袁強華 韓 君

（1）成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，成都 610072；2）北京康仁堂藥業(yè)有限公司中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，北京 101301）

前列腺癌是老年男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在全球男性腫瘤中，發(fā)病率和死亡率分別位列第2位和第5位［1］。近年來上市的內(nèi)分泌治療藥物只能有限改善前列腺癌患者的預(yù)后情況，并且長期使用容易出現(xiàn)耐藥性。此外，用于前列腺癌治療的化療藥如多西他賽等，其靶向效率不佳，故現(xiàn)有藥物仍有局限性［2］。這些局限性限制了前列腺癌藥物長期療效以及應(yīng)用。

從天然藥物中分離提取化學(xué)成分是抗癌藥物的來源之一。研究表明，一些中藥提取物對前列腺癌具有明顯的抗腫瘤效果［3］，因此進一步探索能夠抑制前列腺癌發(fā)生發(fā)展的中藥成分是有必要的。

白扁豆，屬于豆科植物，在全國各地均有栽培。白扁豆的種子能夠作為重要的中藥原材料，活性成分的前期研究發(fā)現(xiàn)其種子含有皂苷［4］。藥理以及臨床研究均發(fā)現(xiàn)，白扁豆總皂苷具有抗菌及增強細胞免疫的作用，小扁豆凝集素能明顯抑制肝癌細胞生長［5］。目前關(guān)于白扁豆總皂苷在前列腺癌中的作用及其發(fā)揮作用的分子機制尚未見報道。

因此，本研究擬利用白扁豆總皂苷處理前列腺癌細胞系，探究白扁豆總皂苷對前列腺癌的作用以及其發(fā)揮作用的具體分子機制，力圖為前列腺癌的臨床干預(yù)提供新的治療手段。

1 材 料

1.1 實驗材料

PC-3細胞購自中科院細胞庫，白扁豆總皂苷（批號201210）購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，PBS緩沖液（貨號B548117-0500）購自生工生物，胎牛血清（貨號16000-044）購自Gibco，胰酶（貨號C0201）、CCK8檢測試劑盒（貨號C0038）購自碧云天生物，RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物公司，兔抗人醛脫氫酶7家族成員A1（ALDH7A1）（貨號DF12247）購自Affinity Biosciences公司，兔抗人胱硫醚β合成酶樣（CBSL）（貨號AP17189PU-N）購自O(shè)riGene公司，兔抗人甘氨酸C-乙酰轉(zhuǎn)移酶（GCAT）（貨號ab181094）、兔抗人二甲基甘氨酸脫氫酶（DMGDH）（貨號ab198292），鼠抗人磷酸甘油酸變位酶家族成員4（PGAM4）（貨號ab279384）、β-肌動蛋白抗體（β-actin antibody）（貨號ab8226）、辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（貨號ab6789）、辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號ab136636）購自Abcam公司，DMEM/F12培養(yǎng)基（貨號D6421）購自Sigma-Aldrich公司，pcDNA3.1哺乳動物表達載體（貨號V79020）、Lipofectamine LTX（貨號15338500）購自Invitrogen公司。

1.2 儀器

倒置顯微鏡（IX70型Olympus公司）；酶標(biāo)儀（MK3 Thermo）；實時熒光定量PCR儀（CFX96 Bio-Rad）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

PC-3細胞用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 藥物處理

稱取白扁豆總皂苷，用二甲基亞砜（DMSO）充分溶解并配制400 g/L母液。用完全培養(yǎng)基將白扁豆總皂苷分別稀釋成終濃度為0、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 mg/L，用DMSO作為對照。

2.3 CCK8檢測

取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中，每孔接種5 000個細胞，將96孔板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。細胞培養(yǎng)過夜后，取出96孔板，吸棄培養(yǎng)基，每個實驗組加入含有上述不同濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置3個平行孔。培養(yǎng)基中加入對應(yīng)體積的DMSO為空白對照組。處理結(jié)束后向每孔中加入CCK8溶液（每孔100μl培養(yǎng)基中加入10μl CCK8）。37℃培養(yǎng)箱孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。

2.4 RNA提取

細胞分成空白對照組和1 086 mg/L白扁豆總皂苷處理組兩個組，每組3個平行孔，藥物處理24 h后，棄掉細胞培養(yǎng)液。向培養(yǎng)板中每孔加入1 ml TRizol試劑，收集細胞樣本。之后向其中加入200μl氯仿，劇烈震蕩混勻。離心，收集上層的液體，并向其中加入等體積的異丙醇，充分混勻，使RNA沉淀。離心，棄掉上清，用預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀。最后向離心管中加入適量體積的蒸餾水溶解RNA，并進行濃度測定。

