼培南或厄他培南)耐藥的肺炎克雷伯菌。

      1.2.2 細菌基因組DNA提取

      復蘇CR-KP菌株于LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h后,挑取單克隆CR-KP菌株于LB液體培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min搖菌過夜。取細菌培養(yǎng)液1 mL,10000 r/min離心1 min,吸凈上清液,保留菌體沉淀,使用DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

      1.2.3 基因組DNA提取物質(zhì)量控制標準

      將DNA提取產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,并用超微量分光光度計檢測純度和濃度。純度要求菌株DNA產(chǎn)物的A260:A280在1.8~2.0范圍之內(nèi),避免RNA污染;DNA濃度≥20 ng/μL,條帶清晰無雜帶,總量在1.0~2.0 μg范圍內(nèi)。

      1.2.4 細菌全基因組測序

      運用上海生工生物有限公司Illumina Hiseq2500測序平臺對菌株進行全基因組測序,基于Illumina平臺的測序,是對核酸提取樣本進行建庫、擴增測序、質(zhì)控的3個主要步驟。

      1.2.5 測序結(jié)果組裝

      在Linux或Centos系統(tǒng)中運行SPAdes-2.0軟件將測序原始FASTQ結(jié)果拼接為FASTA文件,運行命令參考SPAdes-2.0軟件網(wǎng)址https://github.com/ablab/spades。

      1.2.6 耐藥基因檢測

      運用丹麥技術(shù)大學(DTU)基因組流行病學中心(CGE)網(wǎng)站(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)的ResFinder 4.0工具,對19株CR-KP的contigs進行耐藥基因型篩選,獲得其攜帶的耐藥基因。運用MORPHEUS網(wǎng)站(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)在線制作19株CR-KP的耐藥基因熱圖,實現(xiàn)耐藥基因分布可視化。

      1.2.7 統(tǒng)計學分析

      采用WHONET5.6軟件對菌株的標本來源、科室分布、檢出率及耐藥率進行數(shù)據(jù)收集,運用SPSS 20.0軟件對5年期間菌株的檢出率、耐藥率進行比較及趨勢統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以百分比表示,率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,趨勢性分析采用趨勢χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結(jié)果

      2.1 肺炎克雷伯菌分布

      2015—2019年期間,肺炎克雷伯菌的分離率分別為8.61%(378/4392)、9.84%(448/4555)、8.66%(381/4401)、10.5 1%(622/5916)、11.09%(587/5294),5年分離率之間的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=26.800,P<0.001),呈上升趨勢(χ2趨勢=18.190,P<0.001),見表1。2015—2019年肺炎克雷伯菌構(gòu)成比較高的科室為內(nèi)科ICU23.2%(561/2416)、外科ICU 19.1%(461/2416)、呼吸內(nèi)科18.8%(454/2416)、神經(jīng)內(nèi)科10.9%(263/2416)。2015—2019年肺炎克雷伯菌構(gòu)成比較高的標本為痰液51.7%(1249/2416)、尿液11.3%(273/2416)、血液7.5%(181/2416)、分泌物5.8%(140/2416)。

      表1 2015—2019年肺炎克雷伯菌在全部臨床分離株中的分離情況Tab.1 Isolation of Klebsiella pneumoniae in all clinical isolates from 2015 to 2019

      2.2 肺炎克雷伯菌抗菌活性

      2015—2019年期間,肺炎克雷伯菌對18種抗菌藥物的耐藥率呈上升趨勢,除替加環(huán)素的耐藥率差異無法統(tǒng)計外,對其他各類抗菌藥物的耐藥率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。對亞胺培南、美羅培南耐藥率分別從2015年的2.9%和3.0%上升至2019年的16.0%和13.7%,頭孢他啶和頭孢吡肟耐藥率分別從12.7%和10.1%上升至24.2%和21.1%,頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率分別從2015年的3.2%和4.2%上升至2019年的16.8%和16.5%,環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥率分別從18.3%和14.8%上升至29.1%和26.6%,阿米卡星和慶大霉素耐藥率分別從4.2%和18.5%上升至12.8%和28.3%。本院自2017年開始對替加環(huán)素的MIC值進行監(jiān)測,2017—2019年肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥率均為0,見表2。

      表2 2015—2019年各年份肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的抗菌活性比較Tab.2 Comparison of the antibacterial activity of Klebsiella pneumoniae against commonly used antibiotics in various years from 2015 to 2019

      2.3 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌分布

      2015—2019年各年度檢出CR-KP占肺炎克雷伯菌比例分別為3.70%(14/378)、10.04%(45/448)、18.90%(72/381)、19.29%(120/622)、17.55%(103/587),5年檢出率之間的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=63.973,P<0.001),呈上升趨勢(χ2趨勢=46.176,P<0.001),見表3。2015—2019年CR-KP構(gòu)成比較高的科室為外科ICU 14.4%(51/354)、內(nèi)科ICU 10.2%(36/354)、呼吸ICU 8.5%(30/354)、急診ICU 2.0%(7/354)。2015—2019年CR-KP構(gòu)成比較高的標本為痰液43.8%(155/354)、尿液10.7%(38/354)、分泌物7.1%(25/354)、血液6.5%(23/354)。

