老年男性血清Gremlin-1、dp-ucMGP與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性*

曾小潔 范小雪 謝玉玲

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1.發(fā)熱門診；2.體檢中心；3.創(chuàng)面修復(fù)科，海南 ?？?570100)

世界衛(wèi)生組織(WHO)將骨質(zhì)疏松癥定義為一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征的疾病，導(dǎo)致骨脆性增加和骨折風(fēng)險[1-2]。近幾十年來，由于社會老齡化，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率上升，全世界約2億骨質(zhì)疏松及約890萬骨質(zhì)疏松骨折患者[3]。骨質(zhì)疏松骨折和脊柱后凸是導(dǎo)致老年患者生活質(zhì)量和生存率下降的最重要因素[4-5]。Gremlin-1是早期腎功能障礙的敏感指標(biāo)，也是心血管疾病、糖尿病相關(guān)死亡率和全因死亡率的獨立預(yù)測指標(biāo)[6]。脫磷-未羧化-基質(zhì)Gla蛋白(dp-ucMGP)缺失胚胎表現(xiàn)出四肢骨骼缺陷，這是早期肢芽模式缺陷的結(jié)果，不對軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞造成直接影響，然而，在發(fā)育后期dp-ucMGP在成骨細(xì)胞中表達(dá)，表明其參與胚胎骨骼發(fā)生，可能與骨代謝相關(guān)[7-8]。目前缺乏有關(guān)Gremlin-1、dp-ucMGP與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性研究。因此，本研究擬探討老年男性血清Gremlin-1、dp-ucMGP與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性，為骨質(zhì)疏松的治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入我院2019年1月～2020年12月確診的139例老年男性骨質(zhì)疏松患者為病例組。納入同期本院男性健康體檢者142例為對照組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理協(xié)會批準(zhǔn)(倫審號：2019003)，同時患者及對照組簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①男性，年齡≥65歲。②通過定量超聲在跟骨處測量的骨狀態(tài)數(shù)據(jù)，T-score≤-2.5[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：類固醇使用史；嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎；髖部和脊柱骨折史；骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、腎病和心臟病治療史。

1.2 方法

1.2.1 血清樣品獲取 將空腹靜脈血樣品收集到常規(guī)采血管中并使其凝結(jié)。以2000g離心后，分離出血清樣品并等分冷凍。血清樣品在-20～-80℃冷凍保存(-20℃保存5天，-80℃保存12個月)。

1.2.2 常規(guī)血生化指標(biāo)測定 貝克曼AU-680全自動生化儀測定血清白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDLC)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、總蛋白(TP)水平。ALB、HDLC、LDLC、TC、TG、TP試劑盒購于中生北控，批號分別為SD-5696、1254、4526、0215、9851、6512。

1.2.3 骨密度(BMD)測定 使用DXA掃描(Hologic，QDRInc，Bedford，MA，USA)評估腰椎和髖部BMD(g/cm2)，確定T分?jǐn)?shù)。

1.2.4 血清Gremlin-1、dp-ucMGP水平測定 Gremlin-1水平檢測：使用MicroVueGremlin-1人ELISA試劑盒測量血清Gremlin-1水平。Gremlin-1是一種微量滴定條形式的免疫測定，使用單克隆抗Gremlin-1抗體包被在條上以捕獲樣品中的Gremlin-1。用對硝基苯基磷酸酯(pNPP)底物檢測捕獲的Gremlin-1的酶活性。該測定(使用人ELISA試劑盒)的性能特征最低。與參考值相比，本研究的檢測限為100 ng/mL，循環(huán)中的CV=5.0%～5.8%，循環(huán)間的CV=4.8%～5.2%、140.2～420.7 ng/mL(MicroVueTMBSAP；MDSSGmbH，德國漢諾威)。dp-ucMGP濃度檢測：使用兩步MicroVuedp-ucMGP測定法測量dp-ucMGP濃度。將重新配制的標(biāo)準(zhǔn)品和對照品與樣品稀釋劑一起加入包被的微孔板孔中。血清中天然存在的無活性dp-ucMGP片段可能會干擾生理樣品中dp-ucMGP的檢測。該測定通過使用兩種不同的單克隆抗體避免了無活性片段的影響。檢測性能的特點是最低檢測限2000 ng/mL，運行內(nèi)CV=2.2%～3.6%，運行間CV=3.0%～4.6%。

