原發(fā)性肝癌簡稱肝癌，由肝細胞癌、肝內(nèi)膽管細胞癌和混合型肝癌等組成，肝細胞癌約占90%

。有統(tǒng)計學(xué)研究表明，全球每年患肝癌的人數(shù)約為6萬人，我國占一半，且隨著社會壓力的增大、環(huán)境的污染以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率逐年升高，且死亡率也居高不下，因此，早期診斷與合理治療十分重要

。氧化苦參堿(OMT)是一種從槐屬植物根部提取的生物堿成分，具有抗炎、抗纖維化、抗腫瘤以及防止心肌損傷等作用

。Chen等

研究發(fā)現(xiàn)OMT對肺癌、胃癌細胞誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖具有抑制作用，然而OMT在抑制肝癌細胞中是否發(fā)揮作用研究少見。Keap1/ARE信號通路是一種抗氧化、化學(xué)刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，楊純

表明Keap1/ARE信號通路誘導(dǎo)的蛋白表達可能參與了肝癌發(fā)生與病情轉(zhuǎn)歸。因此，本研究以二乙基亞硝胺法建立肝癌大鼠模型，并基于Keap1/ARE信號通路探究OMT干預(yù)后對肝癌的影響，為OMT治療肝癌提供給實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠75只，6周齡，體質(zhì)量180～200 g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，動物生產(chǎn)許可號SCXK(滬)2019-0002。購買后置于23～25℃，濕度60%～65%，晝夜12 h交替適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要試劑與儀器 E2相關(guān)因子2(Nrf2)抑制劑Brusatol(美國MedChemExpress公司)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBil)、總膽汁酸(TBA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)ESISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)，兔抗鼠Nrf2、抗氧化反應(yīng)元件(ARE)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)單抗(美國Abcam公司)，ST-360酶標(biāo)儀(科華生物公司)。

新時期做好濕地自然保護區(qū)的建設(shè)工作，需要從我國濕地保護的現(xiàn)實情況出發(fā)，完善濕地保護管理機制，創(chuàng)新濕地保護策略，著力提高濕地自然保護區(qū)的穩(wěn)定性與科學(xué)化水平，在加大技術(shù)與資金投入基礎(chǔ)上開展?jié)竦乇Ｗo工作。

1.2.5 檢測肝組織IL-1β、TNF-α水平 各組取4只大鼠肝組織，稱重后，加入9倍體積的生理鹽水進行勻漿，取上清，按照IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒說明書加樣，用全自動酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光(A)值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出IL-1β、TNF-α的濃度。

30例參照組患者接受擦全身麻醉處理,具體方法為:實施麻醉前0.5h接受肌注0.5mg阿托品,同時監(jiān)測患者生命體征,之后將上肢靜脈通路開放,予以患者10ml/min乳酸林格液,靜脈滴注,之后靜脈滴注8mg維庫溴胺、0.3mg/kg依托咪酯、5μg/kg芬太尼、0.04mg/kg咪達唑侖,滴注完成3min后對患者予以氣管插管,連接麻醉呼吸機行機械通氣。

2.3 肝組織病理學(xué)變化 空白組大鼠肝組織細胞形態(tài)正常，排列整齊。模型組大鼠肝組織細胞排列紊亂，明顯腫脹，大量炎細胞浸潤。OMT組大鼠肝組織細胞排列較整齊，細胞有點狀壞死，損傷程度明顯改善。Brusatol組肝細胞腫脹、壞死、排列紊亂，炎細胞浸潤。OMT+Bru組大鼠肝組織細胞仍腫脹明顯，部分肝細胞排列有序，少量炎細胞侵潤。見圖1。

1.2.2 干預(yù)方法 在造模結(jié)束，即第17周開始，OMT+Bru組大鼠腹腔注射60 mg/kg OMT與2 mg/kg Nrf2抑制劑Brusatol(溶于1% DMSO中)，OMT組大鼠腹腔注射60 mg/kg OMT與等量1% DMSO，Brusatol組大鼠腹腔注射2 mg/kg Nrf2抑制劑Brusatol與等量1% DMSO，空白組大鼠注射等量1% DMSO和生理鹽水。OMT與生理鹽水每天注射1次，Brusatol和含1% DMSO的生理鹽水2 d注射1次，共注射20 d。

因此本文提出UAV+RFID技術(shù)在制品信息采集的無人機三維路徑規(guī)劃問題，旨在求解UAV+RFID技術(shù)在制品庫存信息采集的最優(yōu)化路徑，確保在規(guī)避障礙物的前提下實現(xiàn)在制品庫存的信息采集。

