肝內(nèi)膽汁淤積引起的肝損傷可導(dǎo)致肝纖維化，而肝纖維化又是肝硬化以及早期肝癌的病理特征，因此阻止肝內(nèi)膽汁淤積對(duì)于肝臟病變的防治具有重要意義。核因子-κB(NF-κB)是機(jī)體內(nèi)一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞因子的表達(dá)

。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生膽汁淤積的肝組織中可檢測(cè)到NF-κB的激活

。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)屬于核受體超家族，研究證實(shí)它在糖、脂代謝以及炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用

。研究報(bào)道，PPARγ對(duì)肝損傷具有一定調(diào)控作用，在該過程中PPARγ與NF-κB結(jié)合，抑制NF-κB信號(hào)通路及其下游炎性因子的表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用

。金茵利膽膠囊具有疏肝利膽、清熱利濕的效用。研究報(bào)道，金茵利膽可明顯改善急性梗阻性化膿性膽管炎患者的肝功能

。目前關(guān)于金茵利膽膠囊對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積的治療作用以及對(duì)PPARγ/NF-κB通路的影響尚未見有報(bào)道，本研究構(gòu)建肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型探究金茵利膽膠囊對(duì)其作用以及相關(guān)機(jī)制。

EPC項(xiàng)目出現(xiàn)主要的風(fēng)險(xiǎn)源就是工期。具體的施工過程中，工程的承包商需要選用倒排工序和正向組織的策略，對(duì)工程的整體進(jìn)度計(jì)劃進(jìn)行設(shè)計(jì)，階段進(jìn)度計(jì)劃的制定，要利用關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和工序與流程的有效控制，進(jìn)行動(dòng)態(tài)化管理控制，確保工程的進(jìn)度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，體重(200±10)g，雌雄各半，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 金茵利膽膠囊購自陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；熊去氧膽酸購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；α-萘異硫氰酸酯(alpha-naphthylisothi,ANIT)購自美國Sigma公司；Trizol RNA分離試劑、T-PER組織蛋白抽提試劑、Bradford蛋白定量試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；總膽紅素(TBil)試劑盒、總膽汁酸(TBA)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒購自中生北控生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；PPARγ抗體、NF-κB p65抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Bsep抗體、Ntcp抗體和Mrp2抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。單通道移液器、高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；普通光學(xué)顯微鏡購自德國Leica公司；酶標(biāo)儀、垂直板電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、蛋白轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western Blot)檢測(cè)PPARγ、NF-κB p65以及Bsep、Ntcp和Mrp2蛋白的表達(dá) 將大鼠肝臟組織從液氮中取出，剪碎，放入勻漿器，向組織碎塊中滴加1 ml裂解液，置于冰上裂解10 min，隨后使用勻漿器研磨至無組織碎片，將研磨得到的組織液收集至離心管中，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將各組蛋白樣本50 g與上樣緩沖液混合均勻，沸水浴中處理5 min，加入到凝膠上樣孔中，80 V電壓約30 min可跑完濃縮膠，隨后上調(diào)電壓至120 V，約60 min可跑完分離膠，結(jié)束電泳。取出凝膠，切去多余部分，與硝酸纖維素(PVDF)膜一起疊放于兩片濾紙中間，于蛋白轉(zhuǎn)膜儀中200 mA轉(zhuǎn)膜2.5 h。取PVDF膜用5%脫脂奶封閉液室溫封閉1 h，洗滌3次后，加入相應(yīng)的稀釋(1∶1 000)一抗室溫孵育2 h，洗滌后再加入稀釋(1∶2 000)二抗室溫孵育1 h，洗滌后顯色，成像系統(tǒng)拍照，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.3.1 動(dòng)物造模及給藥 40只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、金茵利膽膠囊組、陽性藥組，每組10只。模型組大鼠于第5天給予一次65 mg/kg ANIT灌胃

，其余時(shí)間均予以等體積生理鹽水灌胃，每天1次，共計(jì)7 d。根據(jù)成人用藥劑量換算，金茵利膽膠囊組大鼠給予0.54 g/kg灌胃，每天1次，連續(xù)7 d，并于第5天時(shí)增加一次0.1 g/kg ANIT灌胃。陽性藥組大鼠給予熊去氧膽酸0.1 g/kg灌胃，每天1次，連續(xù)7 d，并于第5天時(shí)增加一次0.1 g/kg ANIT灌胃。正常組大鼠予以等體積生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)7 d。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)TBil、TBA、AST、ALT、TNF-α、IL-1β水平 對(duì)各組動(dòng)物麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，離心收取血清，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作，測(cè)定各組血清中TBil、TBA、AST、ALT、TNF-α、IL-1β水平。

