程智美 王文利 李澤陽 孟慶勇 戴蘊平 張雅麗**

（1）中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2）中國農業(yè)大學生物學院，北京 100193）

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是由約690個氨基酸構成的一種糖基化蛋白質［1］。LF多肽鏈兩端折疊成兩個對稱的球形葉，中間由α螺旋連接，且兩個球形葉內分別含有一個鐵結合位點?，F(xiàn)有文獻已經證明LF具有促進鐵吸收［2］、調節(jié)細胞增殖和分化［3］、抗菌［1］、抗病毒［4］等功能活性。

LF是母乳中第二豐富的乳清蛋白。在人初乳中LF濃度可高達5.8 g/L，在人成熟乳中也可達到2.0～3.3 g/L［5］，顯著高于牛初乳（0.82 g/L）［6］和牛成熟乳（0.1 g/L）［7］中的LF含量。母乳中高濃度的LF在新生兒出生初期起著重要作用，尤其在新生兒抗感染方面，如新生兒對敗血癥和壞死性小腸結腸炎［8-9］的抵抗方面?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，生命早期LF的攝入可以促進仔豬的免疫細胞發(fā)育［10］、骨發(fā)育［11］和神經發(fā)育［12］等。

眾所周知，腸道是機體消化吸收營養(yǎng)物質和機體抵御外界病原微生物入侵的重要場所。哺乳期是腸道生長發(fā)育、建立成熟腸道屏障系統(tǒng)的最關鍵時期。LF作為母乳中一種重要的活性蛋白，已經被證明可以在體外促進Caco-2細胞的增殖與分化［13-14］。在體內實驗中，Hu等［15］也證明了在7日齡仔豬飲食中添加重組人源乳鐵蛋白（recombinant human Lactoferrin，rhLF）能夠改善腸道免疫反應［16］，提高腸道菌群多樣性。但目前還沒有母乳中缺失LF及補充LF后對幼體腸道發(fā)育影響的報道。另外，不同物種來源的LF氨基酸序列、糖基化位點及數(shù)量并不相同。人源LF、牛源LF和鼠源LF氨基酸序列相似性可達78.04%。人源LF含有3個潛在的N-糖基化位點：天冬酰胺（Asn）138、479、624；牛源乳鐵蛋白有5個潛在的N-糖基化位點：Asn233、281、368、476和545；鼠源乳鐵蛋白只有1個潛在的N-糖基化位點：Asn476［17］。這些不同都可能導致不同來源LF具有不同的生物學作用［3］。因此，本研究選取LF基因敲除的C57BL/6N作為哺乳母鼠以導致哺乳期乳鼠無LF的攝入，通過人工補充喂養(yǎng)rhLF及牛乳鐵蛋白（bovine Lactoferrin，bLF），比較小腸發(fā)育相關指標的變化，探討哺乳期LF的添加及不同來源LF對幼鼠腸道發(fā)育的影響。

1 材料與方法

本研究獲得中國農業(yè)大學動物倫理委員會批準（倫理批準號：SyxK 2020-0052），并遵循實驗動物福利倫理審查指南照顧和使用動物。

1.1 材料、動物與試劑

rhLF由中國農業(yè)大學生物學院戴蘊平課題組提供，為牛乳腺生物反應器高效表達的人LF經純化后獲得的蛋白質，純度≥90%；牛乳鐵蛋白（bLF）購買于美國Sigma公司，為牛乳中分離純化后獲得，純度≥85%。

雜合LF基因缺陷小鼠（品系C57BL/6N，清潔級）由北京百奧賽圖基因生物技術有限公司定制。

生理鹽水，Leagene公司；麥芽糖酶試劑盒、乳糖酶試劑盒，南京建成科技有限公司；BCA蛋白試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；RNA提取試劑盒，Magen公司；cDNA反轉錄試劑盒、UltraSYBR Mixture，康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平，德國賽多利斯公司；高速低溫離心機、Nanodrop 2000，Thermo公司；PCR儀，美國應用公司；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082），上海一恒科學儀器有限公司；切片機（RM2016），Leica公司；攤片機（KD-P/51230），江蘇省金華市科迪儀器設備有限公司；烤片機，天津市天利航空機電有限公司；全波長酶標儀，美國Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡，日本Nikon公司；移液器，德國Eppendorf公司；熒光定量PCR儀，德國Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1純合型LF小鼠的構建與鑒定

