急性肝衰竭(AHF)是指由多種因素引起肝細(xì)胞大量壞死、肝功能嚴(yán)重肝損害的一組臨床綜合征，主要表現(xiàn)為重度黃疸、凝血功能異常、肝性腦病以及嚴(yán)重的消化道癥狀等，嚴(yán)重者可進(jìn)展為多器官功能衰竭甚至危及生命

。AHF起病急、病情進(jìn)展快、并發(fā)癥多，病死率極高，目前尚缺乏有效的治療方法和預(yù)防措施。AHF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。免疫功能紊亂、過度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡、壞死是急性肝衰竭病理損傷的機(jī)制之一。AHF發(fā)病過程中，大量肝細(xì)胞凋亡壞死，同時(shí)伴隨釋放各種病理信號(hào)因子和細(xì)胞因子，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)被激活，進(jìn)一步通過Smad2/3介導(dǎo)的線粒體依賴性凋亡通路加重肝損傷

。中醫(yī)藥在臨床治療AHF過程中發(fā)揮著重要作用，解毒涼血方是我們多年來應(yīng)用于臨床治療AHF的經(jīng)驗(yàn)方。前期研究結(jié)果顯示，解毒涼血方能降低慢加急性肝衰竭患者的病死率、改善肝功能

，為進(jìn)一步闡明該方治療AHF的作用機(jī)制，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M肝細(xì)胞凋亡的病理過程，探討解毒涼血方通過調(diào)節(jié)TGFβ1/Smad信號(hào)通路對AHF肝細(xì)胞凋亡的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細(xì)胞：正常人肝細(xì)胞Chang liver及腫瘤細(xì)胞HepG2細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。②中藥材：購買于北京同仁堂。③主要試劑：胎牛血清購自美國GIBCO公司；DMEM培養(yǎng)基、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；TGFβ1抗體、Smad3兔單克隆抗體、p-Smad2/3抗體、Smad7抗體購自Abcam公司；GAPDH抗體購自中山金橋，Annxin V-APC 凋亡檢測試劑盒(IVY0201-100test)購自晶萊生物,CCK8試劑盒購自日本同仁化工。④主要儀器設(shè)備：生物倒置顯微鏡(IX51，日本OLYMPUS)，CO

培養(yǎng)箱(XD-101，日本SANYO)，酶標(biāo)儀(RT-6000，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)，電泳儀(DYY-7C，北京六一生物科技有限公司)，4℃離心機(jī)(Neofuge 13R，Heal Force)，化學(xué)發(fā)光成像儀(型號(hào)5200，Tanon)，F(xiàn)ACSCanto流式細(xì)胞儀(型號(hào)657338，Biosciences)。

1.2 解毒涼血方含藥血清的制備 解毒涼血方由茵陳30 g，生地、黃芩、蒲公英、紫草、赤芍、生黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓各15 g，梔子12 g，升麻、大黃各9 g組成，共計(jì)195 g/劑，一日一劑用于60 kg成人劑量為3.3 g/kg，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》中相關(guān)公式計(jì)算大鼠用藥量為6.25×3.3 g/kg=20.63 g/kg。以上中藥2付(共390 g)，二次煎煮后濃縮至370 ml，濃度約1.05 g/ml。選用健康成年SD大鼠25只，體重(200±20)g，給藥前4 h禁食不禁水，用已制備好的解毒涼血方煎劑按2 ml/200 g體重灌胃，每12 h 給藥1次，共5次(連續(xù)3 d)。末次給藥后1 h，乙醚麻醉后腹主動(dòng)脈取血，無菌取血制備含藥血清。各組血清均混勻，56℃滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，凍存管分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

若以NaOH形式衡量，以1800m3/h尾氣計(jì)算，采用雙脫吸收工藝改造后，每年將減少NaOH（固體堿，反應(yīng)用掉的）用量約9.5t，但在實(shí)際運(yùn)行中，由于要外排一部分，保持一定的pH和堿濃度，其用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止，雙塔吸收工藝將減少廢堿渣和廢水的排放，減少對污水處理的影響，有利于環(huán)保。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) Chang liver、HepG2均應(yīng)用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μl/ml鏈霉素)于37℃、5% CO