通過對(duì)輔導(dǎo)員的職業(yè)生涯進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)在輔導(dǎo)員的職業(yè)生涯中，有的輔導(dǎo)員認(rèn)為自己從事的輔導(dǎo)行業(yè)不是一個(gè)可以從事一輩子的行業(yè)，更有人認(rèn)為這樣的職業(yè)只是一個(gè)跳板[2]，無心提升自身的職業(yè)能力；而有的輔導(dǎo)員能夠清晰崗位職責(zé)，明確自身定位，積極提升自身職業(yè)能力，進(jìn)入職業(yè)化、專業(yè)化的發(fā)展階段[3]；因此研究結(jié)果得出：在輔導(dǎo)員的職業(yè)生涯中，如果沒有對(duì)自身職業(yè)的規(guī)劃，則有轉(zhuǎn)崗現(xiàn)象存在；若有明確的規(guī)劃，則進(jìn)入職業(yè)化、專業(yè)化的發(fā)展階段，強(qiáng)者越強(qiáng)。

(3)長江體育產(chǎn)業(yè)帶。長江經(jīng)濟(jì)帶是我國經(jīng)濟(jì)布局“T”字形空間結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略的主要發(fā)展軸。長江干流在江蘇省流經(jīng)南京、鎮(zhèn)江、揚(yáng)州、泰州、常州、無錫、蘇州、南通等8個(gè)城市，《江蘇省“十三五”旅游業(yè)發(fā)展規(guī)劃》中提出構(gòu)建“四帶兩圈一網(wǎng)”的省域旅游發(fā)展格局，長江旅游帶是其中四帶之一。江蘇省體育小鎮(zhèn)的建設(shè)，應(yīng)以沿長江8市為聚集點(diǎn)，依托豐富多彩的長江景觀帶和大江風(fēng)貌，科學(xué)利用長江島洲，開發(fā)長江休閑體育旅游，打造長江體育產(chǎn)業(yè)帶，培育一批高品質(zhì)、有特色的體育小鎮(zhèn)。

1.3.3 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織病理學(xué)變化 取血后立即處死大鼠，取肝臟并用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，部分儲(chǔ)存于液氮備用，其余部分置于10%甲醛溶液中，經(jīng)脫水、石蠟包埋后進(jìn)行切片。取切片進(jìn)行脫蠟，經(jīng)100%、95%、90%、80%、70%乙醇處理后水洗，置于蘇木素溶液中染色10 min，撈出水洗，使用1%鹽酸酒精進(jìn)行30 s分化處理，水洗，置于伊紅溶液中染色2 min，水洗后脫水并透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

呂振霖：太湖治理要跳出水利看水利。太湖藍(lán)藻事件警示我們，加強(qiáng)河湖管理，維護(hù)河湖的健康生命，保障防洪安全和水資源的可持續(xù)利用，已經(jīng)成為新時(shí)期江蘇水利的一項(xiàng)突出而又緊迫的任務(wù)?！昂娱L制”便是河湖管理中長效保障措施之一。江蘇今后將繼續(xù)按照《條例》有關(guān)規(guī)定和精神要求，認(rèn)真執(zhí)行“河長制”，為貫徹落實(shí)《條例》、治理太湖繼續(xù)不懈努力。

2 結(jié)果

傳統(tǒng)的校企合作模式是雙方簽訂實(shí)習(xí)基地協(xié)議，在學(xué)生生產(chǎn)實(shí)習(xí)過程中并沒有具體的企業(yè)對(duì)實(shí)踐學(xué)生具體的指導(dǎo)任務(wù)和指導(dǎo)效果評(píng)價(jià)。要提高實(shí)踐基地的效率，首要條件是制定科學(xué)合理的實(shí)踐教學(xué)計(jì)劃，通過校企雙方共同努力，依據(jù)合作共贏的原則，使得實(shí)踐教學(xué)達(dá)到預(yù)期效果。近年來，鹽城工學(xué)院土木工程系已陸續(xù)建立二十余個(gè)校外實(shí)習(xí)基地，學(xué)生在企業(yè)實(shí)習(xí)期間，必須按照企業(yè)統(tǒng)一部署，由企業(yè)定人定崗進(jìn)行管理，按照正式員工的工作要求，全過程參與工程建設(shè)，保證了實(shí)習(xí)效果。學(xué)校按照學(xué)生企業(yè)實(shí)習(xí)制度，由學(xué)院統(tǒng)一部署，實(shí)習(xí)教師專門負(fù)責(zé)，定期和不定期地到企業(yè)和相關(guān)工程項(xiàng)目中對(duì)學(xué)生的實(shí)習(xí)過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢查和評(píng)估，保證實(shí)習(xí)效果。

2.3 金茵利膽膠囊對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠膽汁代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見圖2、表2。

2.2 金茵利膽膠囊對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝組織病理學(xué)的影響 正常組大鼠肝組織呈現(xiàn)出正常的單行排列板狀結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞無壞死；模型組大鼠肝組織發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤，并伴有大面積的肝細(xì)胞壞死；相較于模型組，金茵利膽膠囊組和陽性藥組大鼠肝組織無炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞壞死面積減小。見圖1。

