張建華， 楊延鈞， 呂彥鵬， 金雯雯， 陳傳亮

(1.鄭州大學 電氣工程學院，河南 鄭州 450001； 2.河南省人民醫(yī)院 放射科，河南 鄭州 450003)

0 引言

近年來，針對腫瘤治療的研究，出現(xiàn)了許多腫瘤治療新技術(shù)，其中脈沖電場電穿孔技術(shù)在腫瘤治療中已經(jīng)取得了卓越成效，是目前腫瘤治療的研究熱點[1-3]。所謂電穿孔(electroporation，EP)是指當細胞置于高壓脈沖電場時，細胞膜的通透性瞬間提高，平時不能通過完整細胞膜的外源分子能夠輕易地進入細胞內(nèi)部，在生物醫(yī)學領(lǐng)域中分為可逆電穿孔(reversible electroporation，RE)與不可逆電穿孔(irreversible electroporation，IRE)。可逆電穿孔是指脈沖電場撤去后，細胞膜通透性逐漸恢復，細胞的正常生理活動未受影響[4]。當脈沖場強足夠高或者作用時間足夠長時，細胞膜的通透性在脈沖電場撤去后不能恢復，從而誘導細胞死亡，這種現(xiàn)象叫做不可逆電穿孔[5]。

基于可逆電穿孔的原理，微秒脈沖電場(mirosecond pulsed electric fields，μsPEF)已成功應用于腫瘤的化學藥物治療。μsPEF具有靶向作用于細胞膜的特點，被用來提高很難滲透進細胞的藥物在癌癥組織中的濃度，具有局部增強的細胞毒性效應[6]，可有效減少抗腫瘤藥物的使用劑量從而降低毒副作用。當前可逆電穿孔電化學療法多與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，但是傳統(tǒng)化療藥物會對人體正常組織無差別殺傷，使人體產(chǎn)生多種不良反應并且價格昂貴[7]。

近年來中醫(yī)藥在改善肺癌術(shù)后、放化療后的不良反應以及抗腫瘤生長方面發(fā)揮著越來越重要的作用[8]。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)是中藥黃芪的主要揮發(fā)性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化應激等作用，是重要的輔助治療藥物和保健品原料。研究證實，EPA對不同類型的癌細胞具有細胞活性抑制或誘導凋亡的作用，能抑制腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移[9]。并且研究顯示，EPA在對肺癌A-549細胞發(fā)揮特異性毒性的同時，合適劑量下對正常人體細胞無毒性[10]。但是單獨使用EPA對癌細胞的殺傷效果較弱，多與其他藥物聯(lián)合使用[11]。

為了探究μsPEF是否對EPA的藥效具有促進作用，本文通過篩選合適的藥物濃度及電場強度參數(shù)，研究μsPEF產(chǎn)生的可逆電穿孔對EPA藥效的促進作用，為后續(xù)電化學療法中藥物的選用提供新思路，并且為后續(xù)中藥成分干預癌癥的治療提供了重要的促進手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

人肺癌細胞株A-549(ProcellCL-0016)、EPA(純度>99%，Sigma-Alidrich)、全自動酶標儀(SIGMA960)、1640培養(yǎng)基(索萊寶)、胎牛血清(索萊寶)、胰蛋白酶(索萊寶)、CCK-8試劑盒(索萊寶)、碘化丙啶(MedChemExpress)、無水乙醇(索萊寶)、電極杯(BTX)、脈沖發(fā)生設(shè)備(課題組自行研制)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肺癌A-549細胞培養(yǎng)傳代，待細胞融合度達到80%以上時，取對數(shù)生長期的細胞，制備單細胞懸液以備實驗。

1.3 EPA毒性效果檢測

采用CCK-8法檢測細胞活性，取培養(yǎng)完成的細胞消化離心，調(diào)整細胞數(shù)密度為4×105mL-1。各組分別加入不同EPA濃度的含藥培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培育24 h，然后加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1.5 h。全自動酶標儀檢測各實驗組在450 nm波長的OD值，每組測5次，實驗重復3次，取均值，計算細胞活性。