條件下培養(yǎng)，每2～3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞長至80%鋪滿時(shí)再消化傳代。以上兩種細(xì)胞分別按1.5×10

個(gè)/孔均勻種于96孔板，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為正常組、模型組、空白血清組、15%含藥血清組、10%含藥血清組、5%含藥血清組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。15%含藥血清組、10%含藥血清組、5%含藥血清組分別加入含15%、10%、5%解毒涼血方含藥血清的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)處理24 h后，除正常組外其余各組均加入100 μl凋亡誘導(dǎo)劑(含50 ng/ml TNFα與0.5 μg/ml ActD)刺激24 h以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)在未接種細(xì)胞的空白孔中加入細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對照孔。

2.2 解毒涼血方含藥血清對TNF-α聯(lián)合ActD誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 空白血清組及模型組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對照組(

<0.01及

<0.001)，15%含藥血清組凋亡細(xì)胞率顯著低于模型組及空白血清組(

<0.01)。見圖2。

隨著數(shù)字化校園理念的提出，高校越來越重視信息化管理的重要性，利用數(shù)字化、信息化等技術(shù)手段對高校固定資產(chǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)管理，準(zhǔn)確地掌握固定資產(chǎn)的使用現(xiàn)狀，從而進(jìn)行合理配置，避免固定資產(chǎn)大批量閑置，發(fā)揮固定資產(chǎn)最大效益，為高校實(shí)現(xiàn)自身資源的優(yōu)化配置奠定基礎(chǔ)。

1.6 免疫熒光方法檢測凋亡肝細(xì)胞TGFβ1的表達(dá)及分布 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)完成后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，封閉液封閉后滴加TGFβ1抗體，4℃孵育過夜，二抗避光孵育2 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，PBS沖洗、吹干后滴加抗熒光猝滅劑封片，盡快采集圖像。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)完成后，收集各組細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至流式管內(nèi)，PBS洗滌2次，用1×binding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10

/ml，加入2 μl Annexin V FITC染料和2 μl PI染料，4℃避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 Western Blot方法檢測TGFβ1、p-TβR Ⅱ、Smad7及p-Smad2/3的表達(dá) 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)完成后，收集細(xì)胞樣本，加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)熱變性后采用SDS-PAGE電泳法分離并轉(zhuǎn)印到PVDF膜，5%脫脂牛奶/TBST混合液室溫封閉PVDF膜2 h，TBST洗膜后分別加入TGFβ1、Smad2、Smad7及p-Smad2/3抗體4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗，室溫下振搖反應(yīng)1.5 h，洗膜后滴加ECL發(fā)光液，置于X射線攝影暗匣中進(jìn)行曝光并掃描圖像。

式中:εs為初始學(xué)習(xí)率,rd表示衰退率,ec為當(dāng)前訓(xùn)練的迭代次數(shù),ed則是預(yù)設(shè)的超參數(shù),可控制學(xué)習(xí)率衰退的快慢。衰退學(xué)習(xí)率會(huì)隨著迭代次數(shù)的增加而減小,因此,在訓(xùn)練初期,學(xué)習(xí)率較大,模型可以快速地接近最優(yōu)解;而在訓(xùn)練后期,學(xué)習(xí)率逐漸變小,模型的訓(xùn)練也趨于穩(wěn)定,最終收斂于最優(yōu)解附近。

隨著國家對生態(tài)環(huán)境建設(shè)的重視，全社會(huì)有識(shí)之士都樂于進(jìn)行生態(tài)環(huán)境建設(shè)項(xiàng)目開發(fā)。所以要集全社會(huì)力量，以保障資金到位。

