茶葉浸取液制備的納米銀對(duì)土壤微生物的影響

洪慈清，孫語遙，莫雯婧，方 云，陳芳容，桂芳澤，關(guān) 雄，潘曉鴻

（福建農(nóng)林大學(xué)閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&海峽兩岸特色作物安全生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，福州 350002）

0 引言

納米銀是一種粒徑處于納米(1×10-9m)級(jí)別上的超精細(xì)單質(zhì)銀粒子，因其尺寸小、比表面積效應(yīng)大及宏觀量子隧道效應(yīng)等[1]，在醫(yī)學(xué)、催化、水處理、電子工業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)添加了納米銀的醫(yī)用抗菌敷料能夠?qū)齻颊咂鸬搅己玫目咕熜3]；利用納米銀修飾的電極活性位點(diǎn)較為豐富，可用于提高電極的靈敏度[4]；LIN等[5]通過試驗(yàn)證明復(fù)合海藻酸的銀納米材料具有良好的消毒性能；VAN[6]等制備氧化石墨烯/銀納米抗菌復(fù)合材料，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果顯著，最小抑菌濃度為0.16 μg/mL。當(dāng)前，物理手段、化學(xué)手段以及生物手段均可用于制備納米銀，而生物手段主要分為微生物還原法和植物還原法共2種[7]。相較于其他方法，植物還原法對(duì)設(shè)備技術(shù)要求不高、對(duì)人體危害較小，且其來源豐富，產(chǎn)生的代謝物較少[8]，因此，利用植物還原法制備納米銀，該過程綠色環(huán)保、價(jià)格低廉、社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益較高。如今已發(fā)表的研究論述了柿果皮、酸棗葉、苦艾、銀杏葉等植物及其提取物用于制備納米銀的方法，例如，ALI等[9]通過探究得到，若用苦艾為原料制備尺寸較小、穩(wěn)定性好且產(chǎn)率高的納米銀，其最佳比例為6體積苦艾提取物(10 mg/mL)與4體積硝酸銀溶液(2 mmol/L)混合，說明植物還原法能夠有效制備納米銀。

隨著納米材料的廣泛應(yīng)用，直接或間接導(dǎo)致了一些醫(yī)學(xué)和環(huán)境上的問題，如在使用過程中發(fā)生風(fēng)化、磨損、老化等現(xiàn)象，導(dǎo)致納米材料釋放到環(huán)境中[10]，從而給環(huán)境帶來隱患，對(duì)生物體和人類產(chǎn)生潛在的威脅，故納米材料的生物安全性問題得到了學(xué)者的大量關(guān)注。石墨烯納米材料雖然被證明生物相容性很好[11]，但MA等[12]研究發(fā)現(xiàn)，若石墨烯的尺寸較小則更易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，而尺寸較大的石墨烯更易于導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，且均具有一定的細(xì)胞毒性。當(dāng)前對(duì)納米銀的危險(xiǎn)評(píng)價(jià)也引起了廣泛關(guān)注，何偉等[13]總結(jié)了納米銀對(duì)呼吸道有一定的危害，易損傷肺泡甚至是心臟、肝臟等人體器官，但羅斌等[14]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)重度燒傷患者采用外敷納米銀敷料，能夠在無明顯毒副作用的情況下，較好地促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合并抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生，與其他學(xué)者研究結(jié)論一致[3]；蔡鳴等[15]也通過研究表明納米銀敷料的藥物能有效縮短瘡口愈合時(shí)間且安全性好。

鑒于當(dāng)前將納米材料作為抗菌劑的潛力，應(yīng)該對(duì)其安全性進(jìn)行深入評(píng)估，而目前納米銀對(duì)土壤微生物影響的報(bào)道不夠系統(tǒng)。因此，本研究利用茶葉浸取液通過植物還原法制備納米銀，并將其制成1000 mg/L的納米銀噴霧，設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，探究納米銀對(duì)土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，以驗(yàn)證茶葉浸取液制備的納米銀的安全性，拓寬納米銀材料的潛在應(yīng)用范圍，以期為納米材料在環(huán)境及醫(yī)療等領(lǐng)域的深入應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤取自福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)后山茶園。鐵鍬；10目篩網(wǎng)；經(jīng)過高壓蒸汽滅菌、錫箔紙包裹的1000 mL燒杯；托盤；100 mL噴霧瓶；冰袋；一次性手套；75%酒精（國藥公司）。

