微量稀釋法和瓊脂稀釋法測定淋球菌藥物敏感性的比較

梁佩嬋 吳志周 林仲女

（江門市皮膚醫(yī)院檢驗科 廣東江門 529000）

目前淋球菌的藥物敏感性檢測方法包括K-B紙片擴(kuò)散法、E-test 法、瓊脂稀釋法（AD）。紙片法操作簡單，但是該法不能測定受試菌的最低抑菌濃度（MIC）值。E-test 法雖可直接測定MIC 值，但試紙條較昂貴。瓊脂稀釋法是WHO 推薦的方法，但該方法操作繁瑣，難以廣泛開展。實驗室如何為臨床提供快速、準(zhǔn)確的淋球菌藥敏MIC 報告，并能在實驗室常規(guī)開展值得關(guān)注。有研究人員通過改良微量稀釋法（MD）[1]應(yīng)用于淋球菌的藥物敏感性試驗。這種方法與瓊脂稀釋法一致性如何，是值得關(guān)注的問題。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

臨床菌株：淋球菌菌株自2020 年1 月至2021年12 月從我院性病門診淋病患者的泌尿生殖道中分離得到。菌株根據(jù)其菌落形態(tài)，顯微鏡下菌體形態(tài)，氧化酶試驗及糖發(fā)酵試驗確證，分純后置于在小牛血清中保存-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

參考菌株：參考株G、J、K、L、P 和ATCC49226由廣東省皮膚性病防治中心提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器。比濁儀、CO2培養(yǎng)箱、電子分析天平、-70℃超低溫冰箱。

1.2.2 抗生素。青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、大觀霉素、頭孢曲松、頭孢克肟、阿奇霉素由廣東省皮膚性病防治中心提供。

1.2.3 培養(yǎng)基。微量稀釋法試劑盒、GC 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、淋球菌選擇培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 微量稀釋法：按照試劑盒的說明書操作。藥敏板是預(yù)先制成含青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、大觀霉素、頭孢曲松、頭孢克肟和阿奇霉素等12 個濃度梯度的96 孔板。檢測濃度：青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星均為0.015 微克/毫升～32 微克/毫升，大觀霉素0.06 微克/毫升～128 微克/毫升，頭孢曲松和頭孢克肟為0.005 微克/毫升～1 微克/毫升，阿奇霉素0.004 微克/毫升～8 微克/毫升。淋球菌用無菌生理鹽水配制成0.5MFC 菌懸液，吸取150 微升菌懸液加于MH 肉湯培養(yǎng)基中混勻，將混勻液分別加到96 孔藥敏板內(nèi)（每孔100 微升），放于35℃、5%～10%CO2培養(yǎng)箱孵育24 小時后讀取結(jié)果。

1.3.2 瓊脂稀釋法：作為參考方法，按WHO 推薦的方法[2]制備抗生素瓊脂平板。7 種藥物的最終濃度和微量稀釋法相同。淋球菌用無菌生理鹽水配制成0.5MFC 菌懸液，取2 微升點(diǎn)樣接種于抗生素瓊脂平板中。接種完畢后各平板放入35℃、5%～10%CO2培養(yǎng)箱孵育24 小時后觀察結(jié)果。

1.3.3 每批實驗均有參考菌株作質(zhì)量控制并設(shè)立陰性和陽性對照。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參考WHO 西太區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測規(guī)劃推薦標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.4 兩種方法一致性評價標(biāo)準(zhǔn)

采用分類一致性（CA）、基本一致性（EA）、重大誤差（ME）、極重大誤差（VME）、微小誤差（MIE）對兩種方法進(jìn)行比較。CA 為兩種方法藥敏結(jié)果的一致性。EA 為兩種方法測定的MIC 值相差不超過1 個稀釋倍數(shù)。ME 是指AD 判為S 時，MD 判為R。VME 是指AD 判為R 時，MD 判為S。MIE 指AD或MD 判為I 時，另一種方法判為S 或R。當(dāng)CA 或EA≥90%，VME 或ME≤3%，MIE≤7%為可接受的結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

