李 鵬， 陳丹丹， 蔡 琳， 李 思， 彭曉紅

武漢市第四醫(yī)院麻醉科，武漢 430022

滋養(yǎng)層細(xì)胞是組成胎盤組織的主要細(xì)胞之一，其遷移和侵襲能力類似于腫瘤細(xì)胞[1]。滋養(yǎng)細(xì)胞正常的增殖、侵襲能力對胎盤血管重塑、胎兒營養(yǎng)物質(zhì)輸送具有重要作用，但其增殖及侵襲能力異常是導(dǎo)致絨毛膜癌、妊娠糖尿病、流產(chǎn)、子癇前期等妊娠期疾病發(fā)生的重要原因[2]。滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力調(diào)控機(jī)制的研究，對闡明人類多種妊娠疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)可在絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵和改造螺旋動(dòng)脈的過程中起重要作用[3]，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可在滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵子宮內(nèi)膜、轉(zhuǎn)化子宮內(nèi)壁血管過程中發(fā)揮作用[4-5]，且VEGF及MMP-9也是腫瘤遷移及侵襲的重要調(diào)控因子[6]。丙泊酚為腫瘤切除手術(shù)時(shí)施行全身麻醉的常用麻醉藥之一[7]，且越來越多研究發(fā)現(xiàn)，其可抑制人類腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[8]，但丙泊酚是否也能影響人類滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、侵襲能力還未見報(bào)道。本研究利用體外培養(yǎng)的人絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞，從VEGF/MMP-9通路角度探究丙泊酚對滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的影響，以期為人類妊娠疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器

人類絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR8-SVneo細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)王曉紅教授饋贈(zèng)。

DMEM/F12培養(yǎng)液(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SNM544-SCD)；丙泊酚(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JKG8628)；MTT試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：M1020)；BD生物涂層基質(zhì)侵襲室試劑盒(北京沃比森科技有限公司，貨號：BD2025)；VEGF、MMP-9、CD34、人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(prefoldin 1)抗體(美國Abcam公司，貨號：ab27278，ab76003，ab81289，ab134743，ab181857，ab151708)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯，型號：Olympus BX63)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

取人類絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR8-SVneo常規(guī)復(fù)蘇后，用DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)60%左右時(shí)，取對數(shù)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，并進(jìn)行如下處理：①取HTR8-SVneo細(xì)胞，分別在培養(yǎng)液中加入終濃度為0、10、25、50、100、200 μmol/L的丙泊酚溶液培養(yǎng)72 h，用MTT法及Western blot法檢測不同濃度丙泊酚干預(yù)下細(xì)胞活力及MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)；②取HTR8-SVneo細(xì)胞，加入終濃度為100 μmol/L丙泊酚溶液，分別檢測細(xì)胞在培養(yǎng)0、8、12、24、72 h時(shí)的細(xì)胞活力及MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平；③取HTR8-SVneo細(xì)胞轉(zhuǎn)染含VEGF過表達(dá)序列的腺病毒載體(ad-VEGF)及不含VEGF過表達(dá)序列的腺病毒空載體(ad-NC)，并設(shè)置對照組、丙泊酚組、ad-VEGF組、ad-NC組、丙泊酚+ad-VEGF組。對照組在正常條件下培養(yǎng)24 h；丙泊酚組在對照組基礎(chǔ)上加入終濃度為100 μmol/L丙泊酚溶液干預(yù)培養(yǎng)；ad-VEGF組及ad-NC組轉(zhuǎn)染ad-VEGF或?qū)φ障俨《究蛰d體6 h后，在正常條件下培養(yǎng)24 h；丙泊酚+ad-VEGF組在丙泊酚組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染ad-VEGF；各組均培養(yǎng)24 h后，檢測細(xì)胞活力，侵襲能力，HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達(dá)及MMP-9、VEGF、CD34陽性表達(dá)水平。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活力

取1.2項(xiàng)中處理后的各組細(xì)胞，每孔加入濃度為5 mg /mL的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱中放置4 h后，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μL搖床振蕩10 min后，在490 nm波長下，用酶標(biāo)儀讀取各組吸光度(A)值，根據(jù)公式，細(xì)胞存活率=(對照組A值-給藥組A值)/對照組A值×100%，計(jì)算出各組細(xì)胞存活率，存活率越大，預(yù)示細(xì)胞活力越強(qiáng)。