2.4 金茵利膽膠囊對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝組織PPARγ、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 見圖3、表3。

2.1 金茵利膽膠囊對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝功能的影響 見表1。

2.5 金茵利膽膠囊對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影響 見表4。

3 討論

肝內(nèi)膽汁淤積可由肝內(nèi)膽道病變或肝細(xì)胞損傷引起，膽酸鹽過度蓄積于血清和肝臟中，持續(xù)的蓄積可導(dǎo)致肝纖維化甚至肝硬化或肝癌

。因此，尋求安全有效的肝內(nèi)膽汁淤積治療方法對(duì)于防治肝臟病變具有重要意義。

ANIT是一種動(dòng)物肝毒性化學(xué)藥物，可使膽管發(fā)生阻塞，膽汁淤積于肝臟，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死

。ANIT因其誘發(fā)的肝損傷無論是在生化指標(biāo)上還是在病理改變上，均與人類肝內(nèi)膽汁淤積性肝病的變化相似，所以常被用來建立肝內(nèi)膽汁淤積動(dòng)物模型。Xu等

研究報(bào)道，在ANIT制備的肝內(nèi)膽汁淤積大鼠血清中可檢測(cè)到ALT、AST、TBIL和TBA水平的升高，大鼠膽汁流動(dòng)阻塞，發(fā)生肝臟損傷。向華夏等

研究報(bào)道，可在肝內(nèi)膽汁淤積大鼠中檢測(cè)到Bsep、Ntcp和Mrp2等膽酸代謝相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)。在本研究中，灌服ANIT的模型組大鼠血清中肝功能指標(biāo)TBil、TBA、AST、ALT水平明顯升高，膽酸代謝相關(guān)蛋白Bsep、Ntcp和Mrp2蛋白表達(dá)顯著降低，肝組織細(xì)胞出現(xiàn)水腫壞死、膽管周圍可見炎細(xì)胞浸潤及破壞，表明造模成功。金茵利膽膠囊具有抗炎、護(hù)肝、利膽、鎮(zhèn)痛等作用，主要用于治療慢性肝炎和急性黃疸型肝炎。陶立華等

研究報(bào)道，金茵利膽可降低TBil和AST水平，輔助治療新生兒高膽紅素血癥。本研究結(jié)果顯示，金茵利膽膠囊可使肝內(nèi)膽汁淤積大鼠血清中TBil、TBA、AST、ALT水平顯著降低，Bsep、Ntcp和Mrp2蛋白表達(dá)顯著升高，減少肝組織中炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死，提示金茵利膽膠囊可改善大鼠肝內(nèi)膽汁淤積情況，對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下以無活性形式存在于胞漿，當(dāng)細(xì)胞受到傷害性刺激時(shí)，NF-κB磷酸化被激活，進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合相應(yīng)靶基因，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。NF-κB是多個(gè)信號(hào)通路的交叉點(diǎn)，具有多種生物學(xué)活性，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用

。NF-κB p65是哺乳動(dòng)物體內(nèi)相對(duì)含量最豐富的NF-κB家族成員，也是NF-κB發(fā)揮功能的主要亞單位。Zhang等

研究證實(shí)，在妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥患者中可檢測(cè)到NF-κB高表達(dá)和炎癥反應(yīng)。PPARγ對(duì)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)具有負(fù)調(diào)控作用，它可與NF-κB結(jié)合，使NF-κB出核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而拮抗NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，相較于正常組，模型組PPARγ表達(dá)顯著降低，NF-κB p65表達(dá)以及TNF-α和IL-1β水平顯著升高，與Zhang等

發(fā)現(xiàn)相符。本研究還發(fā)現(xiàn)，相較于模型組，金茵利膽膠囊組PPARγ表達(dá)顯著升高，NF-κB p65表達(dá)以及TNF-α和IL-1β水平顯著降低。Li等研究報(bào)道，在膿毒癥模型小鼠中，上調(diào)PPAR-γ表達(dá)可抑制NF-κB的激活，降低炎性細(xì)胞因子(如TNF-α，IL-1β)的水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，有效降低血清AST、ALT和肝臟指數(shù)，減輕肝臟病理損傷。另外，在急性肝損傷小鼠模型中亦發(fā)現(xiàn)上調(diào)PPAR-γ表達(dá)，可顯著降低血清ALT、AST水平，抑制NF-κB通路活化，減少TNF-α和IL-1β的分泌。提示金茵利膽膠囊可能通過上調(diào)PPARγ表達(dá)，下調(diào)NF-κB表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝臟。

綜上所述，金茵利膽膠囊可能通過調(diào)控PPARγ/NF-κB通路，減輕肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝損傷程度，為臨床開發(fā)肝內(nèi)膽汁淤積治療藥物提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但金茵利膽膠囊的臨床效用還需要進(jìn)行更多的臨床驗(yàn)證。

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