SMAD7對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響

李碧筠，黃思藝，王鈺錕，王 磊，何莉娜，唐 雪，徐德軍，趙中權(quán)

(西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育離不開(kāi)顆粒細(xì)胞的增殖和分化，而顆粒細(xì)胞的凋亡往往導(dǎo)致卵泡的閉鎖。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factors-β，TGF-β)是一種多功能的多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化、凋亡、侵襲、遷移等過(guò)程，并參與了機(jī)體發(fā)育、免疫等生物學(xué)過(guò)程。SMAD蛋白位于TGF-β信號(hào)通路下游，在該通路傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，絕大多數(shù)的TGF-β家族成員均需要通過(guò)SMAD信號(hào)通路才能參與細(xì)胞內(nèi)的各種生理過(guò)程。SMAD7作為T(mén)GF-β和BMP信號(hào)通路的傳導(dǎo)拮抗因子，對(duì)TGF-β/SMAD信號(hào)通路具有抑制作用。最近的研究表明，SMAD7可能是卵泡發(fā)育的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。Gao等確定了SMAD7在小鼠的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，并在體外試驗(yàn)中證明了SMAD7受到了來(lái)自細(xì)胞外的TGF家族成員TGF-β1、BMP4和GDF9的調(diào)控，并通過(guò)siRNA 干擾試驗(yàn)證明了SMAD7是TGF-β1的負(fù)調(diào)控因子。孫玉英等在滋陰補(bǔ)陽(yáng)的中西醫(yī)結(jié)合療法對(duì)鼠卵巢儲(chǔ)備功能下降的無(wú)排卵不孕大鼠模型試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠較正常組大鼠卵巢中的發(fā)育卵泡、成熟卵泡和黃體減少，閉鎖卵泡明顯增加，同時(shí)伴隨著SMAD2、SMAD3蛋白水平的降低和SMAD7蛋白水平的上升。

SMAD蛋白家族的其他成員也對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、激素分泌存在著調(diào)控作用，各個(gè)SMAD蛋白介導(dǎo)不同TGF-β家族成員的信號(hào)傳導(dǎo)。有研究表明，2、3調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育進(jìn)程。例如，Li等發(fā)現(xiàn)，敲除2、3基因會(huì)導(dǎo)致雌鼠的卵泡發(fā)育受阻并最終導(dǎo)致卵泡閉鎖，其生殖能力顯著下降。常迪等發(fā)現(xiàn)，2在綿羊的卵巢顆粒細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，并在成熟卵泡時(shí)期的表達(dá)水平最高。Nomura等發(fā)現(xiàn)，激活素可以通過(guò)2信號(hào)通路刺激顆粒細(xì)胞中19A1的表達(dá)，而抑制2下調(diào)19A1的表達(dá)，表明2可以通過(guò)調(diào)控19A1的表達(dá)影響雌激素分泌。此外，徐瑛蕾還發(fā)現(xiàn),3對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞中191的表達(dá)有促進(jìn)作用。這些證據(jù)都表明，SMAD信號(hào)通路可能參與了卵泡的發(fā)育和閉鎖過(guò)程。

在卵泡發(fā)育過(guò)程中，下丘腦、垂體分泌的促性腺激素、性腺類(lèi)固醇激素和來(lái)自其他腺體以及卵巢內(nèi)部產(chǎn)生的其他激素和細(xì)胞因子都參與了卵泡的發(fā)育過(guò)程。卵巢中的類(lèi)固醇激素主要包括雄激素、雌激素、孕酮，它們主要由顆粒細(xì)胞分泌。研究表明，敲除雌激素合成的關(guān)鍵酶基因19A1，小鼠卵泡發(fā)育會(huì)停止在早期小腔卵泡階段，而經(jīng)過(guò)外源性雌激素治療后，能夠恢復(fù)卵泡的正常發(fā)育。在排卵前卵泡中的孕酮一直維持在一個(gè)較低的水平，直到功能黃體生成后顆粒細(xì)胞才開(kāi)始大量合成孕酮以維持外周血中的孕酮濃度，進(jìn)而維持雌性哺乳動(dòng)物的妊娠狀態(tài)。此外，高水平的孕酮會(huì)抑制原始卵泡的募集，抑制顆粒細(xì)胞生成雌二醇，進(jìn)而影響卵泡的后續(xù)發(fā)育過(guò)程。盡管以往的證據(jù)表明，7的表達(dá)水平與卵泡發(fā)育、閉鎖有關(guān)，但其具體的作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步的研究。本試驗(yàn)探究7對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、類(lèi)固醇激素分泌及SMAD信號(hào)通路的影響，為揭示卵泡發(fā)育、閉鎖調(diào)控機(jī)制提供試驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DME/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰酶、CCK-8 試劑盒、蛋白預(yù)染marker、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS-PAGE蛋白制膠試劑盒購(gòu)自重慶葆光生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞裂解液購(gòu)自Solarbio公司，LipoHigh脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑、RNAiso、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenPremix Ex TaqII購(gòu)自TaKaRa公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自生工生物工程股份有限公司， SMAD7 Rabbit pAb、SMAD2 Rabbit pAb、SMAD3 Rabbit pAb、SMAD4 Rabbit pAb、P-SMAD2 Rabbit pAb、P-SMAD3 Rabbit pAb、BAX Rabbit pAb、2 Rabbit pAb、PCNA Rabbit pAb購(gòu)自重慶卡爾波生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng)