1.4 Western blot法檢測細(xì)胞MMP-9、VEGF、HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，裂解并抽提蛋白，BCA法測蛋白濃度后，取100 μg蛋白樣品行電泳及轉(zhuǎn)膜，加入一抗[MMP-9、VEGF、HLA-G、MDH、prefoldin 1抗體(1∶500)，內(nèi)參GAPDH(1∶800)]，4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(1∶2000)室溫孵育1.5 h，ELC顯影曝光，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 改良版基底膜基質(zhì)Boyden室檢測細(xì)胞侵襲能力

按說明書方法制備溶膠，4℃過夜，冰臺上用磷酸緩沖液∶膠(1∶6)制備稀Matrigel膠，每孔加入40 μL Matrigel膠工作液浸潤，37℃過夜后。上室及下室分別加入600 μL及100 μL培養(yǎng)液平衡12 h。取1.2項(xiàng)③方法下的各組細(xì)胞，重懸成濃度為1×108個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，在基質(zhì)包被的濾器中接種含胎牛血清的細(xì)胞懸液，室溫孵育24 h后，取出小室，清洗膜，固定，染色，記錄已經(jīng)通過濾器的細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞數(shù)目越多代表細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光檢測細(xì)胞MMP-9、VEGF陽性表達(dá)

取1.2項(xiàng)③方法下的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%曲拉通透化、5%胎牛血清封閉后，加入一抗(MMP-9、VEGF，1∶200)室溫孵育2 h，加入熒光二抗室溫孵育1 h，DAPI復(fù)染后，防猝滅液封片，于熒光顯微鏡下觀察，拍照并評估熒光強(qiáng)度。

1.7 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞CD34陽性表達(dá)水平

取1.2項(xiàng)③方法下的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定后，PBS漂洗3次，加入3%過氧化氫，PBS再漂洗3次，加入山羊血清封閉10 min，加入一抗(CD34，1∶300)4℃孵育過夜，加入二抗(1∶500)室溫孵育1.5 h，加入辣根酶標(biāo)記鏈卵白素工作液室溫孵育20 min，DAB顯色、中性樹脂封片，光鏡下觀察拍照，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析單位面積內(nèi)細(xì)胞陽性染色吸光度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度丙泊酚對細(xì)胞活力及VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

丙泊酚處理72 h，隨著丙泊酚濃度(0～100 μmol/L)升高，細(xì)胞活力呈逐漸下降趨勢，細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)逐漸下降(均P<0.05)，并在100～200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力及VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)趨于平衡。見圖1、圖2、表1。

與0 μmol/L組比較，*P<0.05圖1 不同濃度丙泊酚對HTR8-SVneo細(xì)胞存活率的影響(MTT檢測)Fig.1 Effect of different concentrations of propofol on the survival rate of HTR8-SVneo cells(MTT test)

圖2 不同濃度丙泊酚處理對HTR8-SVneo細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響(Western blot法)Fig.2 Effect of different concentrations of propofol on VEGF and MMP-9 protein expression in HTR8-SVneo cells(Western blot)

表1 不同濃度丙泊酚處理?xiàng)l件下HTR8-SVneo細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的比較Table 1 Comparison of VEGF and MMP-9 protein expression in HTR8-SVneo cells treated with propofol at different concentrations of

2.2 丙泊酚處理不同時(shí)間對細(xì)胞活力及VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

100 μmol/L丙泊酚處理不同時(shí)間(0、8、12、24、72 h)后，細(xì)胞隨著丙泊酚處理時(shí)間延長，細(xì)胞活力呈逐漸下降趨勢，細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)逐漸下降(均P<0.05)，并在24～72 h時(shí)，細(xì)胞活力及VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)趨于平衡。見圖3、圖4、表2。

與0 h組比較，*P<0.05圖3 丙泊酚不同處理時(shí)間對HTR8-SVneo細(xì)胞存活率的影響(MTT檢測)Fig.3 Effect of propofol treatment for different time durations on the survival rate of HTR8-SVneo cells(MTT test)