LF基因在9號染色體正鏈上，全長約23.5 kb，有17個外顯子。分析LF基因結構，選擇將外顯子3～8刪除。sgRNA分別設計在內含子2和8中，大約造成4 kb的基因組缺失，從而達到LF基因敲除的目的（圖1）。采用百奧賽圖公司基于CRISPR/Cas9開發(fā)的EGE系統(tǒng)制備模式小鼠。通過Cas9/gRNA載體顯微注射入小鼠受精卵細胞植入到假孕小鼠的子宮內，得到嵌合體的F0代小鼠。將鑒定為可遺傳基因型的F0代小鼠分別與野生型小鼠交配獲得具有穩(wěn)定基因型的F1代小鼠。F1代小鼠基因型鑒定引物設計原則如圖2。通過PCR技術鑒定F1代是否為LFko/wt的陽性小鼠；F1代的陽性小鼠進行雜交，采用PCR技術篩選出基因型為LFko/ko陽性小鼠，表1為鑒定基因型LFko小鼠所用引物。

Fig.1 Constructive strategy of LF knockout mice

Fig.2 Schematic design of primers for LF knockout mouse identification

Table 1 Primer information of LFko mouse gene identification

1.3.2乳鼠的繁育與飼喂

雜合子繁育得到的純合LF基因缺陷（KO）和同窩野生型（WT）小鼠用于純合子繁育，以得到大量年齡匹配的WT和KO小鼠用于實驗。KO和WT純合子小鼠同一時間合籠交配。分娩后，將WT新生小鼠（僅WT基因型新生小鼠用于后續(xù)實驗）隨機分為4組，每組6只：牛乳鐵蛋白組（bLF組）由KO母鼠進行喂養(yǎng)并每日人工飼喂bLF（100 mg/kg）；重組人乳鐵蛋白組（rhLF組）由KO母鼠進行喂養(yǎng)并每日人工飼喂rhLF（100 mg/kg）；BSA陰性對照組（BSA-組）由KO母鼠進行喂養(yǎng)并每日人工飼喂BSA（100 mg/kg）；BSA陽性對照組（BSA+組）由WT母鼠進行喂養(yǎng)并每日人工飼喂BSA（100 mg/kg）。100 mg/kg的劑量是根據嬰幼兒乳鐵蛋白攝入量計算及參考已發(fā)表文獻［12］，稍作修改得到。實驗期間所有母鼠被安置在一個12 h光/暗循環(huán)的可控環(huán)境中，自由獲取食與水。各成分的人工飼喂是通過人造硅膠乳頭刺激新生小鼠自我吸吮，以減少人為刺激。

1.3.3組織樣本的采集與保存

乳鼠飼喂21 d后注射麻藥后頸椎脫臼處死，采集肝臟、脾臟、腎、胸腺、小腸組織稱重，并測量小腸組織長度。切取部分十二指腸、空腸、回腸固定于4%多聚甲醛中，剩余組織-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4麥芽糖酶和乳糖酶活力測定

取小腸組織進行勻漿，離心取上清液。按照麥芽糖酶和乳糖酶測試試劑盒說明書進行后續(xù)操作，使用酶標儀記錄505 mm下的A值，并計算酶活力。

1.3.5小腸組織形態(tài)學觀察

取固定好的樣品進行組織石蠟包埋。切取厚度為5μm的薄片于載玻片，脫蠟后進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin，HE）并置于光學顯微鏡下觀察。測量小腸絨毛長度及隱窩深度并計算其比值。

1.3.6Occludin和ZO-1基因表達量檢測

根據RNA提取試劑盒說明，提取RNA進行反轉錄，所得到的cDNA-20℃保存。利用Primer軟件設計基因特異性引物（表2），以GAPDH為內參基因，參照熒光定量PCR試劑盒操作進行基因表達量的檢測。

Table 2 Primer information for qPCR experiment

1.3.7數(shù)據分析

數(shù)據以平均值±標準誤差（SEM）表示。使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，單因素方差分析（ANOVA）和事后最小顯著性差異（LSD）分析各組間的顯著性差異。如果P<0.05，則認為差異顯著。

2 結 果

2.1 LF敲除小鼠純合子的篩選鑒定

利用表1給出的2對基因型鑒定引物對小鼠進行基因型PCR鑒定，篩選出LFko/ko小鼠和LFwt/wt小鼠，部分結果見圖3。引物1 PCR鑒定顯示（圖3a），LFwt/wt（野生型）和LFko/wt（雜合子）小鼠顯示為1條404 bp大小的條帶。引物2鑒定顯示（圖3b），基因型LFko/ko和LFko/wt小鼠顯示為1條大小為564 bp的條帶。根據PCR實驗后的凝膠電泳結果判斷動物的基因型（表3）。如通過圖3可以判斷樣品1～3、6、8為LFko/wt雜合子；樣品4、7為LFko/ko純合子；而樣品5為LFwt/wt純合子。純合子被篩選出后，近親繁殖，擴大純合子規(guī)模，以備后期實驗。

Fig.3 PCR identification results of mice with LFko/ko，LFwt/wt genotypes

Table 3 Genotype comparison of animal based on expected gel electrophoresis results after PCR experiment