      表3 2015—2019年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的檢出情況Tab.3 Detection of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae from 2015 to 2019

      2.4 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌抗菌活性

      2015—2019年CR-KP對各類抗菌藥物呈現(xiàn)出不同程度的耐藥,總體呈現(xiàn)上升趨勢。除對慶大霉素的耐藥率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.105)、替加環(huán)素的耐藥率差異無法統(tǒng)計外,對其他各類抗菌藥物的耐藥率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別從2015年的92.9%和77.8%上升至2019年的100.0%和98.8%,對頭孢菌素的耐藥率呈上升趨勢,對頭孢他啶和頭孢曲松的耐藥率分別從2015年的64.3%和78.6%上升至2019年的98.1%和99.0%,對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別從50.0%和42.9%上升至91.3%和91.3%,對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別從42.9%和71.4%上升至68.0%和83.5%。對替加環(huán)素的耐藥率均為0(表4)。

      表4 2015—2019年各年份耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的抗菌活性比較Tab.4 Comparison of antibacterial activities of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae against commonly used antibiotics in various years from 2015 to 2019

      2.5 ICU耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結(jié)果

      選取2019年內(nèi)科ICU的19株CR-KP進行WGS檢測及耐藥基因分析,檢測出15種耐藥基因,繪制耐藥基因熱圖,見圖1。其中,攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrS1)、磷霉素耐藥基因(fosA)、四環(huán)素耐藥基因(tetA)、氯霉素耐藥基因(catA2)均有19株(100%);氨基糖苷類耐藥基因為aadA2b和rmtB,同時攜帶兩者的菌株有17株(89.5%);磺胺類藥物耐藥基因為sul1和sul2,同時攜帶兩者的菌株有17株(89.5%);攜帶甲氧芐啶耐藥基因(dfrA14)有18株(94.7%);β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因為blaLAP-2、blaTEM-1B、blaKPC-2、blaSHV-12、blaSHV-15和blaSHV-66,同時攜帶此6種耐藥基因的菌株有15株(78.9%)。

      3 討論

      KP是院內(nèi)感染的常見致病菌之一,易造成創(chuàng)面、肺部、泌尿系統(tǒng)和血液系統(tǒng)感染[7]。本研究期間,本院KP的分離率呈逐年上升趨勢(χ2趨勢=18.190,P<0.001),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=26.800,P<0.001)。2416株KP有51.7%分離自痰液,表明KP主要感染部位為呼吸道,與其他監(jiān)測報道一致[8-10]。KP主要分布于ICU、呼吸內(nèi)科,可能由于住院患者病情危重且抵抗力低下,接受呼吸道侵入性治療多,抗菌藥物的使用較為頻繁[11],易誘導引起細菌耐藥。

      本研究中,由于近幾年臨床廣泛使用抗生素,KP的耐藥率總體呈升高趨勢。耐藥率較高的抗生素有頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南、慶大霉素、環(huán)丙沙星、復方磺胺甲惡唑,結(jié)果顯示KP對頭孢菌素的耐藥率呈逐年攀升趨勢。對碳青霉烯類藥物(如亞胺培南、美羅培南)的耐藥率相比較低,但有持續(xù)增高的趨勢[12],對亞胺培南、美羅培南耐藥率分別從2015年的2.9%、3.0%上升至2019年的16.0%、13.7%,2019年CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果報道,36所三級醫(yī)院的KP對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%、2.9%增至2019年的25.3%、26.8%[13],耐藥率高于本研究結(jié)果。提示臨床應(yīng)強化碳青霉烯類藥物的管理,防止藥物對多重耐藥菌及泛耐藥菌的選擇。本研究中KP對常用抗生素的耐藥率偏高,未發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素耐藥的KP,其原因與KPC能夠水解青霉素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、碳青霉烯類等抗菌藥物有關(guān)[8]。

      近年來,CR-KP呈現(xiàn)全球蔓延趨勢,引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[14]。本研究顯示2015—2019年本院的CR-KP的檢出率呈上升趨勢(χ2趨勢=46.176,P<0.001),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=63.973,P<0.001)。標本主要來源于痰液(43.8%),表明CR-KP的感染部位以呼吸系統(tǒng)居多,與Li等[15]的報道一致。分布科室主要集中于ICU,考慮與ICU患者常接受侵入性操作(如氣管插管、呼吸機輔助通氣)、氣道黏膜屏障易受損等因素相關(guān),提示臨床和感控部門應(yīng)加強重點部位三管的感染防控管理,以降低呼吸道CR-KP的感染率。