圖4 丙泊酚不同處理時(shí)間對HTR8-SVneo細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響(Western blot法)Fig.4 Effect of propofol treatment for different time durations on VEGF and MMP-9 protein expression in HTR8-SVneo cells(Western blot)

表2 丙泊酚處理不同時(shí)間后HTR8-SVneo細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的比較Table 2 Comparison of VEGF and MMP-9 protein expression in HTR8-SVneo cells treated with propofol

2.3 丙泊酚處理或過表達(dá)VEGF對細(xì)胞活力的影響

與對照組[(100.00±0.00)%]相比，丙泊酚組[(53.69±5.05)%]細(xì)胞活力降低(P<0.05)；ad-VEGF組[(146.79±10.05)%]細(xì)胞活力升高(P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組[(100.66±5.11)%]細(xì)胞活力升高(P<0.05)。ad-NC組[(101.59±5.12)%]及丙泊酚+ad-VEGF組，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.4 丙泊酚處理或過表達(dá)VEGF對細(xì)胞侵襲能力的影響

與對照組(223.35±10.06)相比，丙泊酚組(151.55±10.63)細(xì)胞侵襲數(shù)目減少，侵襲能力降低(P<0.05)；ad-VEGF組(362.53±10.99)細(xì)胞侵襲能力升高(P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組(247.07±12.08)細(xì)胞侵襲能力升高(P<0.05)。ad-NC組(221.06±10.58)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

A：對照組；B：丙泊酚組；C：ad-VEGF組；D：丙泊酚+ad-VEGF組；E：ad-NC組圖5 各組細(xì)胞侵襲能力檢測(×40)Fig.5 Cell invasion in each group(×40)

2.5 丙泊酚處理或過表達(dá)VEGF對細(xì)胞VEGF及MMP-9陽性表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，VEGF及MMP-9在對照組HTR8-SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。與對照組比較，丙泊酚組VEGF及MMP-9陽性表達(dá)減弱(均P<0.05)；ad-VEGF組細(xì)胞VEGF及MMP-9陽性表達(dá)增強(qiáng)(均P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組細(xì)胞VEGF及MMP-9陽性表達(dá)增強(qiáng)(均P<0.05)。ad-NC組及丙泊酚+ad-VEGF組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見圖6、表3。

圖6 各組細(xì)胞VEGF及MMP-9免疫熒光染色圖(×200)Fig.6 Immunofluorescence staining of VEGF and MMP-9 in cells in each group(×200)

表3 細(xì)胞VEGF及MMP-9陽性表達(dá)的比較Table 3 Comparison of VEGF and MMP-9 expression in

2.6 丙泊酚處理或過表達(dá)VEGF對細(xì)胞CD34陽性表達(dá)的影響

CD34為微血管密度升高的標(biāo)志蛋白，CD34可在對照組細(xì)胞胞質(zhì)中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。與對照組(0.99±0.05)相比，丙泊酚組細(xì)胞CD34陽性表達(dá)(0.35±0.03)減弱(P<0.05)；ad-VEGF組細(xì)胞CD34陽性表達(dá)(1.68±0.13)增強(qiáng)(P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組細(xì)胞CD34陽性表達(dá)(0.92±0.05)增強(qiáng)(P<0.05)。ad-NC組(0.93±0.06)及丙泊酚+ad-VEGF組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見圖7。

A：對照組；B：丙泊酚組；C：ad-VEGF組；D：丙泊酚+ad-VEGF組；E:ad-NC組圖7 各組細(xì)胞CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖(×400)Fig.7 Immunocytochemical staining of CD34 cells in each group(×400)

2.7 丙泊酚處理或過表達(dá)VEGF對細(xì)胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，丙泊酚組細(xì)胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)；ad-VEGF組細(xì)胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組細(xì)胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)。ad-NC組及丙泊酚+ad-VEGF組，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見圖8、表4。