2.5 反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR反應(yīng)

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)南京諾唯贊公司的HiScript?III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒（R323-01）進行，具體步驟按照說明書進行，反轉(zhuǎn)錄RNA的量為1μg。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，向每管加入180μl TE溶液或者ddH2O將cDNA稀釋10倍，并將樣本放入-20℃冰箱保存，用于后續(xù)實驗。實時定量PCR反應(yīng)參照諾唯贊公司的ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒（Q311-02）進行。首先向每管2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix中加入50μl ROX Reference Dye II，混合均勻，然后按照表1配制反應(yīng)體系：

Table 1 RT-PCR reaction system

配制好反應(yīng)液后，將液體依次加入96孔板中，最后加入cDNA。加樣結(jié)束后，用膜將96孔板封好，1 200 r/min離心1 min。接著在實時定量PCR儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件參照說明書。每個基因選用特定的引物重復(fù)檢測3次，基因的表達水平選用β-actin作為內(nèi)參。采用2-△△Ct法對基因的表達進行相對定量。引物序列如表2。

Table 2 Primers for RT-PCR

2.6 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)處理

按照之前總RNA抽提方法抽提空白對照組和白扁豆總皂苷處理組的RNA，用Qubit Fluorometer和Agilent bioanalyzer 2100對RNA進行質(zhì)量檢測，RIN值大于7.5的RNA樣品用于后續(xù)的建庫。利用NEBNext? Ultra? RNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒進行建庫，建庫后的樣本采用雙端測序（2×150 bp）。利用FastQC軟件對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析，利用HISAT2進行序列比對，參考基因組為hg19。用String Tie和Ballgown軟件找到不同處理組之間的差異基因列表。本文選用變化倍數(shù)大于2（fold change＞2）的差異基因進行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。轉(zhuǎn)錄組測序的原始數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳NCBI，序列號為：PRJNA751036。

2.7 細胞總蛋白質(zhì)抽提

首先收集不同處理組的PC-3細胞樣本，并向其中加入適量的RIPA細胞裂解液，冰上裂解細胞30 min。細胞裂解之后，以最高轉(zhuǎn)速4℃離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，即為細胞中總蛋白質(zhì)。之后利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)總濃度。測定濃度之后，向蛋白質(zhì)中加入等體積的上樣緩沖液，99℃加熱使蛋白質(zhì)變性，并將樣本保存在-20℃冰箱中。

2.8 Western blot

取40μg變性蛋白加到上樣孔中，進行SDSPAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300 mA，時間為1 h。之后將PVDF膜放置在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，分別加入對應(yīng)的一抗進行孵育（ALDH7A1一抗1∶500稀釋，GCAT一抗1∶1 000稀釋，PGAM4一抗1∶1 000稀釋，DMGDH一抗1∶1 000稀釋，CBSL一抗1∶500稀釋，β-actin一抗1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。第二天先用TBST洗膜3次，每次10 min。再加入1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。最后將超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑滴加到PVDF膜上，進行曝光成像和拍照。蛋白質(zhì)的表達以β-actin為內(nèi)參，使用Quantity One軟件分析各條帶的蛋白質(zhì)相對表達水平。

2.9 細胞轉(zhuǎn)染

為了構(gòu)建ALDH7A1過表達質(zhì)粒，本文將人全長ALDH7A1 cDNA克隆到pcDNA3.1載體中（pc-ALDH7A1）?？蛰d體pcDNA3.1為對照組（pc-NC）。按照廠商提供的說明書，使用Lipofectamine LTX將以上質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PC-3細胞中，細胞轉(zhuǎn)染48 h后收集樣本，用于后續(xù)的Western blot分析。

2.10 統(tǒng)計分析

本文采用GraphPad Prsim 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。本文使用t檢驗對不同組別進行顯著性分析。所有數(shù)據(jù)都進行至少3次獨立重復(fù)實驗。P值小于0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 白扁豆總皂苷能夠抑制前列腺癌細胞系PC-3細胞的生長

本文先用不同濃度的白扁豆總皂苷處理前列腺癌PC-3細胞，CCK8結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為0～250 mg/L時，白扁豆總皂苷對細胞的生長基本沒有影響。但是，當(dāng)濃度升高為500～4 000 mg/L時，細胞生長受到明顯抑制，并且呈濃度依賴性（圖1a，b）。進一步結(jié)果顯示，白扁豆總皂苷的IC50值為1 086 mg/L，因此后續(xù)實驗本文選用該濃度處理細胞。本文用該濃度處理細胞并收集不同時間點的細胞樣本進行檢測。RT-PCR結(jié)果顯示，隨著處理時間的延長，促凋亡標(biāo)志物BAX的mRNA水平顯著增加（圖1c）。因此，白扁豆總皂苷在體外能夠顯著抑制前列腺癌細胞的生長。