試驗(yàn)動(dòng)物選用西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)羊場(chǎng)3～4月齡健康大足黑山羊，所有試驗(yàn)均得到西南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。待山羊屠宰后，將卵巢取出用75%的酒精噴洗，再用無(wú)菌的PBS緩沖液沖洗3遍，放入37 ℃無(wú)菌生理鹽水中，迅速帶回試驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)操作。山羊卵泡顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)參照Z(yǔ)hao等的報(bào)道。

1.3 質(zhì)粒載體擴(kuò)增與siRNA合成

SMAD7-pcDNA3.1(+)-N-eGFP質(zhì)粒載體(圖1)構(gòu)建委托南京金斯瑞公司合成，對(duì)照組為空白載體。7的干擾RNA委托重慶銳博生物有限公司和上海生工合成，干擾RNA的序列(表1)。利用qRT-PCR檢測(cè)siRNA干擾效率，選擇siRNA-SMAD7作為后續(xù)試驗(yàn)材料。按照制造商說(shuō)明向感受態(tài)大腸桿菌中加入 SMAD7-pcDNA3.1(+)-N-eGFP質(zhì)粒載體，將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌滴加在含有相應(yīng)抗生素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，放入37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的單菌落數(shù)，置于離心管中后放入搖床搖菌。取100 mL培養(yǎng)好的菌液吸凈上清液，向菌體沉淀中分別加入Buffer MP1、Buffer MP2、Buffer MP3然后離心。將上清液多次純化，加入異丙醇后離心留沉淀。用70%的乙醇清洗質(zhì)粒DNA，離心后室溫干燥質(zhì)粒DNA。用適量的ddHO溶解質(zhì)粒DNA，然后在儀器上測(cè)定其OD值是否符合標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 SMAD7過(guò)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of overexpression vector of SMAD7

表1 siRNA序列

1.4 質(zhì)粒與siRNA轉(zhuǎn)染

利用LipoHigh脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑分別將NC質(zhì)粒、Smad7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、siRNA-SMAD7及siRNA-control轉(zhuǎn)染至山羊卵泡顆粒細(xì)胞，每組3個(gè)重復(fù)。按轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明，取兩個(gè)1.5 mL離心管，分別加入125 μL DME/F-12培養(yǎng)液，然后于其中一管加入100 pmol siRNA或4 μg質(zhì)粒吹打混勻；另一管加入10 μL高效轉(zhuǎn)染試劑吹打混勻，室溫靜置5 min后，將含有siRNA或質(zhì)粒的培養(yǎng)液加入含高效轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中吹打混勻，室溫靜置20 min。 將制備好的轉(zhuǎn)染溶液加至六孔板，并用純DME/F-12加至每孔2 mL，于37 ℃，5% CO中培養(yǎng)，6 h后更換為含胎牛血清的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24～48 h后觀察結(jié)果或收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 CCK8及流式細(xì)胞術(shù)