A：對照組；B：丙泊酚組；C：ad-VEGF組；D：丙泊酚+ad-VEGF組；E：ad-NC組圖8 各組細(xì)胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.8 HLA-G，MDH and prefoldin 1 protein expression in cells in each group(Western blot)

表4 各組細(xì)胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達(dá)的比較Table 4 Comparison of HLA-G，MDH and prefoldin 1 protein expression in cells in each group

3 討論

正常情況下，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞在囊胚著床后開始分化，遷移、侵襲至子宮脫膜層及基層血管，啟動(dòng)螺旋動(dòng)脈重塑，建立母胎循環(huán)，維持妊娠進(jìn)行[9]。Heidari等[10]發(fā)現(xiàn)，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入過度可引起絨毛膜癌、妊娠糖尿病等疾病的發(fā)生；Ding等[11]發(fā)現(xiàn)絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖能力降低、凋亡增加、侵襲能力不足，可引起胎盤功能障礙，導(dǎo)致流產(chǎn)、子癇前期等妊娠期疾病的發(fā)生，證實(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲過深或者過淺均可引起各種妊娠疾病的發(fā)生。故探究滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲的調(diào)控機(jī)制，對闡明多種妊娠疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要意義。

丙泊酚為子癇前期剖宮術(shù)[12]、人工流產(chǎn)術(shù)[13]等妊娠疾病手術(shù)過程中的常用麻醉劑，大量研究證實(shí)，其對腫瘤增殖、侵襲能力有抑制作用[14-15]，但丙泊酚是否能影響絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、侵襲能力，并影響妊娠疾病的發(fā)生發(fā)展，還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在0～100 μmol/L濃度的丙泊酚培養(yǎng)條件下，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8-SVneo增殖能力、與侵襲相關(guān)蛋白VEGF及MMP-9表達(dá)均呈劑量及時(shí)間依賴性降低，提示丙泊酚也可抑制絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲能力。

VEGF及MMP-9為絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵子宮內(nèi)壁過程中的重要調(diào)控因子。滋養(yǎng)層細(xì)胞中的HLA-G可促進(jìn)MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)控與糖代謝有關(guān)的酶——MDH及與細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)有關(guān)蛋白prefoldin 1的表達(dá)，來促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的入侵、粘附及運(yùn)動(dòng)[16]。Zhong等[17]在子癇前期及胎兒宮內(nèi)生長受限等妊娠疾病的胎盤組織中檢測到MMP-9表達(dá)的降低。黑色素瘤轉(zhuǎn)移抑制基因編碼的肽類激素，能刺激胞外調(diào)節(jié)激酶磷酸化，抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP及VEGF表達(dá)來抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞向子宮內(nèi)壁侵襲及植入[18]。Pan等[19]發(fā)現(xiàn)，胎盤中VEGF表達(dá)降低可引起滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入缺陷、胎盤淺表著床、胎盤絨毛缺血低氧、胎盤血管重塑障礙，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，用丙泊酚處理后，HTR8-SVneo細(xì)胞胞質(zhì)中VEGF及MMP-9陽性表達(dá)及微血管密度生成標(biāo)志蛋白CD34表達(dá)降低的同時(shí)，細(xì)胞增殖、侵襲能力顯著降低，與侵襲功能相關(guān)的蛋白HLA-G、MDH、prefoldin 1表達(dá)也明顯降低。這與Xu等[20]發(fā)現(xiàn)的丙泊酚通過抑制VEGF/MMP-9通路蛋白表達(dá)來抑制食管癌的增殖及侵襲相一致。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過表達(dá)VEGF可明顯促進(jìn)絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8-SVneo增殖及侵襲能力，逆轉(zhuǎn)丙泊酚對絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖及侵襲的抑制作用。

綜上所述，丙泊酚可能通過抑制VEGF/MMP-9通路蛋白表達(dá)，抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖活力及侵襲能力。這可能為妊娠糖尿病、絨毛膜癌等因滋養(yǎng)層細(xì)胞過度侵入引起的妊娠疾病的治療提供一定依據(jù)。但滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖活力及侵襲能力的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，體內(nèi)與體外研究差異可能較大，丙泊酚在多種妊娠疾病治療中的作用及機(jī)制，還需進(jìn)一步探究。