1.4 脈沖發(fā)生設(shè)備

實驗裝置如圖1所示，微秒脈沖發(fā)生設(shè)備為實驗室自制，通過控制全固態(tài)絕緣柵雙極型晶體管(IGBT)開關(guān)的開斷來產(chǎn)生高壓脈沖電場。裝置產(chǎn)生的電壓：幅值0～3 kV可調(diào)，脈沖寬度1 μs～1 ms可調(diào)，頻率0.1～100 Hz可調(diào)。

圖1 高壓脈沖裝置示意圖Figure 1 Schematic diagram of high voltage pulse device

1.5 細胞膜通透性檢測

使用熒光染料碘化丙啶(PI)染色的方法檢測細胞膜穿孔率。PI是一種細胞核染色試劑，PI不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對細胞核染色。對細胞進行μsPEF處理后，細胞膜表面形成電穿孔，使PI能夠進入細胞對細胞核進行染色。

1.6 μsPEF處理細胞實驗

對于電場殺傷實驗，培養(yǎng)完成的細胞消化離心后重懸，調(diào)整細胞數(shù)量濃度為4×105mL-1，取120 μL細胞懸液放入電極杯中(電極間距0.4 cm)，用電場強度為750～2 000 V/cm(場強間隔為250 V/cm)，頻率為1 Hz，脈寬100 μs，個數(shù)10個的μsPEF處理，培養(yǎng)一定時間后用CCK-8法檢測細胞活性。

對于細胞通透性檢測實驗，培養(yǎng)完成的細胞消化離心后重懸，調(diào)整細胞數(shù)量濃度為4×107mL-1。取10 μL細胞懸液加入50 μL的PBS以及6 μL濃度為1.5 mmol/L的PI，靜置3 min充分混勻后用μsPEF處理。然后從電極杯中取出50 μL細胞懸液放入EP管中避光3 min，再加入500 μL的PBS，對照組不進行脈沖電場處理，其他操作與實驗組完全相同。避光放置10 min后用流式細胞儀檢測PI染色率。

對于電場聯(lián)合藥物實驗，培養(yǎng)完成的細胞消化離心后，分別加入含EPA以及不含EPA的培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞數(shù)量濃度為4×105mL-1。設(shè)置實驗分組：①μsPEF+EPA實驗組；②EPA組；③μsPEF組；④空白對照組。細胞重懸后立刻取120 μL細胞懸液放入電極杯中進行μsPEF處理，空白對照組為相同體積不加EPA并且不經(jīng)過μsPEF處理的細胞懸液。處理后以每孔取20 μL(細胞數(shù)量8 000個)的體積，加入96孔板各個復孔中，再加入各實驗組相同藥物濃度的含藥培養(yǎng)基補充體積至每孔100 μL，培養(yǎng)24 h(48 h)后用CCK-8法檢測細胞活性。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有實驗至少重復3次，數(shù)據(jù)均進行齊性檢驗和正態(tài)檢驗，以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS23.0軟件進行分析。同一時間點的比較采用獨立樣本t檢驗或方差分析。P<0.05時有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EPA對A-549細胞的毒性效果

A-549細胞活性與EPA濃度的關(guān)系如圖2所示，隨著EPA濃度的提高，A-549細胞活性呈逐漸下降的趨勢，并且與對照組相比，實驗組都有統(tǒng)計學差異。當EPA濃度小于100 μmol/L時，對A-549細胞的活性影響很微弱，當EPA濃度大于500 μmol/L時對A-549細胞的毒性過強。后續(xù)實驗所用EPA濃度區(qū)間選擇100～400 μmol/L。