Fig 1 The effect of total saponins of Lablab Semen Album on cell growth

3.2 轉(zhuǎn)錄組分析

為了探索白扁豆總皂苷抑制前列腺癌細胞生長的分子機制，本文對空白對照組和濃度為1 086 mg/L的白扁豆總皂苷處理12 h的細胞進行了轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示，不同組別的基因表達量基本沒有差異，分布也是基本一致的（圖2a）。差異基因分析結(jié)果顯示，與對照組相比，白扁豆總皂苷處理的細胞中具有2 360個差異基因，其中1 982個基因上調(diào)，378個基因下調(diào)（圖2b）。

Fig 2 Transcriptome analysis

3.3 差異表達基因功能和通路富集分析

為了探究對照組和給藥組的差異表達基因所參與的生物學(xué)過程及其功能，本文將變化倍數(shù)大于2并且P＜0.05的差異基因進行基因組京都百科全書（KEGG）信號通路和基因功能注釋（GO）富集分析。KEGG結(jié)果顯示，差異表達基因富集在很多腫瘤相關(guān)通路，例如腫瘤代謝和IL-17相關(guān)通路等（圖3a）。GO結(jié)果顯示，差異表達基因顯著富集到有絲分裂紡錘體檢查點（mitotic spindle checkpoint）、紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint）等一系列跟癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物學(xué)過程（圖3b）。并且，這些差異基因主要分布在螺旋體雙子（gemini of coiled bodies）等（圖3c）。此外，差異表達基因的分子學(xué)功能主要跟錯配DNA結(jié)合（mismatched DNA binding）、金屬羧肽酶活性（metallocarboxypeptidase activity）和Toll樣受體結(jié)合（Toll-like receptor binding）等功能相關(guān)（圖3d）。

Fig.3 Analysis of pathways and functions enrichment of differentially expressed genes after total saponins of Lablab Semen Album act on prostate cancer cells

對代謝通路中的基因進一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要富集的差異基因有ALDH7A1、GCAT、PGAM4、DMGDH、CBSL、肌氨酸脫氫酶（SARDH）和哌可酸和肌氨酸氧化酶（PIPOX）（圖4a）。蛋白質(zhì)互作分析預(yù)測結(jié)果顯示，這7個蛋白質(zhì)之間存在相互作用（圖4b）。

Fig.4 Attribution of pathway genes and analysis of protein interaction

3.4 差異表達基因驗證

由于轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果存在一定程度的假陽性，因此為進一步證實測序結(jié)果，本文先用濃度為1 086 mg/L的白扁豆總皂苷處理PC-3細胞12 h，接著利用實時定量PCR對上述7個基因的表達進行驗證。結(jié)果顯示，在7個基因中有5個基因的mRNA水平與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，它們分別是：

ALDH7A1、GCAT、PGAM4、DMGDH、CBSL，而另外兩個基因SARDH和PIPOX的mRNA水平在不同組別之間沒有顯著差異（圖5a）。

進一步本文對這5個差異基因的蛋白質(zhì)水平也進行了檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，濃度為1 086 mg/L白扁豆總皂苷處理的PC-3細胞中ALDH7A1、GCAT和PGAM4的蛋白質(zhì)表達水平顯著降低（P<0.05），而DMGDH和CBSL的蛋白質(zhì)表達水平顯著升高（P<0.001），與之前的RT-PCR驗證結(jié)果一致（圖5b，c）。

Fig.5 Verification results of differentially expressed genes

Fig.6 Influences of ALDH7A1 overexpression on the role of total saponins of Lablab Semen Album in inhibiting prostate cancer cell proliferation

3.5 ALDH7A1過表達解除了白扁豆總皂苷對前列腺癌細胞系PC-3細胞的抑制作用

白扁豆總皂苷處理的PC-3細胞中ALDH7A1的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均顯著降低。因此，為了進一步探究ALDH7A1是否參與了白扁豆總皂苷對PC-3細胞的生長抑制作用，本文構(gòu)建了ALDH7A1過表達質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染到PC-3細胞，隨后用濃度為1 086 mg/L的白扁豆總皂苷處理細胞12 h。Western blot結(jié)果表明，ALDH7A1過表達質(zhì)粒顯著增加了PC-3細胞中ALDH7A1的蛋白質(zhì)表達（P<0.001），并且ALDH7A1過表達顯著增加了白扁豆總皂苷處理的PC-3細胞中ALDH7A1蛋白表達（P<0.01，圖6a，b）。CCK-8的結(jié)果顯示，pc-ALDH7A1轉(zhuǎn)染促進了PC-3細胞活力（P<0.001），白扁豆總皂苷處理則顯著抑制了PC-3的細胞活力（P<0.001），而進一步轉(zhuǎn)染pc-ALDH7A1后，部分逆轉(zhuǎn)了白扁豆總皂苷對細胞活力的抑制（P<0.01，圖6c），以上結(jié)果表明，白扁豆總皂苷通過下調(diào)ALDH7A1的表達抑制前列腺癌細胞系PC-3細胞生長。