2.2 LF對乳鼠腸基礎指標的影響

對純合子進行自繁，然后將獲得的所有野生型仔鼠分為4組，分別為由LFko/ko基因型母鼠哺乳并人工飼喂BSA的BSA-組，飼喂bLF的bLF組，飼喂rhLF的rhLF組，以及由LFwt/wt基因型母鼠哺乳并人工飼喂BSA的BSA+組。無論是bLF還是rhLF的添加對幼鼠的體重均無顯著性影響（圖4a）。

單位長度下小腸的質量即腸密度是反應小腸發(fā)育情況的一項指標。4組小鼠的小腸指數(shù)與小腸密度均無顯著性差異（圖4b，d），但哺乳期有rhLF攝入的小鼠小腸長度顯著低于BSA+和bLF組小鼠（P<0.05），且與BSA-組小鼠差異不顯著（圖4c）。

Fig.4 Effects of LF on body weight and basic intestinal indexes in suckling pups

2.3 LF對乳鼠回腸形態(tài)的影響

對回腸的絨毛長度及隱窩深度進行測定，哺乳期飼喂rhLF的小鼠回腸絨毛長度顯著高于其他3組（P<0.05，圖5a），且隱窩深度顯著低于其他3組（P<0.05，圖5b）。從小腸絨毛長度/隱窩深度比值（Vh/Cd）的結果看出（圖5c），哺乳期有rhLF攝入的小鼠Vh/Cd值顯著高于其他3組小鼠（P<0.05），說明了哺乳期rhLF的攝入促進了回腸絨毛及隱窩的發(fā)育，對小腸吸收功能的成熟具有重要意義。

Fig.5 Effect of LF on the appearance of ileum in suckling pups

2.4 LF對乳鼠小腸組織二糖酶活性的影響

鑒定小腸組織的發(fā)育成熟度，可以通過測定組織中麥芽糖酶和乳糖酶的活性來進行評價，其中乳糖酶活性越高代表小腸發(fā)育越不成熟，而麥芽糖酶活性越高代表小腸發(fā)育越成熟［18］。本文分別測定了十二指腸、空腸和回腸的麥芽糖酶和乳糖酶活性。4組小鼠十二指腸的麥芽糖酶活性無顯著性差異（圖6a）。與陰性對照BSA-組相比（圖6b），哺乳期飼喂bLF和rhLF的小鼠的十二指腸乳糖酶活性分別降低了37.14%（P<0.01）和43.29%（P<0.01），但都顯著高于陽性對照組BSA+的乳糖酶活性（P<0.01）。另外，陽性對照BSA+組十二指腸麥芽糖酶活性/乳糖酶活性比值（M/L）顯著高于其他3組（P<0.001），與陰性對照BSA-組相比，bLF組和rhLF組十二指腸M/L值顯著性增加（P<0.05）（圖6c）。

4組小鼠的空腸麥芽糖酶活無顯著性差異（圖6d）。BSA+組小鼠空腸乳糖酶活性相比BSA-組小鼠下降了36.79%（P<0.05），bLF組、rhLF組相對于BSA-及BSA+組小鼠空腸乳糖酶活性無顯著性差異（圖6e）。與陰性對照BSA-組相比（圖6f），bLF、rhLF、BSA+組小鼠空腸M/L值分別上升了23.68%（P>0.05）、45.86%（P<0.05）和119.87%（P<0.01）。

Fig.6 Effect of LF on disaccharidase activity of small intestinal in suckling pups

4組小鼠的回腸麥芽糖酶活無顯著性差異（圖6g）。另外，與BSA-組小鼠相比，其他3組回腸乳糖酶活性均顯著性下降（圖6h）。與陰性對照BSA-組相比（圖6i），bLF、rhLF、BSA+組小鼠回腸M/L值分別上升了40.98%（P<0.05）、37.17%（P<0.05）和44.95%（P<0.05）。

2.5 LF對乳鼠回腸Occludin及ZO-1表達的影響

Occludin和ZO-1是兩種構成小腸細胞間緊密連接的重要蛋白質。與陰性對照BSA-組相比（圖7a），哺乳期有rhLF攝入的小鼠回腸組織Occludin表達量增加了20.18倍（P<0.001），而bLF與BSA+組表達量無顯著性差異。另外，與陰性對照BSA-組相比（圖7b），rhLF組小鼠回腸ZO-1表達量增加了2.11倍（P<0.05），但bLF與BSA+組表達量無顯著性差異。

Fig.7 Comparisons of LF on Occludin and ZO-1 expression of ileum in suckling pups