1.2.3 標(biāo)本采集 干預(yù)20 d后，各組大鼠用3%戊巴比妥按照40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹腔靜脈取血4 ml，3 500 r/min離心8 min，取上層血清-20℃保存。所有大鼠全部處死，分離肝組織，一部分-80℃保存，一部分用4%中性甲醛固定。

2.4.1 家庭支持:家是一個人最堅實的依靠,家庭的支持對于患者的治療而言具有重要的意義,具體表現(xiàn)在家人的態(tài)度可直接影響到患者的心情以及治療的信心,因此,采取恰當(dāng)?shù)姆绞奖磉_愛與關(guān)懷。作為患者的配偶,關(guān)鍵在于不嫌棄、不抱怨、不悲觀,盡量保持樂觀積極的心態(tài),并將這種心態(tài)傳遞給患者,讓其能以積極的心態(tài)接受造口。

1.2.4 ELISA法檢測血清ALT、AST、TBil、TBA 取-20℃保存的大鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書加樣，用全自動酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光(A)值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出ALT、AST、TBil、TBA濃度。

1.2 方法

飛速發(fā)展的互聯(lián)網(wǎng)時代帶給高職院校學(xué)生新的就業(yè)機會同時也帶來一系列挑戰(zhàn)，新時代的到來意味著人才競爭更加激烈，各行各業(yè)要求更加精細化，如在網(wǎng)上購買一臺電腦，需要技術(shù)人員維護平臺、客服溝通、廠家發(fā)貨、物流運輸、快遞員精準(zhǔn)送貨、售后服務(wù)等一系列人才，隨著電商的發(fā)展崗位也日新月異，社會對人才的培育需要有較強的業(yè)務(wù)素質(zhì)和健康的心理素質(zhì)，較強的團隊協(xié)作精神和嚴(yán)謹?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)等。

1.2.6 HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化 4%中性甲醛中固定的肝組織梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚度4 μm，行常規(guī)HE染色。封片后置于顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)。

2.1 各組大鼠血清ALT、AST、TBil、TBA水平 見表1。

1.2.8 Western Blot法檢測肝組織Nrf2、Keap1、ARE蛋白相對表達水平 -80℃保存的肝組織100 mg，研磨后加蛋白抽提裂解液，冰上裂解，離心取上清進行蛋白定量，100℃水浴使蛋白變性，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗膜后加入1∶1 000稀釋的Nrf2、Keap1、ARE一抗，4℃孵育過夜，洗膜后加入1∶4 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析圖像，以β-actin為內(nèi)參，Nrf2、Keap1、ARE蛋白相對表達水平以各蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示。

2.2 各組大鼠肝組織IL-1β、TNF-α水平 見表2。

2 結(jié)果

1.2.7 TUNEL染色檢測大鼠肝癌細胞凋亡情況 石蠟包埋的肝組織切片進行脫蠟，0.3% H

O

浸泡5 min；PBS清洗5 min，2次；加入蛋白酶K 37℃孵育30 min；PBS清洗5 min，3次；加入Tunel反應(yīng)液37℃孵育60 min；PBS清洗5 min，3次；滴加3% BSA室溫孵育20 min；PBS清洗5 min，3次；POD轉(zhuǎn)換液37℃濕盒孵育30 min，PBS清洗5 min；DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察肝癌組織細胞凋亡情況，每張切片選取5個視野，計算凋亡率(凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%)。

加強型切口翅片是在普通切口型翅片的基礎(chǔ)上局部改動優(yōu)化所得，關(guān)鍵要點在凸凹刀齒的配合上，既要形成加強筋起到加強作用，又要使錯位在鋁材的可延伸范圍內(nèi)，不至于形成新的切口，反而降低了翅片的強度[5-6]，如圖5和圖6所示關(guān)鍵控制點。

1.2.1 大鼠肝癌模型建立及分組 除空白組外，實驗大鼠腹腔注射二乙基亞硝胺50 mg/kg，空白組大鼠注射等量生理鹽水，每周1次，連續(xù)注射16周。預(yù)實驗中經(jīng)HE染色光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)注射二乙基亞硝胺后實驗大鼠肝組織細胞有不同程度的壞死、變形，纖維組織增生，癌變肝細胞呈灶狀、巢狀或條索裝分布，證實造模成功。造模成功的大鼠隨機分為空白組、模型組、OMT組、Brusatol組、OMT+Bru組，每組15只。

2.4 各組大鼠肝癌細胞凋亡情況 模型組、OMT組、Brusatol組、OMT+Bru組大鼠肝癌細胞凋亡率分別為：(9.44±1.86)%、(31.46±2.69)%、(5.23±1.32)%、(18.79±2.12)%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