2 結(jié)果

2.3 肝細(xì)胞凋亡后TGFβ1表達(dá)及解毒涼血方含藥血清對TGFβ1表達(dá)的影響 免疫熒光結(jié)果顯示，模型組及空白血清組細(xì)胞加入TNFα聯(lián)合ActD處理24 h后細(xì)胞質(zhì)中TGF-β1表達(dá)水平顯著升高，15%含藥血清組細(xì)胞質(zhì)中TGFβ1表達(dá)低于模型組及空白血清組(

<0.001)。見圖3。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)完成后，每孔細(xì)胞均加入10 μl CCK-8反應(yīng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～3 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度。

2.1 解毒涼血方含藥血清抗細(xì)胞凋亡的有效干預(yù)濃度篩選 解毒涼血方含藥血清對細(xì)胞具有保護(hù)作用，高濃度(15%)及中濃度組(10%)藥物預(yù)處理后細(xì)胞活性顯著高于未處理組和低劑量組(5%)，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

<0.05)，解毒涼血方療效最佳的含藥血清濃度為15%。見圖1。

為了促進(jìn)鐵路運(yùn)輸企業(yè)全面預(yù)算責(zé)任主體落實(shí)的積極性，應(yīng)該建立完善鐵路運(yùn)輸企業(yè)績效考核體系，重點(diǎn)是對鐵路運(yùn)輸企業(yè)全面預(yù)算執(zhí)行是否及時(shí)到位、預(yù)算實(shí)際績效情況等進(jìn)行系統(tǒng)全面的評價(jià)分析，進(jìn)而準(zhǔn)確地掌握鐵路運(yùn)輸企業(yè)各預(yù)算責(zé)任主體的落實(shí)情況。同時(shí)，還應(yīng)該將預(yù)算績效考評與獎(jiǎng)懲機(jī)制相掛鉤，進(jìn)一步強(qiáng)化全面預(yù)算管理的導(dǎo)向性，促進(jìn)全面預(yù)算管理目標(biāo)的順利實(shí)現(xiàn)。

2.4 解毒涼血方含藥血清對TGFβ1信號(hào)通路活化和Smad磷酸化的影響 模型組及空白血清組在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后TGFβ1表達(dá)及TGFβⅡ型受體磷酸化(P-TβR Ⅱ)水平較正常組細(xì)胞顯著升高(

<0.01)，15%含藥血清組TGFβ1及P-TβR Ⅱ水平顯著低于模型組及空白血清組(

<0.05)，提示解毒涼血方含藥血清降低了TGFβ1表達(dá)及其Ⅱ型受體的磷酸化。15%含藥血清組Smad2/3磷酸化(p-Smad2/3)水平低于模型組及空白血清組(

<0.01)，Smad7表達(dá)水平高于模型組及空白血清組(

<0.001)。見圖4。

3 討論

AHF發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，在現(xiàn)有的研究中，肝細(xì)胞凋亡和免疫損傷仍是肝衰竭的主要發(fā)病機(jī)制。各種致病因素誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤肝臟，促進(jìn)免疫細(xì)胞激活和炎性細(xì)胞因子釋放，介導(dǎo)肝臟的免疫損傷過程，導(dǎo)致大量肝細(xì)胞凋亡壞死

。TNFα與肝細(xì)胞膜上的TNF-R1受體結(jié)合，啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，大量炎癥因子分泌形成瀑布效應(yīng)，形成內(nèi)毒素血癥

。內(nèi)毒素既可直接介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，又可以間接通過誘導(dǎo)TNFα繼發(fā)加重肝細(xì)胞凋亡。TNFα聯(lián)合ActD誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷較好的模擬了肝細(xì)胞凋亡的過程，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡的研究中

。肝細(xì)胞炎癥性凋亡、壞死是AHF的共同的病理特點(diǎn)

。因此，從抑制肝細(xì)胞凋亡、壞死入手，研制靶點(diǎn)明確、阻斷病情進(jìn)展的藥物，是治療該病的重要方向。

TGFβ1是一種多功能細(xì)胞因子，在細(xì)胞的增殖分化、創(chuàng)傷修復(fù)、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究顯示，TGFβ1與肝損傷、肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，也是誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生的重要原因之一