圖2 EPA對肺癌A-549細胞的毒性效果Figure 2 Toxic effect of EPA on lung cancer A-549 cells

2.2 細胞膜通透性

圖3為微秒脈沖電場作用下細胞膜穿孔率數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖。細胞穿孔率隨電場強度的升高而升高，當場強達到1 000 V/cm時，細胞穿孔率顯著增高；而場強高于1 000 V/cm時，穿孔率提高的趨勢減緩；場強達到1 500 V/cm時，穿孔率已經(jīng)達到90%以上，此時大部分細胞都已經(jīng)發(fā)生了電穿孔。

圖3 不同場強處理下PI染色率Figure 3 PI dyeing rate under different electric field intensity

2.3 細胞活性檢測結(jié)果

μsPEF對細胞活性的影響如圖4所示，隨著電場強度的升高，A-549細胞活性逐漸減弱。場強低于1 500 V/cm時A-549細胞能夠維持較高的細胞活性；場強高于1 500 V/cm時，細胞活性明顯降低；場強為1 750 V/cm和2 000 V/cm時，培養(yǎng)24 h細胞活性就已經(jīng)降低至80%以下。綜合考慮穿孔率和細胞活性，選擇高穿孔率、低殺傷率的場強參數(shù)用于后續(xù)實驗，盡可能降低脈沖電場本身對細胞的影響，脈沖場強范圍選擇1 000～1 500 V/cm。

圖4 不同場強的μsPEF對細胞活性的影響Figure 4 Effect of μsPEF with different electric field strength on cell viability

圖5～7分別是電場強度為1 000 V/cm、1 250 V/cm和1 500 V/cm的μsPEF聯(lián)合EPA作用對A-549細胞活性的影響。在不同場強的μsPEF作用下，細胞活性的整體變化趨勢基本相同。同一電場強度條件下，隨著EPA濃度的增加，細胞活性逐漸減弱，并且培養(yǎng)48 h比培養(yǎng)24 h時細胞活性更低，具有顯著性差異(P<0.05)。μsPEF聯(lián)合EPA共同作用與單獨施加EPA時相比，細胞活性明顯降低，說明外加μsPEF能夠顯著增強EPA對A-549細胞的毒性效果。

圖5 1 000 V/cm的μsPEF聯(lián)合EPA對A-549細胞活性的影響Figure 5 Effect of 1 000 V/cm μsPEF combined with EPA on the viability of A-549 cells

圖6 1 250 V/cm的μsPEF聯(lián)合EPA對A-549細胞活性的影響Figure 6 Effect of 1 250 V/cm μsPEF combined with EPA on the viability of A-549 cells

圖7 1 500 V/cm的μsPEF聯(lián)合EPA對A-549細胞活性的影響Figure 7 Effect of 1 500 V/cm μsPEF combined with EPA on the viability of A-549 cells

從μsPEF對EPA毒性效果的提升程度來看，EPA濃度為300 μmol/L時，外加μsPEF對EPA細胞毒性效果提升程度最顯著。以EPA濃度300 μmol/L時為例，場強為1 000 V/cm時，μsPEF與EPA聯(lián)合作用下A-549細胞活性比單獨施加EPA時降低了32.77%(24 h)和39.35%(48 h)；場強為1 250 V/cm時，細胞活性降分別降低了36.17%(24 h)和41.86%(48 h)；場強為1 500 V/cm時，細胞活性分別降低了51.52%(24 h)和53.08%(48 h)。這也表明，在EPA濃度相同時，隨著電場強度的升高，μsPEF與EPA的聯(lián)合作用效果也越強。

但值得注意的是，場強為1 500 V/cm的μsPEF單獨處理細胞后培養(yǎng)48 h，細胞活性就已經(jīng)下降到65%左右，此時脈沖電場本身就對細胞有較強的活性抑制效果，所以此參數(shù)下細胞活性減弱的主要原因可能是脈沖電場本身。