將細(xì)胞接種于96孔板并轉(zhuǎn)染，向每孔加入10 μL CCK8溶液。將96孔板置于培養(yǎng)箱孵育24、36、48、72 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(OD值)。用胰酶消化收集轉(zhuǎn)染后的山羊卵巢顆粒細(xì)胞，將用PBS重懸的細(xì)胞液離心并再次重懸，加入5 mL預(yù)冷的70%乙醇于4 ℃固定過(guò)夜。再次離心重懸后加入5 μL RNaseA(10 mg·mL)37 ℃消化1 h，加入50 mg·mL碘化丙啶37 ℃避光染色1 h，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用RNAiso試劑(TaKaRa，中國(guó))從顆粒細(xì)胞中提取總RNA。使用Nanodrop1000分光光度計(jì)(中國(guó))測(cè)定RNA濃度和純度。研究中僅考慮吸光度比A/A為1.8～2.0的樣品。根據(jù)PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書(shū)的要求首先去除基因組DNA，之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。所有基因序列均源自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，引物委托生工生物工程股份有限公司(上海)合成，合成引物及序列見(jiàn)表2。TB GreenPremix Ex TaqII熒光定量PCR的反應(yīng)體系為10 μL：TB GreenPremix Ex TaqII 5 μL、Forward primer(10 μmol·L)0.4 μL，Reverse primer(10 μmol·L)0.4 μL、cDNA0.5 μL、RNase Free HO 3.7 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)39次；63.5 ℃檢測(cè)信號(hào)，熔解曲線溫度根據(jù)引物不同設(shè)置為65～95 ℃，每0.5 ℃讀取一次Ct 值。

1.7 總蛋白提取和Western blot檢測(cè)

按照動(dòng)物全蛋白提取試劑盒(Sangon Biotech，上海)說(shuō)明書(shū)提取顆粒細(xì)胞的總蛋白，提取的總蛋白按需求分裝后-80 ℃冷凍保存。采用BCA法測(cè)量蛋白的濃度，具體步驟參考改良型BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Sangon Biotech，上海)說(shuō)明書(shū)。將蛋白樣加入4 × SDS蛋白上樣緩沖液后，沸水浴10 min，迅速將蛋白樣放入冰盒或-80 ℃。經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜等操作，將PVDF膜放入裝有封閉液的培養(yǎng)皿中封閉2 h；TBST緩沖液洗3次，每次10 min，過(guò)夜孵育對(duì)應(yīng)的一抗；TBST緩沖液洗3次，每次10 min，二抗孵育1 h；TBST緩沖液洗3次，每次10 min，利用顯影液在照膠儀下觀察蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)使用prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用獨(dú)立檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)間的比較進(jìn)行分析。每個(gè)選擇鑒定的基因、蛋白均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)以及3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，<0.05表示差異顯著，<001表示差異極顯著，>0.05表示差異不顯著。

表2 用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 siRNA干擾效率與SMAD7-pcDNA3.1(+)-N-eGFP轉(zhuǎn)染結(jié)果

通過(guò)高效脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將7的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)顆粒細(xì)胞中，利用qRT-PCR對(duì)7的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3條siRNA對(duì)7的干擾效率均低于70%(圖2A)。因此重新設(shè)計(jì)了3條7的siRNA進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)新設(shè)計(jì)的siRNA1的干擾效率最高，且干擾效率大于70%，故選用siRNA1作為后續(xù)試驗(yàn)所用的干擾RNA，將其命名為siRNA-SMAD7作為后續(xù)試驗(yàn)材料(圖2B)。

通過(guò)高效脂質(zhì)體將SMAD7-pcDNA3.1(+)-N-eGFP質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，24～36 h后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明質(zhì)粒載體成功轉(zhuǎn)染進(jìn)了顆粒細(xì)胞(圖2C-E)，可以對(duì)其進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

A.3條不同的siRNA對(duì)山羊顆粒細(xì)胞中SMAD7的干擾效率；B.新設(shè)計(jì)的3條不同的siRNA對(duì)山羊顆粒細(xì)胞中SMAD7的干擾效率；C.明場(chǎng)圖像；D.熒光圖像；E.融合圖像A.The interference efficiency of 3 different siRNAs on SMAD7 in gGCs; B.The interference efficiency of 3 different siRNAs newly designed on SMAD7 in gGCs; C.The image of cells in the bright field; D. The fluorescent diagram of cells; E. Merge圖2 轉(zhuǎn)染結(jié)果圖Fig.2 Transfection result graph

2.2 SMAD7抑制山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖

利用CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖活力，結(jié)果顯示7過(guò)表達(dá)在24、36、48、72 h均顯著下調(diào)細(xì)胞增殖活力(<0.05, 圖3A)。通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示，7過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)PCNA的相對(duì)表達(dá)量(<0.01,圖3B&C)。與對(duì)照組相比siRNA-SMAD7組細(xì)胞的增殖活力在24、36、48、72 h均顯著上升(<0.05,圖3D)。如圖2E&F所示，干擾7顯著促進(jìn)了的mRNA和蛋白水平(<0.05)。這些結(jié)果表明7抑制卵巢顆粒細(xì)胞的增殖能力。