。TGFβ1可促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡

，抑制TGFβ1可抑制凋亡進(jìn)程并促進(jìn)肝細(xì)胞再生

。大量凋亡的肝細(xì)胞可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎因子參與免疫反應(yīng)，又加重了肝臟的損傷和肝功能的惡化。研究顯示，凋亡細(xì)胞釋放的外泌體可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TGFβ1

。Smads蛋白是TGFβ1信號(hào)通路中下游主要的效應(yīng)分子，在TGFβ1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有轉(zhuǎn)錄激活作用，是TGFβ1由膜受體到細(xì)胞核內(nèi)基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

。TGFβ1通過活化配體依賴的活性絲氨酸/蘇氨酸激酶異二聚體結(jié)合，使TGFβⅡ型受體(TβRⅡ)磷酸化，進(jìn)而引起TβRⅠ受體(TβRI)磷酸化。Smad2/3可被活化的TβRⅠ受體直接磷酸化，磷酸化的Smads2/3與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核，并在核內(nèi)與各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與調(diào)控相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄。Smad7在TGFβ1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起主要的負(fù)反饋?zhàn)饔?，是?xì)胞中TβRI絲氨酸/蘇氨酸激酶的拮抗蛋白，與TβRI結(jié)合后使之無法將Smad2/3磷酸化而阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。本研究結(jié)果顯示，解毒涼血方含藥血清有效降低了凋亡肝細(xì)胞TGFβ1表達(dá)及其TGFβⅡ型受體的磷酸化水平，與空白血清組及TNFα& ActD誘導(dǎo)凋亡組比較，15%含藥血清干預(yù)組Smad2/3的磷酸化水平降低，提示解毒涼血方能阻抑TGFβ1/Smad信號(hào)通路的活化。此外，解毒涼血方含藥血清組Smad7表達(dá)高于誘導(dǎo)模型組及空白血清組，提示解毒涼血方降低Smad2/3磷酸化可能是通過上調(diào)Smad7表達(dá)從而阻斷TGFβ1/Smad信號(hào)通路的活化。

肝衰竭屬中醫(yī)“急黃”“瘟黃”“肝瘟”等范疇，本病多為疫毒、藥毒、過量飲酒為患，其基本病機(jī)為濕熱毒邪熏蒸肝膽導(dǎo)致肝膽失于疏泄，進(jìn)而瘀阻脈絡(luò)，在“濕熱膠結(jié)”的基礎(chǔ)上形成“毒瘀阻絡(luò)”，臨證以清熱解毒、涼血化瘀為其基本治法。解毒涼血方是我們歷經(jīng)多年的研究和總結(jié)創(chuàng)立的治療急性肝衰竭的有效方藥。本方大劑量應(yīng)用茵陳清利肝膽經(jīng)之濕熱，同時(shí)配伍蒲公英、梔子清熱解毒，阻抑熱毒所致的肝損害；“瘀”是病變之本，且“毒”與“瘀”互為因果、交結(jié)難解，阻滯脈絡(luò)，以紫草、赤芍涼血化瘀，清解血分之熱，同時(shí)改善肝臟的微循環(huán)，使氣血通暢，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)，以達(dá)祛瘀生新之效。以升麻、白術(shù)、茯苓、黃芪健運(yùn)中州、利濕醒脾、使氣血得以生化，扶正以驅(qū)邪外出。綜上，全方共奏清熱解毒、涼血化瘀、利濕健脾之效。TGFβ1/Smad通路的激活和凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)在急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，本研究結(jié)果顯示，清熱解毒涼血法能降低肝細(xì)胞凋亡率、頓挫病勢，從而阻止肝衰竭進(jìn)展。解毒涼血方不僅降低TGFβ1的表達(dá)，而且降低了TGFβⅡ型受體的磷酸化及Smad2/3磷酸化，并上調(diào)了Smad7的表達(dá)，阻抑了TGFβ1/Smad介導(dǎo)的進(jìn)一步肝損傷，表明該方在肝衰竭進(jìn)展期可有效抑制肝細(xì)胞凋亡，從而阻斷肝衰竭進(jìn)展，這與該方在既往的臨床研究中改善慢加急性(亞急性)肝衰竭早中期患者預(yù)后的結(jié)論相一致