4 討 論

前期研究表明，白扁豆中含有皂苷類成分，采用四極桿-靜電場軌道肼高分辨質(zhì)譜儀在負離子模式下對白扁豆總皂苷進行成分分析共鑒定出18個化合物，其中多為齊墩果烷型三萜類皂苷。如竹節(jié)參皂苷IVa（chikusetsusaponin IVa）、竹節(jié)參皂苷V（chikusetsusaponin V）和大豆皂苷I（soyasaponin I）等，且這些皂苷類成分具有廣泛的藥理活性［6-7］。采用紫外可見分光光度計測定白扁豆總皂苷（以齊墩果酸計）樣品中含量結(jié)果為52.8%。

雖然之前報道小扁豆凝集素能夠抑制肝癌細胞的生長，但關(guān)于白扁豆總皂苷在前列腺癌中的作用目前尚無報道。而本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白扁豆總皂苷的給藥濃度大于500 mg/L時，其能明顯抑制前列腺癌細胞系PC-3的生長。并且隨著處理時間的延長，白扁豆總皂苷能夠促進PC-3細胞中促凋亡蛋白BAX的表達。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，白扁豆總皂苷處理后引起的差異表達基因主要跟腫瘤代謝相關(guān)。通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在白扁豆總皂苷處理的細胞中ALDH7A1、GCAT和PGAM4的水平顯著降低，而DMGDH和CBSL的水平顯著升高。

ALDH7A1作為乙醛脫氫酶，負責(zé)將膽堿代謝后的甜菜堿醛代謝成甜菜堿［8］。研究發(fā)現(xiàn)，ALDH7A1在胰腺癌病人中高表達，其通過增加耗氧量和促進ATP的產(chǎn)生，從而促進胰腺癌的發(fā)生發(fā)展［9］。DMGDH是一種線粒體基質(zhì)黃素蛋白，負責(zé)二甲基甘氨酸的去甲基化，形成肌氨酸［10］。據(jù)報道，DMGDH在肝癌病人中顯著下調(diào)，其通過影響Akt信號通路的活化，從而促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)移［11］。PGAM4作為磷酸甘油酸變位酶（PGAM）的家族成員，是糖酵解和葡萄糖異生通路中的一種重要酶。PGAM4可以催化3-磷酸甘油酸鹽（3-PGA）轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酸鹽（2-PGA）。在腫瘤細胞中，PGAM可調(diào)節(jié)糖酵解與其他ATP產(chǎn)生通路以及糖異生之間的平衡［12］。目前，對于GCAT和CBSL兩個基因在腫瘤中的作用尚未報道。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)DMGDH的互作蛋白支架蛋白4A（Cullin4A，CUL4A），CUL4A已經(jīng)被報道能夠促進腫瘤的生長［13］，暗示DMGDH可能與CUL4A相互作用介導(dǎo)白扁豆總皂苷對前列腺癌生長的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，白扁豆總皂苷可以抑制前列腺癌細胞系PC-3細胞的生長。進一步的體外細胞實驗結(jié)果表明，白扁豆總皂苷通過下調(diào)ALDH7A1的表達從而抑制PC-3細胞生長。而之前的文獻報道ALDH7A1通過影響腫瘤代謝參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，但是在前列腺癌中其是否具有相同的作用并不清楚。因此，接下來將繼續(xù)探究白扁豆總皂苷是否通過影響腫瘤代謝抑制PC-3細胞的生長。

5 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)白扁豆總皂苷可以抑制前列腺癌細胞系PC-3細胞的生長。并且，白扁豆總皂苷可能通過影響腫瘤細胞的代謝過程發(fā)揮抑癌作用。體外細胞實驗結(jié)果表明，白扁豆總皂苷下調(diào)前列腺癌細胞中ALDH7A1的表達可能與其抑制前列腺癌細胞增殖作用相關(guān)。本研究的發(fā)現(xiàn)為前列腺癌的臨床干預(yù)提供了新的治療手段和見解。