分別計算兩種方法所得的耐藥率，用卡方檢驗比較耐藥率是否有差異，P＜0.05 表示差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控結(jié)果

兩種方法檢測參考菌株的MIC 值均在參考范圍內(nèi)，差異不超過±1。

2.2 兩種方法的比較

兩種方法測定的藥敏結(jié)果，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。對環(huán)丙沙星、大觀霉素、頭孢曲松、頭孢克肟、阿奇霉素一致性較好，對青霉素一致性稍差。見表2。

表1 兩種方法測定的藥敏結(jié)果

表2 兩種方法測定結(jié)果的一致性（%）

3 討論

由于濫用或不恰當(dāng)應(yīng)用抗生素治療，淋球菌耐藥形勢日趨嚴(yán)重[4]，淋球菌的耐藥性已成為全球的公共問題[5]，再不控制將面臨無藥可治的局面[6]。因此對淋球菌實施耐藥監(jiān)測非常重要。淋球菌耐藥性檢測的方法主要有紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、E-test法。紙片擴(kuò)散法操作簡單，在評價藥物敏感性方面只能定性不能定量。瓊脂稀釋法定量檢測抗菌藥物對被測菌的MIC，可同時檢測多種細(xì)菌對一種藥物的耐藥性，是WHO 推薦的參考方法。但是該方法操作繁瑣，不適合實驗室的常規(guī)開展，只能作為回顧性監(jiān)測。E-test 法結(jié)合了瓊脂稀釋法和紙片擴(kuò)散法原理，重復(fù)性好，但E-test 法受到專利保護(hù)，試條成本較高，對臨床批量標(biāo)本使用較為困難。

淋球菌的生長需要適當(dāng)?shù)臏囟群投趸紳舛龋谝后w培養(yǎng)基中生長較差。微量稀釋法可以對一株菌同時進(jìn)行多種藥物的敏感性測定，是用于檢測細(xì)菌MIC 快速和簡便的方法，淋球菌除外。有研究人員嘗試開發(fā)適用淋球菌的微量稀釋法，但大多數(shù)準(zhǔn)確性低。WU 等人改良的微量稀釋法，淋球菌形成的菌落懸浮容易觀察，操作簡單，結(jié)果判讀容易，無需特殊儀器。本次研究表明，微量稀釋法與瓊脂稀釋法測定淋球菌對7 種抗生素的敏感性、耐藥率沒有統(tǒng)計學(xué)差異。對環(huán)丙沙星、大觀霉素、頭孢曲松、頭孢克肟、阿奇霉素敏感性檢測的一致性較好。但青霉素CA89.9%、MIE10.1%、四環(huán)素VME3.4%不在可接受范圍內(nèi)。青霉素和四環(huán)素的誤差是由于一些菌株的MIC 分布引起的。

這些分離株的MIC 值比WHO 推薦的標(biāo)準(zhǔn)判斷高于或低于一個稀釋度，一個稀釋度的偏差可能引起不同的敏感性判別。如果在原液制備過程中，不溶性抗生素不能被溶劑完全溶解，然后將低濃度梯度藥物溶液凍干制作微孔板，微量稀釋法檢測的MIC 值就高于瓊脂稀釋法。微量稀釋法是用于淋球菌抗菌藥物敏感試驗的有效方法[7]，能及時發(fā)現(xiàn)耐藥菌株（頭孢曲松或阿奇霉素），有助于淋球菌感染的個體化治療，有效控制淋病的流行。

綜上所述，微量稀釋法和瓊脂稀釋法對淋球菌抗菌藥物敏感試驗有較好的一致性，可為臨床提供快速、準(zhǔn)確的淋球菌藥敏MIC 報告，能在實驗室常規(guī)開展。