A.SMAD7過(guò)表達(dá)對(duì)山羊顆粒細(xì)胞增殖活力的影響；B&C.SMAD7過(guò)表達(dá)對(duì)增殖相關(guān)基因PCNA的影響；D.SMAD7干擾對(duì)山羊顆粒細(xì)胞增殖活力的影響；E&F.SMAD7干擾對(duì)增殖相關(guān)基因PCNA的影響A.The effect of SMAD7 overexpression on the proliferation of gGCs; B&C.The effect of SMAD7 overexpression on the proliferation-related gene PCNA; D.The effect of SMAD7 interference on the proliferation of gGCs; E&F. The effect of SMAD7 interference on the proliferation-related gene PCNA圖3 SMAD7對(duì)山羊顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effect of SMAD7 on the proliferation of gGCs

2.3 SMAD7促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)7對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示7過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡(<0.01,圖4A&B)。通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示，7過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)BCL2/BAX的比值(<0.01,圖4C&D)。與對(duì)照組相比siRNA-SMAD7對(duì)細(xì)胞凋亡水平?jīng)]有顯著的影響(>0.05,圖4E&F)。如圖4G&H所示， 干擾7顯著上調(diào)BCL2/BAX mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量比值(<0.05)。這些結(jié)果表明，7是顆粒細(xì)胞的促凋亡因子。

A&B.利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡在NC組和SMAD7過(guò)表達(dá)組間的差異；C&D.SMAD7過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BCL2/BAX的在mRNA和蛋白水平相對(duì)表達(dá)量的影響；E&F.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡在siRNA-control組和siRNA-SMAD7組間的差異；G&H.SMAD7干擾對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BCL2/BAX在mRNA和蛋白水平相對(duì)表達(dá)量的影響A&B. The difference of apoptosis detected by flow cytometry between NC group and SMAD7 overexpression group; C&D. The effect of SMAD7 overexpression on the relative expression of apoptosis-related genes BCL2/BAX at the mRNA and protein levels; E&F. The difference of apoptosis detected by flow cytometry between the siRNA-control group and the siRNA-SMAD7 group; G&H. The effect of SMAD7 interference overexpression on the relative expression of apoptosis-related genes BCL2/BAX at the mRNA and protein levels圖4 SMAD7對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡及BCL2/BAX比值的影響Fig.4 Effects of SMAD7 on granulosa cell apoptosis and BCL2/BAX ratio

2.4 SMAD7對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞類(lèi)固醇激素分泌的影響

利用ELLSA試劑盒測(cè)定顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液中類(lèi)固醇激素水平。結(jié)果表明，7過(guò)表達(dá)極顯著上調(diào)孕酮(P4)的分泌水平，同時(shí)極顯著下調(diào)雌二醇(E2)的分泌水平(<0.01,圖5A)。而干擾7極顯著下調(diào)P4分泌，同時(shí)極顯著上調(diào)E2分泌(<0.01,圖5B)。這些結(jié)果說(shuō)明7抑制顆粒細(xì)胞分泌E2，促進(jìn)P4的分泌。

A.SMAD7過(guò)表達(dá)對(duì)P4/E2的影響；B.SMAD7干擾對(duì)P4/E2的影響A. The effect of SMAD7 overexpression on P4/E2; B. The effect of SMAD7 interference on P4/E2圖5 SMAD7對(duì)山羊顆粒細(xì)胞分泌類(lèi)固醇激素的影響Fig.5 The effect of SMAD7 on the secretion of steroid hormones in gGCs

2.5 SMAD7對(duì)SMAD2、SMAD3和SMAD4表達(dá)的影響

qRT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示，7過(guò)表達(dá)顯著上調(diào)7的表達(dá)量(<0.05)，顯著下調(diào)2、3的表達(dá)量(<0.05)，而4的表達(dá)量無(wú)明顯變化(>0.05,圖6A&B)。如圖6C&D所示，干擾7顯著上調(diào)2、3的表達(dá)量(<0.05)，4的表達(dá)量則無(wú)明顯變化(>0.05)。以上結(jié)果表明，7抑制2、3蛋白的表達(dá)而不影響4的表達(dá)。

3 討 論

盡管人類(lèi)醫(yī)學(xué)的研究表明，7在調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)方面具有重要作用，但其在卵泡中的具體功能尚未闡明。本試驗(yàn)探討了7對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)7抑制卵泡顆粒細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，干擾7則會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、抑制其凋亡。進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，7抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)凋亡基因的表達(dá)、抑制抗凋亡基因2的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)與前人的報(bào)道類(lèi)似，例如，Tang等發(fā)現(xiàn)，7抑制肺癌細(xì)胞增殖。Sobral等發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)7通過(guò)27抑制環(huán)孢素(cyclosporine A, CsA)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖。Lallemand等發(fā)現(xiàn)，7促進(jìn)Mv1Lu細(xì)胞中TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及Mv1Lu與MDCK細(xì)胞中失巢凋亡和血清戒斷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Yao等發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)7通過(guò)抑制1表達(dá)中斷了TGF-β信號(hào)通路從而促進(jìn)了豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。這些證據(jù)表明，7通過(guò)控制卵泡顆粒細(xì)胞來(lái)影響卵泡閉鎖進(jìn)程。

