耐力運動對關(guān)節(jié)炎大鼠氧化應(yīng)激與軟骨炎性表達及CHRNA7信號的影響

金平平 朱海心 邵宇飛 崔三軍 吳科雨 孟祥偉

(鞍山市中心醫(yī)院骨科，遼寧 鞍山 114000)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，病理特征是關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)軟骨的退變，同時可伴有骨贅形成及滑膜改變[1-2]。研究表明，在超過65歲的人群中，骨關(guān)節(jié)炎具有極高的發(fā)病率，約占70%[3]?，F(xiàn)階段，對于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制尚不完全清楚，但與軟骨降解和合成失衡關(guān)系密切[4]。軟骨衰老及修復(fù)能力減弱炎性因子促使疾病發(fā)病，可能通過多種信號途徑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而引起細胞外基質(zhì)降解及軟骨細胞凋亡[5]。膽堿能抗炎通路是一條神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)通路，其機制是炎性反應(yīng)信號刺激興奮迷走神經(jīng)釋放乙酰膽堿，與a7nAChR結(jié)合后通過調(diào)節(jié)NF-KB和JAK2/STAT3信號通路抑制促炎因子的生成，從而發(fā)揮抗炎作用。

目前骨關(guān)節(jié)炎的治療主要有藥物治療，同時根據(jù)關(guān)節(jié)發(fā)病部位和性質(zhì)的不同，選用不同的物理治療能更好地緩解關(guān)節(jié)癥狀及促進功能恢復(fù)[6]。近年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)有氧運動能明顯緩解關(guān)節(jié)疼痛，提高生活質(zhì)量，而且費用相對較低，不受時間、地點限制，容易被患者接受及推廣[7-8]。目前，有研究報道了有氧運動對膝關(guān)節(jié)炎具有改善作用，但其對軟骨炎性、信號通路表達水平等具體作用機制尚不明確。因此，本文探討耐力運動對關(guān)節(jié)炎大鼠氧化應(yīng)激、軟骨炎性表達和CHRNA7信號通路表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠飼養(yǎng) 50只SD大鼠，一籠7鼠飼養(yǎng)?；\內(nèi)自由活動，標(biāo)準大鼠飼料喂食，自由飲食飲水，室內(nèi)溫度控制在(22±3)℃，濕度為45%～50%，籠內(nèi)飼養(yǎng)7天待其適應(yīng)環(huán)境，按照《實驗動物管理條例》規(guī)定開始進行實驗。實驗方案經(jīng)我省醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理文員會批準，動物許可證號：SYXK(遼)2018-0009。

1.2 藥物、試劑與儀器 木瓜蛋白酶購買于北京索萊寶科技公司，L-半胱氨酸購買于河南淶潤生物科技公司，動物跑步機由美力德人體跑步機改裝，用薄木板將跑帶隔離成長100 cm，寬20 cm，高30 cm 的單獨跑道，每根跑道尾部擋板均固定有大頭針，泰盟PL-200型熱刺痛儀購買于成都泰盟有限公司，Von Frey hair纖毛機械刺激針購買于上海玉研科學(xué)儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與建模 將50只SD大鼠隨機分為健康組、關(guān)節(jié)炎組、低耐力、中耐力組、高耐力組，每組10只。除健康組，其他四組大鼠均建造關(guān)節(jié)炎大鼠模型。建模：無菌條件下用10 mL生理鹽水與木瓜蛋白酶0.4 g，L-半胱氨酸36 mg共同放入離心管中，混勻，放于冰箱4℃冷藏室儲存，在建模前30 min取出，常溫下靜置。將大鼠仰臥位固定于木板上，用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)注入大鼠腹腔麻醉，刮去左右膝關(guān)節(jié)腔周邊1 cm區(qū)域的鼠毛，常規(guī)消毒，左右膝關(guān)節(jié)屈曲 45°，以髕骨下級髕腱外緣為進針點，用1 mL注射器向髁間窩方向進針，抵達股骨髁后回撤2 mm，注入混合液0.15 mL，建立關(guān)節(jié)炎模型。干預(yù)4周后，5組均隨機抽取3只大鼠HE染色,與健康組對比。觀察軟骨細胞的形態(tài)變化以判斷造模是否成功[9]。