      碳青霉烯類抗菌藥物是耐藥腸桿菌科細菌治療的最后一道防線[16],CR-KP的檢出率和耐藥率逐年增高,給臨床抗感染治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。引起這種結(jié)果的主要原因為臨床抗菌藥物濫用、患者使用抗菌藥物時未遵照醫(yī)囑執(zhí)行,以及抗生素在農(nóng)牧業(yè)中的超量使用等[17]。目前,我國臨床針對CRE的有效用藥為替加環(huán)素、多黏菌素,也可同其他種類抗生素聯(lián)合使用[18]。本研究結(jié)果顯示,2015—2019年CR-KP對各類抗菌藥物的耐藥率總體呈升高趨勢,除慶大霉素、替加環(huán)素以外,其對各類藥物不同年份間的耐藥率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CR-KP除了對替加環(huán)素的耐藥率較低以外,對絕大部分抗菌藥物的耐藥率均偏高,對亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達100%和98.8%。提示臨床應(yīng)重視抗菌藥物使用的科學化管理,改善抗菌藥物應(yīng)用策略,重點關(guān)注替加環(huán)素、碳青霉烯類等抗菌藥物使用的監(jiān)督管理。

      CR-KP耐藥機制較為復雜,主要有產(chǎn)碳青霉烯酶、高產(chǎn)AmpC酶、外膜孔蛋白的缺失或低通透性、外排泵的過表達、藥物作用位點的改變等分子生物學機制導致[19]。其中,產(chǎn)碳青霉烯酶最為重要。A、B、D類β-內(nèi)酰胺酶為產(chǎn)碳青霉烯酶的主要分類,主要為KPC、VIM、IMP、NDM、OXA-48[20]。位于質(zhì)粒上的耐藥基因可在不同菌株間水平或垂直傳播,引起耐藥菌的播散,甚至是院感暴發(fā)的發(fā)生[21]。細菌耐藥性研究主要包括耐藥表型和耐藥基因型研究。耐藥表型常用藥敏試驗檢測,但常局限于藥物種類的不全面和少數(shù)菌株培養(yǎng)的嚴格環(huán)境;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為目前主要的基因研究方法,但僅局限于已知的基因型,分辨率較低[22]。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展,WGS與生物信息學結(jié)合的方法已逐漸成為精準研究細菌耐藥性的主流方法[23]。

      本研究選取CR-KP檢出率較高的內(nèi)科ICU,收集其2019年檢出的19株CR-KP進行WGS及耐藥基因檢測。結(jié)果顯示,19株CR-KP呈現(xiàn)出多種耐藥基因型。其中,blaKPC-2是引起耐碳青霉烯的重要機制,已廣泛存在于19株CR-KP中,其他β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因可能導致頭孢菌素耐藥。本研究中的菌株均攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrS1),Qnr蛋白是一種五肽重復蛋白家族,可以保護細菌DNA螺旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV免受喹諾酮類藥物的抑制,qnrS1是質(zhì)粒介導的7大qnr耐藥基因家族之一,Monarrez等[24]報道證實環(huán)丙沙星可誘導細菌質(zhì)粒上qnrS1的表達。17株CR-KP攜帶的aadA2b和aadA2b是aadA耐藥基因中最常見的一種類型[25],aadA基因最初于1985年發(fā)現(xiàn),有研究表明Ⅰ類整合素中存在aadA基因,該基因編碼氨基糖苷3'-9-腺苷酸轉(zhuǎn)移酶,對鏈霉素和壯觀霉素具有抗性[26]。rmtB耐藥基因位于質(zhì)粒上,其通過水平轉(zhuǎn)移和克隆傳播進行傳播[27],rmtB通過促進16S RMTA酶編碼基因的激活和轉(zhuǎn)移,實現(xiàn)16S RMTA酶誘導細菌對氨基糖苷類的高水平耐藥,影響了氨基糖苷類藥物在CR-KP感染治療中的作用[28],本研究中的19株CR-KP均攜帶rmtB基因。本研究中的藥敏試驗未檢測磷霉素,WGS耐藥基因檢測到19株CR-KP均攜帶磷霉素耐藥基因(fosA),磷霉素可能對于CR-KP的治療無效。本研究中CR-KP對替加環(huán)素均敏感,其攜帶的四環(huán)素耐藥基因均為tetA,屬于MFS型外排泵,此型不產(chǎn)生替加環(huán)素耐藥。本研究未檢測出多黏菌素耐藥基因。同時,本研究中的耐藥基因結(jié)果顯示,19株CR-KP的同源相關(guān)性較高,說明CR-KP在該病區(qū)存在院內(nèi)傳播的可能,但由于檢測菌株數(shù)目較少、代表性不強,在預測院內(nèi)傳播路徑方面的研究仍具有一定的局限性。

      綜上所述,近年來本院KP及CR-KP耐藥形勢嚴峻,耐藥基因多樣化,醫(yī)務(wù)部、醫(yī)院感染管理辦公室、藥學部、感染性疾病科、微生物室、醫(yī)學信息科等多學科抗菌藥物管理組,應(yīng)持續(xù)加強耐藥菌監(jiān)測,規(guī)范管理抗菌藥物,有效開展抗菌藥物知識培訓,落實精準的感染預防控制措施,預防耐藥菌的流行播散。 WGS結(jié)合生物信息學分析技術(shù)在細菌耐藥性研究方面表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景[29],未來將會成為耐藥菌研究最主流的方法之一。

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