1.2.5 骨代謝指標(biāo)測定 酶聯(lián)免疫吸附法測定血清I型膠原氨基酸端延長肽(Type I procollagen amino-terminal peptide，PINP)、β-膠原特殊序列(β collagen specific sequences，β-CTX)、N-端骨鈣素(N-terminal osteocalcin，N-MID)、25-羥維生素D(25-(OH)D)、骨鈣素(OC)水平。25-(OH)D、PINP、β-CTX、N-MID、OCELISA試劑盒購于上海博湖生物科技有限公司，批號分別為54896.36、41589.54、47859.36、40269.36、59874.63。

2 結(jié)果

2.1 兩組基礎(chǔ)資料比較 兩組年齡、ALB、HDLC、LDLC、TC、TG、TP、收縮壓、舒張壓、BMI等基礎(chǔ)資料方面的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組基礎(chǔ)資料比較

2.2 兩組Gremlin-1、dp-ucMGP水平比較 病例組血清Gremlin-1、dp-ucMGP水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組Gremlin-1、dp-ucMGP水平比較

2.3 兩組骨代謝指標(biāo)水平比較 病例組血清PINP、β-CTX水平明顯高于對照組，血清25-(OH)-D、N-MID、OC以及BMD明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組骨代謝指標(biāo)水平比較

2.4 Gremlin-1、dp-ucMGP與各變量的相關(guān)性分析 Gremlin-1、dp-ucMGP與PINP、β-CTX呈負(fù)相關(guān)，與25-(OH)D、N-MID、BMD、OC呈正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 Gremlin-1、dp-ucMGP與各變量的相關(guān)性分析

2.5 Gremlin-1、dp-ucMGP預(yù)測老年男性骨質(zhì)疏松的ROC曲線 受試者工作特征曲線顯示，Gremlin-1、dp-ucMGP預(yù)測老年男性骨質(zhì)疏松的ROC曲線下面積分別為0.859(95%CI：0.768～0.943)、0.833(95%CI：0.748～0.924)，兩者診斷骨質(zhì)疏松的靈敏度、特異度相近(2=1.563、1.215，P>0.05)，見表5、圖1。

表5 Gremlin-1、dp-ucMGP預(yù)測老年男性骨質(zhì)疏松的ROC曲線

圖1 Gremlin-1、dp-ucMGP預(yù)測老年男性骨質(zhì)疏松的ROC曲線

2.6 老年男性發(fā)生骨質(zhì)疏松多因素Logistics回歸分析 以老年男性是否發(fā)生骨質(zhì)疏松為因變量(是=1，否=0)，單因素分析有意義的因素為自變量進(jìn)行多因素Logistic逐步回歸分析，結(jié)果顯示，Gremlin-1、dp-ucMGP、25-(OH)D降低，β-CTX升高均為老年男性發(fā)生骨質(zhì)疏松的危險因素(OR=2.18、4.14、5.62、3.06，P<0.05)，見表6。