納米銀為前期實(shí)驗(yàn)室利用茶葉浸取液還原AgNO3溶液制備得到的15.41 nm的小顆粒納米材料，其對(duì)茶擬盤多毛孢和大腸桿菌的生物活性良好[16]。

試驗(yàn)在福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，于2021年4—6月進(jìn)行。

1.2 納米銀對(duì)土壤微生物的影響

1.2.1 土壤樣本取樣 于福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)后山茶園中，選擇海拔較高、人為干擾小的一塊1 m×1 m的正方形土地作為采樣樣方。將覆蓋在土壤上的雜物除去，用攜帶的酒精對(duì)鐵鍬進(jìn)行擦拭。采用五點(diǎn)取樣法，除去表層約2 cm的土壤而挖取深約2～10 cm處的土壤。將所得土壤放入前期高壓滅菌后的燒杯中，用錫箔紙重新包裹后帶回實(shí)驗(yàn)室。

用已消毒過的10目篩網(wǎng)過篩，去除樣本中的植物、可見動(dòng)物以及石粒等。

1.2.2 土壤樣本對(duì)照處理 將過篩后的土壤平均分成2部分，分別平鋪在高壓滅菌后的托盤里。實(shí)驗(yàn)組噴灑1000 mg/L茶葉浸取液制備的納米銀溶液，對(duì)照組噴灑等量的蒸餾水，一天3次，培養(yǎng)3天。將托盤置于通風(fēng)處，盡量保持土壤微生物原有的生長條件。

1.2.3 土壤DNA的提取 采用五點(diǎn)取樣法對(duì)培養(yǎng)后的土壤樣品分別進(jìn)行取樣，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均取約10 g，將所得樣品分別裝進(jìn)不同的密封袋，標(biāo)清樣品名稱：對(duì)照組為CK，實(shí)驗(yàn)組為Nano-Ag，干冰保存送樣至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。對(duì)土壤微生物中細(xì)菌16S選擇338F_806R區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，通用引物采用帶有條碼的338F和806R（表1），每個(gè)樣本的PCR反應(yīng)進(jìn)行3次擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別見表2和表3。

表1 通用引物信息

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

表3 PCR擴(kuò)增條件

試驗(yàn)采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase，共20 μL反應(yīng)體系（PCR儀型號(hào)為ABI GeneAmp? 9700）。

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，從中取出3 μL的產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測其目的片段。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用微生物多樣性云平臺(tái)對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析。

1.3.1 物種注釋及分類學(xué)分析 以silva數(shù)據(jù)庫為對(duì)比，采用貝葉斯算法(RDP classifier)對(duì)OTU序列（相似水平＞97%）進(jìn)行分類學(xué)統(tǒng)計(jì)，并在Domain（域）、kingdom（界）、Phylum（門）、Class（綱）、Order（目）、Family（科）、Genus（屬）、Species（種）8個(gè)分類學(xué)水平上，分析空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的群落物種組成。等級(jí)豐度曲線的橫坐標(biāo)代表的是OTU數(shù)目排序等級(jí)，等級(jí)豐度曲線的縱坐標(biāo)代表的是OTU水平下的物種數(shù)目相對(duì)百分含量。如果等級(jí)豐度曲線以平滑的趨勢下降，則能夠說明樣本的物種多樣性較高，而以極快的趨勢下降，則說明樣本中的物種多樣性較低。

1.3.2 物種聚類分析 根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取門、綱、屬(Phylum，Class，Genus)這3個(gè)分類水平，對(duì)空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的物種組成繪制群落物種相對(duì)豐度柱形圖或餅狀圖，以能夠直觀觀察和比對(duì)各樣本在以上3個(gè)不同分類水平上的優(yōu)勢菌群和比例差異。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本在科水平上的物種注釋結(jié)果及相對(duì)豐度差異信息，繪制熱圖并比對(duì)哪些菌群在科水平上為優(yōu)勢菌群（含量較高）。