3 討 論

為了探究哺乳期LF的缺失及不同來源LF對幼鼠腸道生長發(fā)育的影響，本研究選取bLF和rhLF兩種乳鐵蛋白，分別對哺乳期無LF攝入的小鼠進行補充喂養(yǎng)并在21 d時測定其腸道發(fā)育情況。結果顯示，rhLF的補充顯著性增加小鼠回腸絨毛長度/隱窩深度值、上調回腸Occludin及ZO-1基因的表達，并提高小鼠十二指腸、空腸及回腸二糖酶M/L值。但bLF的補充僅顯著性增加了小鼠十二指腸及回腸二糖酶M/L值。

生命早期是機體建立小腸分級結構和多功能的關鍵時期，在此時期正確建立小腸上皮和隱窩具有重要意義。小腸絨毛高度與隱窩深度的高比例已被視為營養(yǎng)消化吸收能力提高的標志［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，哺乳期rhLF的添加有利增加了回腸絨毛長度并減少了隱窩深度，Vh/Cd值顯著性增大，這說明rhLF組小鼠可能比其他3組具有更高的消化吸收能力。Hu等［20］對哺乳期乳豬添加bLF飲食的研究中發(fā)現(xiàn)，bLF的添加顯著提高了第8天和第21天乳豬空腸Vh/Cd值，而對回腸Vh/Cd值無顯著性影響。LF對腸道形態(tài)的不同影響可能是由于不同來源的LF及不同濃度LF對小腸上皮細胞分化和增殖的調控不同［13，21-23］。此外，絨毛和隱窩的結構變化通過影響二糖酶的活性來影響小腸對碳水化合物的利用效率［24］。乳糖酶活性在新生兒出生后迅速發(fā)展達到最大值，并隨著小腸的發(fā)育成熟其活性逐漸降低至穩(wěn)定水平，而麥芽糖酶活性隨個體的腸道發(fā)育成熟而逐漸升高。因此M/L值可用來表征腸道發(fā)育成熟程度［18］。早在2001年，Zhang等［25］在高表達（12 g/L）hLF轉基因母鼠哺乳的10日齡幼鼠中觀察到十二指腸M/L值顯著提高。本研究中也發(fā)現(xiàn)哺乳期bLF和rhLF的添加顯著提高了十二指腸和空腸M/L值。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，哺乳期bLF和rhLF的添加顯著增加了回腸M/L值，且rhLF的添加還顯著增加空腸M/L值。LF對不同腸段二糖酶的影響不同可能是由于LF濃度及給藥方式及處理時間不同引起的?？傊?，這些結果表明哺乳期LF的添加能夠促進小腸的發(fā)育成熟并提高其對碳水化合物的利用效率。

腸屏障是機體對抗外界不利因素的第一道防線。機械屏障是腸屏障中最重要的一種，腸黏膜上皮細胞通過緊密連接蛋白互相連接，形成完整的生物屏障。細胞質跨膜蛋白與銜接蛋白形成的復雜蛋白質網絡結構是腸上皮細胞間緊密連接的重要組成部分。Occludin是最早發(fā)現(xiàn)的緊密連接蛋白，通常Occludin通過細胞膜外部與相鄰細胞結合以產生旁閉合［26］。ZO-1能夠通過與Occludin的相互作用連接跨膜蛋白和細胞骨架，影響細胞間的緊密聯(lián)系，從而調節(jié)其通透性［27］。這兩種蛋白質的表達減少或結構損傷會破壞腸道屏障功能，導致腸壁通透性增加［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，rhLF組小鼠回腸組織中Occludin的表達量上調了20.18倍（P<0.001），ZO-1的表達量上調了2.11倍（P<0.05）。在體外對Caco-2細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，50 mg/L和100 mg/L濃度的bLF能夠顯著上調Occludin和ZO-1的表達［13］。但在本研究中，bLF對小鼠回腸組織這兩種蛋白質的表達有上調現(xiàn)象但并不顯著，其可能是因為本實驗使用的bLF濃度較小且經過胃腸道消化后并未能達到體外實驗所用bLF濃度。總之，哺乳期LF的補充增強了乳鼠回腸組織Occludin和ZO-1的表達，且rhLF的增強效果較bLF更加顯著。

4 結 論

不同來源的LF在氨基酸結構、糖基化位點和糖基化程度上都有所差別，本實驗發(fā)現(xiàn)，缺失LF攝取的乳鼠腸道發(fā)育成熟度明顯下降，而人工飼喂不同來源的LF進行回補后，乳鼠的腸道發(fā)育成熟度、消化吸收能力、腸道屏障功能均得到明顯改善。并且bLF和rhLF的回補效果也有所差異，rhLF比bLF表現(xiàn)出更有效的作用。這說明不同來源的LF由于其結構的差異性，可能導致其對乳鼠腸道細胞的生理功能產生差異。這些結果提示，在進行初生嬰幼兒食品添加LF時，應該進行更深入的科學探索。