<0.05)。見圖2。

2.5 各組大鼠肝組織Nrf2、Keap1、ARE蛋白相對表達水平 見表3，圖3。

3 討論

目前，肝癌的致病原因還在探索中，初步認為肝癌是基因和環(huán)境因素共同導(dǎo)致的結(jié)果。肝癌早期無特異性癥狀，中晚期癥狀較多，常表現(xiàn)為肝區(qū)疼痛、腹脹、乏力、進行性肝腫大或上腹部包塊等，部分患者出現(xiàn)黃疸、腹瀉、低熱、上消化道出血等

。OMT是從西北地區(qū)特有的苦參根中提取的豆科槐屬類生物堿，具有止痛抗炎、抗內(nèi)毒素效應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫等多方面的藥理作用，同時OMT對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)結(jié)腸炎、慢性乙型肝炎、實驗性重癥急性胰腺炎起到不同程度的治療效果

。因此，本研究分析了OMT對大鼠肝癌的抑制作用以及對肝損傷的影響。

轉(zhuǎn)氨酶是人體代謝過程中必不可少的催化劑，主要存在于肝細胞內(nèi)。當(dāng)肝細胞損傷時，轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液里，使血清轉(zhuǎn)氨酶升高。ALT是轉(zhuǎn)氨酶主要檢測項目，可敏感地監(jiān)測到肝臟是否受到損害

。AST主要存在于肝細胞線粒體內(nèi)，當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時，血清中AST濃度可異常升高

。TBil反映肝臟分泌和排泄功能

，健康人的外周血血清TBA含量極微，當(dāng)肝細胞損害或肝內(nèi)、外阻塞時，TBA表現(xiàn)為異常升高

。IL-1β、TNF-α均為促炎因子，TNF-α在多種肝損傷模型及人類肝病中起著關(guān)鍵作用。研究表明，TNF-α與酒精性肝炎、病毒性肝炎、爆發(fā)性肝衰竭有關(guān)，TNF-α水平顯著升高

。本研究中OMT組大鼠血清ALT、AST、TBil、TBA、IL-1β、TNF-α水平較肝癌模型組降低，提示OMT減輕肝癌大鼠肝損傷，降低炎癥反應(yīng)。房偉等

研究表明OMT能夠抑制人胃癌BGC-823細胞生長，促進胃癌細胞凋亡。孫超群等

研究發(fā)現(xiàn)OMT可以抑制人膀胱癌T24細胞增殖，促進其凋亡。本研究中OMT組大鼠肝組織病理損傷明顯改善，肝癌細胞凋亡率明顯高于模型組，提示OMT通過促進肝癌細胞凋亡抑制大鼠肝癌，保護肝組織。

Keap1-Nrf2/ARE信號通路是迄今發(fā)現(xiàn)的最重要抗氧化通路，參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。Nrf2是活力最強的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，發(fā)生激活障礙可導(dǎo)致細胞對應(yīng)激源的敏感性升高。ARE是特異性DNA-啟動因子結(jié)合序列，可與Nrf2特異性結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)抗氧化蛋白生成。Keap1是Nrf2調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，正常情況下與Nrf2呈結(jié)合狀態(tài)，受到自由基刺激后解離，致Nrf2活化。Keap1-Nrf2/ARE信號通路對某些腫瘤細胞具有抑制作用，通過激活Nrf2的活性，促進其核異位來誘導(dǎo)相關(guān)保護蛋白抵抗正常細胞發(fā)生惡變的能力，同時提高腫瘤細胞中某些促凋亡蛋白的表達進而促使其發(fā)生凋亡

。田崇梅等

發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉通過抑制人肺腺癌A549細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)控Keap1/Nrf2/ARE抗氧化信號通路，從而促進腫瘤細胞凋亡。常景芝等

發(fā)現(xiàn)微小RNA-141可能通過靶向負調(diào)控Keap1激活Nrf2/ARE信號通路，誘導(dǎo)抗氧化酶的表達，以降低細胞氧化應(yīng)激水平，從而抑制乳腺癌細胞的活力。本研究中與模型組比較，OMT組、OMT+Bru組Nrf2、ARE上調(diào)，Keap1下調(diào)，Nrf2抑制劑Brusatol組Nrf2、ARE下調(diào)，Keap1上調(diào)，提示OMT可能通過促進肝癌組織中Nrf2活化，激活下游ARE信號，誘導(dǎo)相關(guān)抗氧化蛋白生成，從而減輕肝損傷，發(fā)揮肝臟保護作用。

綜上所述，OMT對大鼠肝癌具有抑制作用，能夠改善肝損傷，可能是通過激活Keap1/ARE通路發(fā)揮作用，為臨床肝癌治療提供理論支持。

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