。

綜上，解毒涼血方對TNFα聯(lián)合ActD誘導(dǎo)的肝細(xì)胞調(diào)亡具有阻抑作用，其機(jī)制可能與該方抑制TGFβ1/Smad信號(hào)通路活化有關(guān)。

[1] Sarin SK,Choudhury A,Sharma MK,

.Acute-on-chronic liver failure: consensus recommendations of the Asian Pacific association for the study of the liver (APASL): an update[J].Hepatol Int,2019,13(4): 353-390.

[2] Li M,Qin XY,Furutani Y,

.Prevention of acute liver injury by suppressing plasma kallikrein-dependent activation of latent TGF-beta[J].Biochem Biophys Res Commun,2018,504(4): 857-864.

[3] Niu L,Cui X,Qi Y,

.Involvement of TGF-beta1/Smad3 signaling in carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice[J].PLoS One,2016,11(5): e156090.

[4] 劉慧敏，王憲波，侯藝鑫，等.解毒涼血方加減治療乙型肝炎慢加急性肝衰竭的隨機(jī)對照臨床研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,34(4): 412-417.

[5] 劉慧敏，王憲波，侯藝鑫，等.解毒涼血方聯(lián)合西藥治療乙型肝炎慢加急性肝衰竭患者64例臨床觀察[J].中醫(yī)雜志,2013,54(21):1829-1833.

[6] Triantafyllou E,Woollard KJ,Mcphail M,

.The role of monocytes and macrophages in acute and acute-on-chronic liver failu-re[J].Front Immunol,2018,9: 2948.

[7] Wang X,Ning Q.Immune mediated liver failure[J].Excli J,2014,13: 1131-1144.

[8] Wu Z,Han M,Chen T,

.Acute liver failure: mechanisms of immune-mediated liver injury[J].Liver Int,2010,30(6): 782-794.

[9] 時(shí)紅波，時(shí)紅林，張向穎，等.TNF-α/ActD協(xié)同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過調(diào)控糖原合成酶激酶3β促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2017,26(9):1006-1010.

[10] Dong V,Nanchal R,Karvellas CJ.Pathophysiology of acute liver failure[J].Nutr Clin Pract,2020,35(1): 24-29.

[11] Zhang Y,Guo J,Li Y,

.let-7a suppresses liver fibrosis via TGFbeta/SMAD signaling transduction pathway[J].Exp Ther Med,2019,17(5): 3935-3942.

[12] Vollmar J,Kim YO,Marquardt JU,

.Deletion of organic cation transporter Oct3 promotes hepatic fibrosis via upregulation of TGFbeta[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2019,317(2): G195-G202.

[13] Sakata K,Eda S,Lee ES,

.Neovessel formation promotes liver fibrosis via providing latent transforming growth factor-beta[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,443(3): 950-956.

[14] Mcmillin M,Grant S,Frampton G,

.The TGF beta1 receptor antagonist GW788388 reduces JNK activation and protects against acetaminophen hepatotoxicity in mice[J].Toxicol Sci,2019,170(2):549-561.

[15] Chen H,Kasagi S,Chia C,

.Extracellular vesicles from apoptotic cells promote TGF beta production in macrophages and suppress experimental colitis[J].Sci Rep,2019,9(1): 5875.

[16] 劉慧敏，王憲波，王融冰.基于解毒涼血法的中西醫(yī)結(jié)合方案治療乙型肝炎慢加急性肝衰竭療效分析[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2011,21(4):197-200.