1.3.3 Alpha多樣性分析 總共采用5個(gè)相關(guān)指數(shù)來反映空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的土壤樣品中微生物群落的豐富度以及多樣性，相關(guān)指數(shù)主要有覆蓋度(Goods_Coverage)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

提取土壤微生物的DNA并采用帶有條碼的338F和806R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，得到的凝膠電泳圖中目的條帶單一且清晰（圖1，對(duì)照組為1，實(shí)驗(yàn)組為2），表明DNA提取成功。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

2.2 微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 測序飽和度分析 通過對(duì)細(xì)菌16S中338F_806R的序列進(jìn)行擴(kuò)增檢測，數(shù)據(jù)序列優(yōu)化后一共得到有效序列數(shù)110928條，優(yōu)化堿基數(shù)目45860303 bp，平均有效讀長為413 bp。細(xì)菌16S擴(kuò)增測序數(shù)據(jù)飽和度是反映土壤DNA樣品物種是否充分的被測到，而稀釋曲線則是一個(gè)重要的指標(biāo)，通過評(píng)價(jià)測序的數(shù)據(jù)量能夠在一定程度上間接體現(xiàn)物種的豐富程度[17]。如測序結(jié)果的稀釋曲線所示（圖2），在橫坐標(biāo)（樣品測序數(shù)目）不斷增大的情況下，可以看出后期OTU數(shù)目趨于穩(wěn)定且曲線是較平緩的趨勢，這充分說明樣品取樣充分合理，而且本次測序的深度能夠大體上滿足土壤微生物多樣性研究的要求。

圖2 土壤樣品DNA的稀釋曲線圖

2.2.2 納米銀對(duì)土壤微生物多樣性的影響 對(duì)物種進(jìn)行注釋有助于深入分析其多樣性，故在OUT水平上進(jìn)行分類學(xué)統(tǒng)計(jì)得到分類單元(Taxon)個(gè)數(shù)為：Domain：1，Kingdom：1，Phylum：25，Class：60，Order：138，F(xiàn)amily：218，Genus：357，Species：590，OUT：1041。由 Rank-Abundance curves曲線（圖3）得知，隨OUT數(shù)目的增加，曲線下降速度逐漸趨于平緩，說明樣品的物種多樣性較高。

圖3 等級(jí)豐度曲線

采用Alpha多樣性作為指標(biāo)對(duì)土壤微生物豐富度和均勻度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[18]。通過比較土壤樣本空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的Alpha多樣性，主要分析群落多樣性（香農(nóng)Simpson指數(shù)和辛普森Shannon指數(shù)）以及群落豐富度（Chao指數(shù)和ACE指數(shù)）兩方面，可以反映出茶葉浸取液制備的納米銀對(duì)土壤微生物造成的影響（表4）。

表4 多樣性指數(shù)表

覆蓋度(Goods_Coverage)指數(shù)反映了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的樣本序列被檢測出的可能性。而空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的Coverage數(shù)值均大于99.71%，數(shù)值較高，樣本序列極大可能被檢出，能夠體現(xiàn)出對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中土壤微生物的真實(shí)生長情況。

而反映群落多樣性的指數(shù)（Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)）說明：空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在OUT水平上的Shannon指數(shù)均大于5.46，而兩組在OUT水平上的Simpson指數(shù)均小于0.02，且空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中微生物的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的數(shù)值差異較小，這說明茶葉浸取液制備的納米銀并不顯著影響土壤中細(xì)菌的多樣性。參考相關(guān)文獻(xiàn)得知若Shannon指數(shù)數(shù)值越高，則群落多樣性越高，但Simpson指數(shù)則相反[19]。Shannon和Simpson 2種指數(shù)得出的結(jié)論相互驗(yàn)證，說明了茶葉浸取液制備的納米銀對(duì)土壤微生物群落多樣性并無顯著影響，一定程度上證明了納米銀的安全性。