1.3.2 干預(yù)方法 建模后，健康組和關(guān)節(jié)炎組不運動，籠中常規(guī)飼養(yǎng)，低耐力組給予10 m/min運動，中耐力組15 m/min運動，高耐力組給予20 m/min運動。每周運動5～6次，每次運動1 h，實驗共持續(xù)6周(偷懶不跑者隨跑帶后移至擋板處，大頭針刺激或予以敲擊擋板驅(qū)趕)。

1.4 檢測各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)

1.4.1 熱板致痛閾值檢測 運動干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠休息2 h，加熱熱板，溫度為(54±1.0)℃，將大鼠放置在熱板上，從大鼠接觸熱板后1 min內(nèi)大鼠舔后足反應(yīng)時間，超過1 min大鼠無明顯疼痛反應(yīng)。實驗結(jié)束，記錄各組大鼠疼痛反應(yīng)時間為熱痛閾值(Paw withdraw thermal latency，PWTL)。

1.4.2 機械性撤足閾值檢測 熱板痛閾值實驗結(jié)束后，大鼠休息2 h平靜后將各組大鼠放入籠內(nèi)，籠內(nèi)箱底為金屬網(wǎng)板的丙烯酸，大鼠適應(yīng)30 min左右，纖維絲持續(xù)刺激大鼠后足，刺激時間為(5±1)s，觀察大鼠反應(yīng)，記錄大鼠受襲擊后是否出現(xiàn)撤足或者舔足反應(yīng)，出現(xiàn)則為陽性，記錄陽性反應(yīng)時，最小纖維絲刺激力大鼠后肢撤足閾值(Paw withdrawal threshold，PWT)。

1.5 檢測各組大鼠血清中炎性因子水平 大鼠眼眶多次取靜脈血2 mL，3000 r/min離心30 min取大鼠血清，將血樣上層的清液，酶聯(lián)免疫法檢測血樣中 TNF-α及IL-1的水平。

1.6 HE染色觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的形態(tài) 大鼠處死后，截取大鼠雙側(cè)的膝關(guān)節(jié)，剝離膝關(guān)節(jié)上的皮膚和肌肉。將大鼠的膝關(guān)節(jié)置入濃度為4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。使用濃度為 10% 的稀鹽酸為膝關(guān)節(jié)樣本脫鈣2～4 d。對膝關(guān)節(jié)樣本進行梯度脫水，石蠟包埋。沿膝關(guān)節(jié)樣本的矢狀面將脛骨內(nèi)側(cè)平臺軟骨下的松質(zhì)骨和股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨下的松質(zhì)骨沿下肢縱軸方向切開，切成厚度為5 μm左右的薄片，進行染色、脫水、透明、封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的病理切片。

1.7 心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力以及脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)表達水平 在訓(xùn)練結(jié)束后24 h，將各組大鼠采用戊巴比妥給予腹腔麻醉處死，取出心臟，擦干血跡。切取左右心尖部心室前壁肌適量組織，SOD活性檢測采用WST-1法檢測，GSH-Px活力檢測使用比色法，MDA含量的檢測使用TBA法，嚴格按照試劑盒操作，每個實驗檢測3次。

1.8 采用Western Blot法檢測滑膜細胞a7nAChR、STAT3蛋白表達情況 處死大鼠后，將大鼠仰臥于干凈的工作臺上，消毒，沿膝關(guān)節(jié)正中切開，露出膝關(guān)節(jié)周圍為中心約3 cm×3 cm，提起髕骨，向下分離脛骨，打開關(guān)節(jié)腔，髕骨下緣有一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織，完整剝離滑膜組織，用手術(shù)刀片完整割下，用福爾馬林固定，包埋，切片。取滑膜組織置于冰上，剪碎組織，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液RIPA進行勻漿。離心10 min后取上清，在蛋白樣品中加入緩沖液混勻，煮沸后進行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，然后加入一抗、二抗， 4℃搖床孵育過夜；經(jīng)TBST洗滌、滴加化學(xué)發(fā)光試劑于曝光儀中拍攝蛋白顯影條帶，Image J軟件分析各組蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果比較 與健康組相比，關(guān)節(jié)炎組大鼠PWTL、PWT明顯降低(P<0.05)；與關(guān)節(jié)炎組大鼠相比，低、中和高耐力組大鼠PWTL、PWT明顯增加(P<0.05)；與低耐力組相比，中耐力組PWTL、PWT明顯增加(P<0.05)；與中耐力組相比，高耐力組PWTL、PWT水平下降(P<0.05)，見表1。