表6 老年男性發(fā)生骨質(zhì)疏松的多因素Logistic回歸分析

3 討論

之前有許多研究涉及骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物和預(yù)測因子，其中25-(OH)-D、PINP、β-CTX、N-MID、BMD、OC已被確定為敏感且穩(wěn)定的檢測骨質(zhì)疏松癥的骨生物標(biāo)志物[10-16]。Gremlin-1是一種由122個氨基酸組成的小蛋白質(zhì)，屬于木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶抑制劑的胱抑素家族[17]。Gremlin-1廣泛分布并存在于大多數(shù)體液中，其主要用作蛋白酶抑制劑，并且是組織蛋白酶D和彈性蛋白酶的蛋白水解降解目標(biāo)；Gremlin-1水平與腎小球濾過率相關(guān)，是腎臟健康的重要標(biāo)志，同時也是糖尿病和慢性腎病進(jìn)展的決定因素[18-19]。已有研究表明，Gremlin-1與破骨細(xì)胞之間存在關(guān)系，其通過涉及RANK信號傳導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)機制直接靶向破骨細(xì)胞祖細(xì)胞來減少破骨細(xì)胞的形成[20]。本研究結(jié)果顯示，病例組血清Gremlin-1水平明顯低于對照組(P<0.05)；且Gremlin-1與PINP、β-CTX呈負(fù)相關(guān)，與25-(OH)D、N-MID、OC、BMD呈正相關(guān)(P<0.05)，與上述研究結(jié)果一致。提示Gremlin-1與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松癥中破骨細(xì)胞分化增加，破骨細(xì)胞祖細(xì)胞吸收Gremlin-1，從而導(dǎo)致血清Gremlin-1水平降低[21]；其次，在骨質(zhì)疏松癥中，Gremlin-1被抑制可能會發(fā)生破骨細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致胱抑素C表達(dá)的相應(yīng)降低[22]。這些機制可以解釋為什么血清Gremlin-1在骨質(zhì)疏松癥患者中降低。

研究表明，dp-ucMGP與骨代謝有一定關(guān)聯(lián)性：dp-ucMGP顯著下調(diào)并與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性血清中的腰椎BMD呈正相關(guān)[23]；dp-ucMGP通過靶向和調(diào)節(jié)Runx2表達(dá)來抑制成骨細(xì)胞生成[24]；在成骨細(xì)胞系MC3T3中，低表達(dá)的dp-ucMGP直接靶向Runx2基因3'-UTR，抑制堿性磷酸酶的產(chǎn)生和成骨細(xì)胞的分化；dp-ucMGP在用伊班膦酸鹽處理的成骨細(xì)胞樣牙周膜干細(xì)胞中上調(diào)[25-26]；雌激素缺乏與dp-ucMGP低表達(dá)相關(guān)，而dp-ucMGP低表達(dá)可以通過削弱人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化來誘導(dǎo)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[27]。體外實驗表明，dp-ucMGP在RANKL/M-CSF誘導(dǎo)的RAW264.7和THP-1細(xì)胞中呈時間依賴性上調(diào)，表明dp-ucMGP在破骨細(xì)胞生成過程中上調(diào)。此外，dp-ucMGP的過表達(dá)顯著增加了NFATc1、c-Fos和TRAP的蛋白質(zhì)表達(dá)，并顯著增加了RANKL處理的RAW264.7和THP-1細(xì)胞中TRAP陽性細(xì)胞的數(shù)量[28]。相反，破骨細(xì)胞主要負(fù)責(zé)骨吸收，破骨細(xì)胞的分化通過不同的基因表達(dá)受到各種過程的調(diào)節(jié)[29]，dp-ucMGP敲低顯示出相反的結(jié)果。本研究在老年男性人群中發(fā)現(xiàn)，病例組血清dp-ucMGP水平明顯低于對照組(P<0.05)；且dp-ucMGP與PINP、β-CTX呈負(fù)相關(guān)，與25-(OH)D、N-MID、OC、BMD呈正相關(guān)(P<0.05)。提示骨質(zhì)疏松癥老年患者血清dp-ucMGP降低，dp-ucMGP與骨代謝密切相關(guān)。同時本研究通過多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，Gremlin-1、dp-ucMGP降低均為老年男性發(fā)生骨質(zhì)疏松的危險因素，同時ROC曲線及靈敏度、特異度分析提示Gremlin-1、dp-ucMGP診斷骨質(zhì)疏松的臨床價值較高。

4 結(jié)論

老年男性骨質(zhì)疏松癥患者血清Gremlin-1、dp-ucMGP降低，且Gremlin-1、dp-ucMGP與骨代謝密切相關(guān)；Gremlin-1、dp-ucMGP降低均為老年男性發(fā)生骨質(zhì)疏松的危險因素。