采用ACE指數(shù)和Chao指數(shù)作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組樣本的豐富度，從表4數(shù)據(jù)可知：納米銀的噴灑對(duì)ACE和Chao指數(shù)的影響均不大，ACE指數(shù)差異小于2，Chao指數(shù)差異小于6，表明當(dāng)土壤受到茶葉浸取液制備的納米銀處理后，并不明顯影響微生物群落的豐富度，且對(duì)細(xì)菌群落多樣性無顯著差異。

2.2.3 納米銀對(duì)土壤微生物群落組成的影響 空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的土壤DNA樣本文庫在細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度中顯示出高度相似性。噴灑了納米銀的實(shí)驗(yàn)組與噴灑了蒸餾水的空白對(duì)照組的土壤中，所具有的物種類別基本一致，但是不同類別物種的豐度具有一定差異。圖4左圖所示，樣本中主要的細(xì)菌門有放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚 壁 菌 門 (Firmicutes)、酸 桿 菌 門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、粘菌門(Myxomycota)和浮霉菌門(Planctomycetes)，而不能被分類到任何組的序列被歸類為其他(others)。從圖中可以看出優(yōu)勢菌門為放線菌門，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的樣本中占比均超過40%，其次為變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、粘菌門和浮霉菌門，相對(duì)豐度分別達(dá)到20.72%～30.64%、7.27%～17.45%、5.84%～7.07%、5.04%～7.41%、1.74%～2.34%、1.03%～1.23%、0.62%～1.13%。而CK空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組豐度存在較大差異的是變形菌門和綠彎菌門，說明茶葉浸取液制備的納米銀的處理對(duì)變形菌門的部分菌群產(chǎn)生抑制作用，而對(duì)綠彎菌門的部分菌群生長產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用。

圖4右圖顯示，在綱水平上優(yōu)勢細(xì)菌綱（相對(duì)豐度＞3%）主要有放線菌綱(Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)、纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、酸微 菌 綱 (Acidimicrobiia)、γ- 變 形 桿 菌(Gammaproteobacteria)，它們的相對(duì)豐度分別為26.11%～27.34%、18.44%～26.25%、11.56%～15.52%、3.23%～11.64%、5.05%～5.90%、3.80%～5.32%、2.29%～4.39%。其中，茶葉浸取液制備的納米銀對(duì)α-變形菌綱、嗜熱油菌綱和纖線桿菌綱的影響較大，對(duì)α-變形菌綱和嗜熱油菌綱產(chǎn)生抑制生長作用且促進(jìn)纖線桿菌綱的生長。

圖4 不同樣本中細(xì)菌門和綱水平的相對(duì)豐度（左為門水平，右為綱水平）

通過空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的土壤樣品之間的細(xì)菌屬的豐度占比匯總（圖5，相對(duì)豐度＞1%均已在圖中注明），樣本中主要的細(xì)菌屬（相對(duì)豐度＞2%）有3種，還有未分類細(xì)菌(unclassified bacteria)、未明確細(xì)菌(norank bacteria)及其他(Others)，占比超過60%。在3種已分類的菌屬中，熱酸菌屬(Acidothermus)最有優(yōu)勢，相對(duì)豐度達(dá)到11.82%～15.52%，其次是鏈霉菌屬(Streptomyces)和桿菌(Bacillus)，占比為2.61%～2.77%、1.93%～2.59%。

圖5 不同樣本中細(xì)菌屬水平的相對(duì)豐度（左為CK，右為Nano-Ag）

繪制科水平上的熱圖（圖6），其中較為優(yōu)勢的科有熱酸菌科(Acidothermaceae)、黃色桿菌科(Xanthobacteraceae)等，在進(jìn)行茶葉浸取液制備的納米銀處理后，對(duì)熱酸菌科和黃色桿菌科的影響較為明顯（前者表現(xiàn)為促進(jìn)效果，后者表現(xiàn)為抑制作用），但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間2個(gè)科的相對(duì)豐度差異均小于6%，不能夠說明噴灑茶葉浸取液制備的納米銀對(duì)土壤微生物細(xì)菌科有顯著影響。