表1 耐力運動對各組大鼠行為學(xué)影響

2.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1比較 與健康組相比，關(guān)節(jié)炎組大鼠血清中TNF-α、IL-1水平升高(P<0.05)；與關(guān)節(jié)炎組相比，低耐力組、中耐力組和高耐力組TNF-α、IL-1水平降低(P<0.05)；與低耐力相比，中耐力組TNF-α、IL-1降低(P<0.05)；與中耐力組相比，高耐力組大鼠血清中TNF-α、IL-1水平升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠炎性水平比較

2.3 各組大鼠HE染色結(jié)果 健康組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面平整光滑，無裂縫或缺損，其軟骨細胞的形態(tài)正常、排列整齊，其關(guān)節(jié)軟骨的各個層次清晰。關(guān)節(jié)炎組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的表面不平整，有缺損及裂縫，其關(guān)節(jié)軟骨細胞的形態(tài)異常、排列紊亂，其關(guān)節(jié)軟骨的各個層次不清晰。低耐力組和高耐力組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的表面比較光滑、平整，其軟骨細胞的形態(tài)異常、排列紊亂，其關(guān)節(jié)軟骨的各個層次不清晰。中耐力組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的表面平整，軟骨細胞排列較為整齊，其關(guān)節(jié)軟骨的各個層次比較清晰，潮線基本完整。見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色圖(400×)

2.4 對各組大鼠氧化應(yīng)激SOD、GSH-Px、MDA水平比較 與健康組相比，關(guān)節(jié)炎組SOD、GSH-Px水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；與關(guān)節(jié)炎組相比，低耐力組SOD、GSH-Px水平升高明顯，MDA水平降低明顯(P<0.05)；與低耐力相比，中耐力組SOD、GSH-Px升高明顯，MDA水平降低明顯(P<0.05)；與中耐力組相比，高耐力組SOD、GSH-Px水平降低，MDA水平升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠SOD、GSH-Px、MDA水平比較

2.5 各組大鼠α7nAChR、STAT3蛋白水平比較 與健康組相比，關(guān)節(jié)炎組α7nAChR、STAT3表達水平降低(P<0.05)；與關(guān)節(jié)炎組相比，低耐力組α7nAChR、STAT3水平升高明顯(P<0.05)；與低耐力相比，中耐力組α7nAChR、STAT3升高明顯(P<0.05)；與中耐力組相比，高耐力組α7nAChR、STAT3水平降低(P<0.05)，見圖2、表4。

表4 各組大鼠α7nAChR、STAT3蛋白水平

圖2 各組大鼠α7nAChR、STAT3蛋白表達

3 討論

關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制部分是由軟骨細胞外基質(zhì)合成與降解之間失去平衡引起的，過量刺激使軟骨表面變薄[10]。關(guān)節(jié)炎可導(dǎo)致患者發(fā)生膝關(guān)節(jié)疼痛、畸形，使其生活質(zhì)量受到嚴重的影響。目前臨床上對膝骨性關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病的機制尚未完全明確[11]。近年，膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率及致殘率均有所上升，本文探討耐力運動對關(guān)節(jié)炎大鼠氧化應(yīng)激、軟骨炎性表達及CHRNA7信號表達的影響。

很多學(xué)者認為導(dǎo)致膝骨性關(guān)節(jié)炎的原因是患者的膝關(guān)節(jié)長期磨損[12]。近年來越來越多的臨床研究證實，膝骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)的軟骨組織、關(guān)節(jié)液及血漿中具有大量的炎性細胞因子，這說明膝骨性關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié)持續(xù)存在炎癥是導(dǎo)致其關(guān)節(jié)軟骨退變的重要因素之一[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)對肥胖大鼠進行6周有氧運動在有效改善血液脂質(zhì)代謝的同時，可顯著降低動物血清中IL-1、TNF-α水平，證明有氧運動可抑制炎癥反應(yīng)[15]。關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié)存在大量的炎性細胞因子會導(dǎo)致其膝關(guān)節(jié)軟骨細胞合成及分解的狀態(tài)失衡[16]。研究表明中強度有氧運動可以改善內(nèi)皮功能障礙，對心腦血管疾病有顯著的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)炎組TNF-α、IL-1、水平升高，與關(guān)節(jié)炎組相比，低耐力組、中耐力組和高耐力組TNF-α、IL-1水平降低，中耐力組TNF-α、IL-1降低最為明顯。