3 討論

有研究表明，μsPEF誘導細胞膜的電穿孔效應與細胞尺寸大小相關(guān)，細胞半徑越大，在外加電場作用下形成的跨膜電位就越大，就更容易達到穿孔閾值[12]。本文所用A-549細胞直徑大約在15 μm，根據(jù)PI染色實驗結(jié)果可知：場強為750 V/cm時，A-549細胞已出現(xiàn)了電穿孔，但是電穿孔率低；當電場強度高于1 000 V/cm時，PI染色率顯著增加。以上表明，在μsPEF作用下，細胞膜表面形成孔洞，使細胞膜通透性增加；并且細胞活性檢測結(jié)果顯示，μsPEF對細胞的殺傷效果不強，沒有影響細胞的正常生理活性，即細胞膜表面出現(xiàn)了可逆電穿孔。

EPA是n-3多不飽和脂肪酸之一，人體自身不能合成，只能從食物中攝取。目前研究認為，EPA有預防腫瘤的發(fā)生、抑制腫瘤生長的作用。本研究結(jié)果顯示，EPA對A-549的細胞毒性始終呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性：濃度越高，細胞毒性越強；并且在相同EPA濃度下，培養(yǎng)48 h要比培養(yǎng)24 h時對細胞毒性更強。有研究表明，不飽和脂肪酸可以對包括肺癌在內(nèi)的各種癌細胞產(chǎn)生選擇性細胞毒性，不會對正常細胞產(chǎn)生不良影響[13]，EPA能誘導劑量和時間依賴性的細胞死亡[14]，并且能夠抑制肺癌A-549腫瘤細胞的增殖活性[15]，這與本文的EPA毒性實驗結(jié)果一致。

綜合來看，脈沖電場作用后培養(yǎng)24 h和48 h，μsPEF都能夠顯著增強EPA對A-549細胞的毒性效果，并且其聯(lián)合作用效果(μsPEF對EPA抑制A-549細胞活性效果的促進作用)并不是完全與EPA濃度和電場強度呈正相關(guān)。當EPA濃度為300 μmol/L時聯(lián)合效果最佳，當EPA濃度<300 μmol/L，其聯(lián)合作用效果與EPA濃度和電場強度呈正相關(guān)；當EPA濃度>300 μmol/L，聯(lián)合作用效果隨EPA濃度升高和場強增加而逐漸減弱。

需要注意的是，相同EPA濃度下，電場強度越高，對EPA抑制A-549細胞活性效果的促進作用也越強，不同場強的脈沖電場本身對細胞活性有不同程度的影響。進一步對比分析可知，場強為1 250 V/cm時聯(lián)合作用效果比1 000 V/cm時略強，然而1 250 V/cm的μsPEF本身對細胞的殺傷作用也比1 000 V/cm時略強，故其聯(lián)合作用效果與1 000V/cm相比無顯著性差別。場強為1 500 V/cm時，脈沖電場本身對細胞具有較強的殺傷作用，所以有更強的聯(lián)合作用效果，考慮到此時電場本身對細胞的強殺傷，綜合分析聯(lián)合作用效果不如場強為1 000 V/cm和1 250 V/cm時的作用效果。

4 結(jié)論

(1)EPA對A-549細胞的殺傷效果具有時間和濃度依賴性。

(2)μsPEF能夠增強A-549細胞膜通透性。隨著電場強度的增加，細胞通透性增強，細胞活性減弱。當電場強度為1 000 V/cm和1 250 V/cm時，能夠保證對細胞的低殺傷率和高穿孔率，有利于藥物分子進入細胞。

(3)μsPEF能有效增強EPA對A-549細胞的毒性效果。μsPEF聯(lián)合EPA處理A-549細胞后培養(yǎng)24 h和48 h，都是在EPA濃度為300 μmol/L時，μsPEF與EPA的聯(lián)合作用效果最佳，μsPEF能使EPA毒性效果提升40%以上。