圖6 群落熱圖呈現(xiàn)科水平下（相對(duì)豐度排名前30位）不同樣本之間的差異

3 結(jié)論與討論

本課題組前期工作探討了納米銀的制備過程[16]，以茶葉浸取液為原料，用植物還原法制備的納米銀為小顆粒狀形貌，對(duì)茶擬盤多毛孢和大腸桿菌的抑菌率可達(dá)96.05%和61.87%。對(duì)比其他方法制備納米銀[20-22]，用該法制備納米銀抗菌材料，原料來源簡單，價(jià)格低廉，綠色環(huán)保，具有社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益高的特點(diǎn)。本研究將制得的納米銀抗菌材料制成納米銀噴霧，并設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)合數(shù)據(jù)手段探究噴灑納米銀對(duì)土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響。通過對(duì)細(xì)菌16S中338F_806R的序列進(jìn)行擴(kuò)增檢測，數(shù)據(jù)序列優(yōu)化后一共得到有效序列數(shù)110928條，優(yōu)化堿基數(shù)目45860303 bp，平均有效讀長為413 bp。通過后續(xù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明：在土壤微生物多樣性方面，噴灑納米銀后，空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的Coverage數(shù)值均大于99.71%，能夠體現(xiàn)出對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中土壤微生物的真實(shí)生長情況；空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在OUT水平上的Shannon指數(shù)均大于5.46，而兩組在OUT水平上的Simpson指數(shù)均小于0.02，且空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中微生物的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的數(shù)值較為接近，2種指數(shù)得出的結(jié)論相互驗(yàn)證，說明了噴灑茶葉浸取液制備的納米銀并不顯著影響土壤微生物群落多樣性，一定程度上證明了納米銀的安全性；而ACE指數(shù)差異小于2，Chao指數(shù)差異小于6，這些結(jié)果表明當(dāng)土壤受到噴灑茶葉浸取液制備的納米銀處理后，并不明顯影響微生物群落的豐富度，且對(duì)細(xì)菌群落多樣性無顯著差異。

在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)方面，空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的土壤中，所具有的物種類別基本一致，但是不同類別物種的豐度具有一定差異。從門水平來說，噴灑茶葉浸取液制備的納米銀的處理對(duì)變形菌門產(chǎn)生抑制生長作用，而對(duì)綠彎菌門產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用；從綱水平來說，納米銀對(duì)α-變形菌綱和嗜熱油菌綱產(chǎn)生抑制作用而促進(jìn)纖線桿菌綱的生長；從相對(duì)豐度排名前30位的細(xì)菌科水平上看，相對(duì)豐度變化較大的有熱酸菌科和黃色桿菌科，但相對(duì)豐度差異均小于6%，不能夠說明噴灑納米銀對(duì)土壤微生物細(xì)菌科有顯著影響，并且對(duì)土壤微生物而言具有一定程度的生物安全性。

據(jù)報(bào)道，納米銀-氧化淀粉涂膜對(duì)果實(shí)去皮后納米銀遷移率僅為1%～9%，其累積量遠(yuǎn)低于歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)，說明納米銀復(fù)合材料對(duì)去皮果實(shí)并無較大的毒害作用[23]；陳江魁[24]對(duì)小鼠經(jīng)口灌喂5000 mg/kg納米銀后小鼠安全，表明納米銀并未誘變小鼠骨髓PCE，有一定的生物安全性；納米銀復(fù)合活性炭纖維布無菌止血敷料對(duì)燒傷創(chuàng)面的愈合有良好的促進(jìn)作用且安全性較好[25]。本研究結(jié)論與前人研究較為相似，均證明了納米銀抗菌材料具有一定程度的生物安全性，展現(xiàn)了納米銀材料良好的應(yīng)用前景。

本研究通過實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析，探究了噴灑茶葉浸取液制備的納米銀對(duì)土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響。從多樣性指數(shù)表（表4）可知，空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Goods_Coverage指數(shù)的數(shù)值差異并不顯著；從群落結(jié)構(gòu)分析圖（圖4～6）可知，在門、綱、科、屬水平上，實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果均與對(duì)照組無顯著差異。該結(jié)果在一定程度上驗(yàn)證了噴灑茶葉浸取液制備的納米銀的生物安全性，為納米銀作為抗菌材料提供了理論依據(jù)，為今后納米材料在環(huán)境、醫(yī)療等方面的深入研究奠定基礎(chǔ)。