有學(xué)者通過對45只結(jié)腸炎大鼠研究顯示，有氧運動可以降低大鼠體內(nèi)炎性因子的表達[18]。范潔等[19]通過研究關(guān)節(jié)炎大鼠結(jié)果顯示，芒針可以增加PWTL、PWT，從而增強對關(guān)節(jié)炎大鼠的鎮(zhèn)痛效果。有研究表明高等強度運動不利于骨關(guān)節(jié)炎的康復(fù)及治療，適度強度的鍛煉對骨關(guān)節(jié)炎的康復(fù)是最理想的，低等和中等強度的運動會對關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生彈性壓力[20]。本研究結(jié)果顯示，與關(guān)節(jié)炎組大鼠相比，低、中和高耐力組大鼠PWTL、PWT增加，中耐力組增加明顯，與上述研究一致。提示耐力運動可以緩解神經(jīng)根疼痛，提高大鼠PWT，使大鼠鎮(zhèn)痛作用增強。

在正常狀態(tài)下機體氧化應(yīng)激處于平衡狀態(tài)，氧化應(yīng)激失衡就會導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)病變和滑膜炎癥，導(dǎo)致軟骨退化。有研究發(fā)現(xiàn)治療關(guān)節(jié)炎時可以通過清除自由基，抗氧化抑制炎癥介質(zhì)，從而來保護軟骨細胞[21]。SOD活性的高低可間接地反映機體清除氧自由基的能力。GSH-Px可保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。MDA是衡量機體自由基代謝的敏感指標(biāo)。適度運動可以促進機體生成自由基，激活抗氧化通路，從而達到對自由基的保護機制[22]。有研究不同強度運動對大鼠骨骼肌自由基代謝影響的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中等強度耐力訓(xùn)練后，大鼠骨骼肌中抗氧化酶的活性增加，MDA降低機體氧化-抗氧化系統(tǒng)達到平衡，說明中等強度運動本身可能發(fā)揮抗氧化的作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)通過不同強度運動對關(guān)節(jié)炎大鼠進行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，低耐力組、中耐力組和高耐力組SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低，其中中耐力組SOD、GSH-Px升高明顯，MDA水平降低明顯提示低中強度的耐力運動可以提高心肌的抗氧化能力。因此選擇適宜的運動方式，可以較好地保護心肌細胞。

近年來研究發(fā)現(xiàn)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)能通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，也稱之為“膽堿能抗炎通路”[24]。CHRNA7參與調(diào)節(jié)促炎細胞因子的產(chǎn)生，是膽堿能抗炎通路發(fā)揮調(diào)控炎癥作用不可或缺的一部分[25]。α7nAChR是煙堿型ACh受體家族的一種亞型，α7nAChR通過調(diào)節(jié)NF-xB和JAK2/STAT3信號通路抑制促炎因子的生成，從而發(fā)揮抗炎作用。已研究證實關(guān)節(jié)炎滑膜細胞表面有α7nAChR的表達，α7nAChR在關(guān)節(jié)炎具有重要的治療價值[26]。邢潔等[27]研究發(fā)現(xiàn)和痹方可以上調(diào)α7nAChR表達而激活CAP，活化JAK2/STAT3信號通路，降低下游TNF-α、IL-6等炎性因子水平，減輕關(guān)節(jié)腫脹。有研究表明在胰腺炎動物模型及實驗誘導(dǎo)的腸梗阻小鼠中，選擇性α7nAChR抑制劑可抑制巨噬細胞中細胞因子的產(chǎn)生,緩解炎癥，改善炎癥小鼠的生存率[28]。侯作旭[29]通過對高血壓大鼠8周有氧運動發(fā)現(xiàn)，有氧運動能夠通過增強副交感神經(jīng)功能及膽堿能抗炎通路，下調(diào)大鼠血清、心臟和腸系膜血管炎癥因子 TNF-α和IL-1β水平。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，關(guān)節(jié)炎組α7nAChR、STAT3表達水平降低，與關(guān)節(jié)炎組相比，低耐力組、中耐力組和高耐力組α7nAChR、STAT3水平升高，中耐力組α7nAChR、STAT3升高明顯，與上述研究一致。

4 結(jié)論

中強度耐力運動可抑制TNF-α、IL-1表達，改善疼痛水平及氧化應(yīng)激反應(yīng)，對關(guān)節(jié)起到保護作用，其機制可能與調(diào)控α7nAChR/STAT3蛋白表達有關(guān)。