A.NC組和SMAD7過(guò)表達(dá)組間SMAD2、SMAD3和SMAD4相對(duì)表達(dá)量在mRNA水平的差異；B.NC組和SMAD7過(guò)表達(dá)組間SMAD2、SMAD3和SMAD4相對(duì)表達(dá)量在蛋白水平的差異；C.siRNA-control組和siRNA-SMAD7組間SMAD2、SMAD3和SMAD4相對(duì)表達(dá)量在mRNA水平的差異；D.siRNA-control組和siRNA-SMAD7組間SMAD2、SMAD3和SMAD4相對(duì)表達(dá)量在蛋白水平的差異A. The difference in the relative expression of SMAD2, SMAD3 and SMAD4 at the mRNA level between the NC group and SMAD7 overexpression group; B. The difference in the relative expression of SMAD2, SMAD3 and SMAD4 at the protein level between the NC group and SMAD7 overexpression group; C. The difference in the relative expression of SMAD2, SMAD3 and SMAD4 at the mRNA level between the siRNA-control group and siRNA-SMAD7 group; D. The difference in the relative expression of SMAD2, SMAD3 and SMAD4 at the protein level between the siRNA-control group and siRNA-SMAD7 group圖6 SMAD7對(duì)SMAD2、SMAD3和SMAD4表達(dá)的影響Fig.6 Effect of SMAD7 on SMAD2, SMAD3 and SMAD4 expression

本試驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，TGFβ/SMAD信號(hào)通路中的關(guān)鍵傳導(dǎo)因子也發(fā)生變化，即7過(guò)表達(dá)后2、3的表達(dá)量降低，而4的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。利用siRNA干擾7后2、3的表達(dá)量上升，4的表達(dá)量亦是沒(méi)有明顯變化。這些結(jié)果與Kaczorowski等報(bào)道的2、3受到抑制時(shí)細(xì)胞凋亡率會(huì)上升，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡發(fā)育受阻和閉鎖的結(jié)果一致。這些結(jié)果提示，7可能是通過(guò)調(diào)控TGFβ/SMAD信號(hào)通路中2、3的表達(dá)來(lái)影響顆粒細(xì)胞的凋亡，這與其他研究者的研究報(bào)道相似。例如，Di等發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制2、3途徑可以抑制真皮乳頭細(xì)胞的增殖；Nan等發(fā)現(xiàn),ALK-SMAD2/3途徑可以誘導(dǎo)牛乳腺上細(xì)胞的凋亡。哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育，由原始卵泡向優(yōu)勢(shì)卵泡轉(zhuǎn)化過(guò)程中，顆粒細(xì)胞分泌的E2水平會(huì)迅速上升、P4水平則會(huì)急速下降，這一現(xiàn)象在人、牛和豬上都有相似的表現(xiàn)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，7過(guò)表達(dá)促進(jìn)P4分泌，抑制E2分泌。干擾7促進(jìn)E2分泌并抑制P4分泌。這可能是因?yàn)?抑制了2、3的表達(dá)，進(jìn)而影響下游類(lèi)固醇合成相關(guān)基因的表達(dá)。Nagyova等發(fā)現(xiàn)，在卵丘細(xì)胞中通過(guò)抑制劑抑制2、3信號(hào)通路可導(dǎo)致FSH刺激的孕酮生成增加；Fang等發(fā)現(xiàn)，8可以通過(guò)AKL5-SMAD3軸調(diào)控孕酮的合成。前人的發(fā)現(xiàn)與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，這些證據(jù)表明，SMAD7可能是類(lèi)固醇激素合成的調(diào)節(jié)因子，但是7是如何影響雌二醇和孕酮分泌的下游調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。綜上所述，7通過(guò)抑制2、3的表達(dá)來(lái)抑制TGFβ/SMAD信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而影響顆粒細(xì)胞的功能。

4 結(jié) 論

7抑制山羊卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，并且調(diào)節(jié)類(lèi)固醇激素的分泌，同時(shí)抑制SMAD2、SMAD3的蛋白表達(dá)，從而調(diào)控山羊卵泡的發(fā)育。